腎臟緊密連接蛋白Claudins的研究進(jìn)展

魏玥杉，叢敬

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，遼寧 沈陽(yáng)110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室）

在腎臟生理中，腎單位的上皮細(xì)胞在水和溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。跨上皮物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過(guò)跨細(xì)胞和細(xì)胞旁路途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，而細(xì)胞旁路的通透性與緊密連接（tight junction，TJ）密切相關(guān)［1］。TJ是位于上皮細(xì)胞側(cè)面最頂端的細(xì)胞連接，由跨膜蛋白、胞質(zhì)支架蛋白和信號(hào)蛋白構(gòu)成?？缒さ鞍滓蚱浼?xì)胞外結(jié)構(gòu)域伸入到細(xì)胞間，進(jìn)而影響細(xì)胞旁路溶質(zhì)運(yùn)動(dòng)，成為決定細(xì)胞旁路通透性的關(guān)鍵因素，其中Claudins是TJ中最豐富的跨膜蛋白［1］。本文就Claudins的結(jié)構(gòu)及其生理功能的研究進(jìn)展及其在健康和腎臟疾病中的作用進(jìn)行綜述。

1 Claudins的分類和結(jié)構(gòu)

Claudins的分子量為22~25 kDa，有26個(gè)（人類）或27個(gè)（嚙齒類）亞型［2］，特異性地表達(dá)在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。Claudins 1-10，-14，-15，-17和-19共享序列同源性且功能相似，常常被稱為經(jīng)典Claudins［3］。Claudins由4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、2個(gè)胞外環(huán)（ECL1和ECL2）、位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)的-N末端和-C末端以及一個(gè)短的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)折組成［4］。在同一細(xì)胞Claudins彼此相互作用形成順式二聚體，或更高的寡聚狀態(tài)，然后相鄰細(xì)胞的Claudins之間反式配對(duì)延伸，以此將Claudin寡聚體組裝成TJ鏈。冷凍蝕刻及電子顯微鏡技術(shù)顯示，TJ鏈呈線樣或條索狀，彼此連接吻合成迷路樣的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)［5］。

2 Claudins的功能

2.1 Claudins的屏障功能 Claudin-1在腎小囊壁層上皮細(xì)胞（parietal epithelial cells，PECs）的TJ中表達(dá)，PECs被認(rèn)為可以限制經(jīng)血管球過(guò)濾后的蛋白質(zhì)逃逸到腎小體周圍空間。PECs間的TJ與細(xì)胞底部的基膜一起成為尿液濾過(guò)的第二道屏障［6］。Ohse等［7］在實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)腎小球腎炎后，發(fā)現(xiàn)TJ蛋白Claudin-1、ZO-1和Occludin表達(dá)水平降低，相鄰PECs間對(duì)與白蛋白大小相似的示蹤劑的通透性增加。

幾個(gè)過(guò)表達(dá)研究將Claudin-1、-3、-5、-11、-14和-19劃分為屏障型Claudins［8-10］。但這類研究的解釋很復(fù)雜，與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同，Claudins在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)發(fā)揮屏障和孔道的作用，且所有的上皮細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)了多個(gè)內(nèi)源性的Claudins，外源性表達(dá)（或被敲除）的Claudins的功能必須疊加在這個(gè)背景上。因此，Claudins的表觀功能高度依賴于宿主細(xì)胞系的特性。

2.2 Claudins的轉(zhuǎn)運(yùn)功能 Claudins可以選擇性地增加細(xì)胞旁路的陽(yáng)離子或陰離子的通透率。相關(guān)研究已經(jīng)建立了Claudins形成的細(xì)胞旁路通道的模型，這是一類直徑為4~7?的新通道，定向垂直于組織平面，連接細(xì)胞頂?shù)變蓚?cè)區(qū)室［11］。每一段腎小管節(jié)段都相應(yīng)地表達(dá)特定的Claudins，這些Claudins賦予該節(jié)段獨(dú)特的細(xì)胞旁路通透性和選擇特性。研究表明，Claudin-4、-5、-8、-11和-14選擇性地降低陽(yáng)離子的通透性，特別是對(duì)Na+、K+、H+和NH4+的通透性［12-13］，而Claudin-2和-15則增加陽(yáng)離子的通透性［14］。

Claudin-2主要表達(dá)于近端小管，也被報(bào)道在PECs中表達(dá)［15］，對(duì)于近端小管中有效的Na+和水的重吸收以及血壓調(diào)節(jié)至關(guān)重要。Claudin-2介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)占近端小管重吸收總水量的23%~30%［16］。claudin-2基因敲除小鼠（gene knockout，KO）模型顯示，小鼠近端小管S2段的Na+、Cl-和水的跨上皮凈吸收明顯減少［17］。與野生型相比，正常飲食喂養(yǎng)的基因敲除小鼠（Cldn2-/-）體內(nèi)保持著正常的Na+穩(wěn)態(tài)，但在靜脈注射2%NaCl后Na+、Cl-的排泄量增加，這表明，在靜息狀態(tài)下，腎臟可以代償Claudin-2介導(dǎo)的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)的損失，但在應(yīng)激狀態(tài)下，這種能力是不足的［17］。Pei等［18］從維持腎臟能量效率方面探討了Claudin-2的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)作用，他們認(rèn)為細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)是上皮組織進(jìn)化的一種策略，以最大限度地提高能量效率，近端小管中細(xì)胞旁路鹽重吸收的減少可能導(dǎo)致下游小管跨細(xì)胞鹽重吸收的增加，氧消耗增加，這種額外的能量消耗會(huì)在缺血情況下引起腎小管損傷。除了Claudin-2，近端小管還可以表達(dá)Claudin-17，介導(dǎo)近端小管末段中Cl-的轉(zhuǎn)運(yùn)，在該節(jié)段Cl-的重吸收主要是由其濃度梯度驅(qū)動(dòng)，經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)［19］。

髓袢升支粗段（thick ascending limb，TAL）通過(guò)跨細(xì)胞途徑主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和Cl-，經(jīng)細(xì)胞旁路選擇性重吸收Mg2+和Ca2+，可見Claudin-3、-10、-11、-14、-16和-19表達(dá)。Claudin-10b、-14、-16、-19主要負(fù)責(zé)陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和選擇，Claudin-3則發(fā)揮屏障作用［20］。離體灌流Claudin-16-KO小鼠的TAL，TJ對(duì)包括Ca2+和Mg2+在內(nèi)的二價(jià)陽(yáng)離子選擇性嚴(yán)重受損［21］。Claudin-16和Claudin-19在極化上皮細(xì)胞中的共表達(dá)可賦予TJ顯著的陽(yáng)離子選擇性［22］?；蛲蛔儗?dǎo)致Claudin-16和Claudin-19功能喪失是家族性低鎂血癥伴高鈣尿癥和腎鈣質(zhì)沉著癥（FHHNC）的病因［23］。更為重要的是，Claudin-16和Claudin-19相互物理性作用，TJ中失去其中一個(gè)會(huì)導(dǎo)致另一個(gè)被內(nèi)吞［24］。

Claudin-4和-8是參與構(gòu)成Cl-細(xì)胞旁路的主要TJ蛋白。Claudin-4-KO小鼠顯示，尿液NaCl排泄顯著增加，動(dòng)物出現(xiàn)了低氯血癥和低血壓，這與全身細(xì)胞外液體量的減少一致［25］。Claudin-8-KO小鼠不僅在許多方面與Claudin-4-KO小鼠相似，比如鹽和液體量的腎丟失，還出現(xiàn)了更嚴(yán)重的低血壓［26］。這可能與這兩個(gè)分子之間的相互作用有關(guān)，有研究證實(shí)它們其中一個(gè)的缺失會(huì)影響另一個(gè)在TJ的定位［27］。Claudin-7也在對(duì)醛固酮敏感的遠(yuǎn)端腎單位節(jié)段表達(dá)，但很難斷定表達(dá)Claudin-7是否直接參與Cl-細(xì)胞旁路途徑，因?yàn)樵贚LC-PK1細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)和敲除表達(dá)claudin-7都會(huì)導(dǎo)致Cl-通透性降低［28］。

2.3 Claudins參與腎單位的發(fā)生發(fā)育 Claudin-1從腎單位發(fā)育的S小體期開始在PECs和腎小體內(nèi)的足細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，卻僅在成熟PECs中持續(xù)存在［7］。足細(xì)胞緊貼于腎小球毛細(xì)血管的外表面，其次級(jí)突起間的裂孔膜（SD）參與構(gòu)成濾過(guò)屏障，是形成原尿的重要結(jié)構(gòu)。在腎單位發(fā)育的逗號(hào)小體和S小體期，足細(xì)胞可能借頂端的TJ相連；隨后進(jìn)入毛細(xì)血管襻期，足細(xì)胞開始建立其特征性的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞連接處重新定位，TJ轉(zhuǎn)變?yōu)镾D。盡管二者轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不完全清楚，形態(tài)也截然不同，但SD和TJ對(duì)于離子的高度選擇性濾過(guò)卻極為相似［29］，它們都參與了對(duì)頂?shù)讟O化、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和去分化的調(diào)控［30］。Gong等［31］使用claudin-1轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在成熟足細(xì)胞中誘導(dǎo)claudin-1基因的表達(dá)，引發(fā)嚴(yán)重的蛋白尿；通過(guò)冷凍蝕刻電子顯微鏡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)SD向TJ轉(zhuǎn)變的超微結(jié)構(gòu)變化，證實(shí)Claudins和TJ在足細(xì)胞病理生理中具有重要作用，Claudins與SD組分的相互作用可能促進(jìn)SD向TJ轉(zhuǎn)變，并提出SD和TJ在發(fā)育和病理?xiàng)l件下可以互換的新概念。

3 Claudins與腎臟疾病

3.1 Claudin-10b與HELIX綜合征 人claudin-10基因位于染色體13q31-q34上，包含5個(gè)外顯子。在第1外顯子中有2個(gè)claudin-10剪接變異體，編碼2個(gè)主要Claudin-10亞型Claudin-10a和Claudin-10b［32］。2017年，三個(gè)獨(dú)立的研究小組描述了claudin-10基因雙等位基因突變的臨床表現(xiàn)，首字母縮略詞HELIX（多汗癥、電解質(zhì)紊亂、淚液過(guò)少、魚鱗病、口干癥）被用來(lái)命名這種綜合征［32-34］。所有的HELIX綜合征患者都有汗腺、唾液腺和淚腺的功能缺陷；大多數(shù)患者有血電解質(zhì)異常、高鎂血癥和（或）低鉀血癥；25%的患者有3期慢性腎病，無(wú)腎鈣質(zhì)沉著癥。TAL中claudin-10b缺失的小鼠表現(xiàn)出明顯的高鎂血癥，尿液中Mg2+的排泄分?jǐn)?shù)較低，輕度高磷血癥，輕度多尿，飲水不足時(shí)無(wú)法濃縮尿液，K+排泄分?jǐn)?shù)升高和髓質(zhì)腎鈣質(zhì)沉著癥，同時(shí)腎小球?yàn)V過(guò)率無(wú)明顯受損［35］。而敲除claudin-10b會(huì)導(dǎo)致髓質(zhì)TAL和腎鈣化病中Claudin-16和Claudin-19復(fù)合物的表達(dá)增加，即除多尿和K+排泄分?jǐn)?shù)升高之外，claudin-10b缺失引發(fā)的大多數(shù)癥狀可以通過(guò)同時(shí)敲除claudin-16得到糾正［36］?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Claudin-10b特異性增加細(xì)胞旁路對(duì)Na+的通透性。實(shí)際上，TAL、汗腺和唾液腺中Na+的細(xì)胞旁路通透性較低可能是claudin-10b突變功能喪失的主要臨床后果。在腎髓質(zhì)TAL中，50%的Na+經(jīng)細(xì)胞旁路被動(dòng)地重吸收，Na+的細(xì)胞旁路通透性下降會(huì)影響Na+的重吸收，導(dǎo)致Na+的腎丟失，細(xì)胞外液體耗竭，繼發(fā)性醛固酮增多和K+的腎丟失；較高的跨上皮電壓會(huì)提高M(jìn)g2+和Ca2+在TAL的細(xì)胞旁路重吸收［36-37］。在唾液腺和汗腺導(dǎo)管中，Cl-經(jīng)跨細(xì)胞途徑分泌，Na+沿細(xì)胞旁路途徑被動(dòng)分泌，Claudin-10b功能缺失突變可減少Na+的分泌以及唾液和汗液的形成［20］。

3.2 Claudin-16和Claudin-19與FHHNC 人類claudin-16基因位于染色體3q27上，包含5個(gè)外顯子。人類claudin-19基因位于染色體1p34.2上，也包含5個(gè)外顯子。家族性低鎂血癥伴高鈣尿癥和腎鈣質(zhì)沉著癥（FHHNC）是一種由claudin-16和claudin-19基因變異引起的常染色體隱性遺傳疾病，其特征是尿中鈣和鎂的大量流失，導(dǎo)致低鎂血癥和高鈣尿［23］?；颊哂心I鈣質(zhì)沉著癥（腎實(shí)質(zhì)內(nèi)鈣基晶體沉積）和腎功能衰竭，可能在其生命早期就發(fā)展為終末期腎?。?3］。值得注意的是，低鎂血癥也可以不出現(xiàn)［38］。此外，患者也可能患有反復(fù)尿路感染、多尿、多飲和腎結(jié)石。

Claudin-16和Claudin-19只表達(dá)在TAL，對(duì)于Ca2+和Mg2+在TAL的細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)起關(guān)鍵作用［39］。TAL能夠重吸收腎小管腔內(nèi)液體中25%~40%的Na+、50%~60%的Mg2+和30%~35%的Ca2+［40］，這種重吸收由跨上皮鹽濃度梯度產(chǎn)生的管腔正電壓驅(qū)動(dòng)［22］。Claudin-16在低阻力的LLC-PK1細(xì)胞中獨(dú)立表達(dá)時(shí)可以使細(xì)胞旁Na+通透性大幅增加，Mg2+的通透性適度增加，進(jìn)而使選擇性從陰離子選擇性轉(zhuǎn)變?yōu)檩p微的陽(yáng)離子選擇性；Claudin-19在該細(xì)胞系中的表達(dá)也消除了陰離子選擇性，但在這種情況下是通過(guò)降低Cl-的通透性來(lái)實(shí)現(xiàn)的；Claudin-16和Claudin-19的共同表達(dá)導(dǎo)致Na+和Cl-通透性的變化比它們各自單獨(dú)表達(dá)的水平更為顯著，因此表明這兩種Claudins之間存在功能協(xié)同作用［22］。利用蔗糖梯度沉淀和化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，Gong等［22］從轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和Sf9細(xì)胞中分離出穩(wěn)定的由Claudin-16和Claudin-19組成的二聚體。當(dāng)將突變引入Claudin-16和Claudin-19二聚體的任一Claudin中時(shí)，所產(chǎn)生的TJ明顯喪失其陽(yáng)離子通透性，表明Claudins相互作用在FHHNC發(fā)病中的作用機(jī)制［21］。與此假設(shè)相符，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中，claudin-16的缺失可導(dǎo)致Claudin-19從TJ處脫位，反之亦然［41］。采用RNA干擾技術(shù)分別建立了claudin-16-KO、claudin-19-KO小鼠模型則表現(xiàn)出與FHHNC相似的表型，即低鎂血癥和尿鈣排泄增加，但沒(méi)有腎鈣質(zhì)沉著和明顯的腎功能不全［41］。在體外微灌注claudin-16-KO小鼠的TAL，可見Mg2+和Ca2+通透性顯著降低，但陽(yáng)離子選擇性沒(méi)有改變，且由于小鼠血壓降低，血漿醛固酮濃度升高，NaCl的吸收可能因此受到損害［42］。Claudin-19-KO小鼠的腎臟異常和電解質(zhì)失衡尚無(wú)進(jìn)一步報(bào)道。由于Claudin-16和Claudin-19之間的相互作用，預(yù)期Claudin-19也會(huì)在claudin-16-KO小鼠的TAL中表達(dá)缺失，但Claudin-19的表達(dá)不受影響［21］。

3.3 Claudin-14與高鈣尿性腎結(jié)石 人類claudin-14基因位于染色體21q22.3上，編碼由239個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)Claudin-14。在腎臟遺傳性疾病中，并未發(fā)現(xiàn)claudin-14基因的變異體。然而，全基因組關(guān)聯(lián)研究證實(shí)claudin-14是高鈣尿性腎結(jié)石（hypercalciuric nephrolithiasis）發(fā)病的主要危險(xiǎn)基因［43］。根據(jù)全基因組標(biāo)準(zhǔn)，claudin-14基因位點(diǎn)上的同義突變與腎結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)增加和骨密度降低相關(guān)。常見的同義變異rs219780（C）純合子患者腎結(jié)石的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)計(jì)是非攜帶者的1.64倍；rs219780（C）變異也與尿Ca2+升高、血清甲狀旁腺激素和血清總CO2減少顯著相關(guān)，但與血清Ca2+水平無(wú)關(guān)［44］。claudin-14編碼突變的患者可伴有耳聾，這種表型能在claudin-14缺失小鼠中被復(fù)制［45］。

原尿中20%~25%的Ca2+在TAL通過(guò)Claudins-16和-19組成的細(xì)胞旁路被重吸收［46］。Claudin-14主要表達(dá)在TAL，可能作為TAL中二價(jià)陽(yáng)離子通透阻滯劑而發(fā)揮作用［21］。Claudin-14在各種細(xì)胞系中的過(guò)表達(dá)可降低Na+/Cl-的通透比率以及對(duì)Ca2+的通透性，如在轉(zhuǎn)染的LLC-PK1細(xì)胞中，Claudin-14通過(guò)物理作用，可降低Claudin-16的胞外陽(yáng)離子通透性［47］。另一方面，高鈣飲食可提高Claudin-14表達(dá)，其調(diào)節(jié)高度依賴于Ca2+敏感受體（Ca2+-sensing receptor，CaSR）活性的改變。實(shí)際上，任何血清Ca2+濃度的升高或使用擬鈣劑改變CaSR敏感性，都會(huì)大大增加Claudin-14的表達(dá)［48］。高鈣血癥引起的Claudin-14的表達(dá)增加可能會(huì)阻止Ca2+的細(xì)胞旁路通透，從而增加Ca2+的尿液排泄，以穩(wěn)定血清Ca2+水平［49］。

4 小結(jié)

在不斷的研究和探索中，人們對(duì)腎臟中的Claudins的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及其在腎臟生理、病理中的作用已有了較深入的認(rèn)識(shí)。但仍有較多的問(wèn)題亟待解決，如對(duì)Claudins功能和表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍不明確，而對(duì)于調(diào)控機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)有可能為離子代謝疾病的治療提供新思路。此外，Claudins在腎臟腫瘤中的作用還有待進(jìn)一步探討。