福建蜜柚炭疽病菌的生物學(xué)特性及高效防治藥劑篩選

賴寶春，姚錦愛

（1.漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 漳州 363005；2.福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物綠色防控工程研究中心，福建 福州 350013）

0 引 言

【研究意義】琯溪蜜柚（Guanxi honey pomelo）又名香拋，是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus Linn）多年生木本植物，原產(chǎn)于福建省漳州市平和縣，是我國柚類主栽良種之一，在福建省平和縣種植面積達(dá)4.3萬hm2[1]。近年來，隨著蜜柚單一的種植模式及品種抗病性減弱，使蜜柚炭疽病的發(fā)生逐年加重，嚴(yán)重影響了蜜柚的品質(zhì)和產(chǎn)量，據(jù)統(tǒng)計(jì)2016年平和縣蜜柚炭疽病發(fā)生面積達(dá)2.1萬 hm2，對當(dāng)?shù)孛坭之a(chǎn)業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失，因此蜜柚炭疽病的有效防治已迫在眉睫[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】本課題組曾對琯溪蜜柚炭疽病進(jìn)行分離鑒定，其病原菌鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），該菌是一種世界性的植物病原菌，在適宜的環(huán)境下擴(kuò)散迅速，在琯溪蜜柚的整個(gè)生長期和采后果實(shí)保鮮期均可為害[3]。目前，國內(nèi)對蜜柚炭疽病的研究主要集中在炭疽病癥狀的識別與診斷、發(fā)生規(guī)律和簡單防治措施等方面[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由膠孢炭疽菌引起的蜜柚炭疽病是蜜柚上的重要病害之一，但關(guān)于蜜柚炭疽病菌的生物學(xué)特性及高效安全殺菌劑篩選有待深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過菌絲生長和產(chǎn)孢量探明蜜柚炭疽病菌膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性，同時(shí)測定常用化學(xué)殺菌劑對該病原菌的室內(nèi)毒力，以明確該菌的生長條件及安全高效殺菌劑，為蜜柚炭疽病提供有效防治措施及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藥劑：96.5%咪鮮胺原藥（Prochloraz，咪唑類，輝豐農(nóng)化股份有限公司）、95% 苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole，三唑類，山東東泰農(nóng)化有限公司）、96%吡唑醚菌酯原藥（Pyraclostrobin，甲氧基丙烯酸酣類，江蘇耘農(nóng)化工有限公司）、98.1%多菌靈原藥（Carbendazim，苯并咪唑類，輝豐農(nóng)化股份有限公司）。

供試菌株：蜜柚炭疽病菌（C.gloeosporioides），由漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所分離、鑒定及保藏。

供試培養(yǎng)基：①馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：新鮮去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉16 g、去離子水1 000 mL；②察氏（Czapek）培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉16 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 病原菌生物學(xué)特性

1.2.1 溫度對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 參考劉行風(fēng)等的方法[5-6]，取直徑5 mm的病原菌菌餅接種于PDA平板（d=9.0 cm，下同）中央，分別置于10、15、20、25、30、35和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每處理3個(gè)重復(fù)；后用 10 mL 無菌水洗下菌落表面孢子，制成孢子懸浮液，用紐鮑爾（Neubauer）血球計(jì)數(shù)板測定孢子含量，每處理3次重復(fù)。

1.2.2 光照對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 取直徑5 mm的病原菌菌餅接種于PDA平板中央，依次置于全黑暗、全光照和12 h光照/12 h黑暗的25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6 d后測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，測定方法同1.2.1，每處理3次重復(fù)。

1.2.3 pH值對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 取直徑為 5 mm的菌餅接種于用 0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH 調(diào) 配 pH 為 4、 5、 6、 7、 8、 9、10、11的PDA平板中央，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后測定菌落直徑和產(chǎn)孢量，測定方法同1.2.1，每處理3次重復(fù)。

1.2.4 菌絲致死溫度的測定 取直徑為5 mm的菌餅置于裝有5 mL 無菌水的5 mL凍存管中，分別置于45～55 ℃的恒溫水浴鍋中，10 min后將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA平板中央，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，6 d后觀察有無菌絲生長，最終確定菌絲的致死溫度。

1.3 4種供試藥劑對蜜柚炭疽病菌的室內(nèi)毒力

采用菌絲生長速率法測定4種殺菌劑對蜜柚炭疽病菌的室內(nèi)毒力[7]。無菌條件下，在PDA培養(yǎng)基中加入咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯和多菌靈母液，將其配置成0.002、0.01、0.05、0.25、1.25 和6.25 mg·L-1的含藥培養(yǎng)基。取直徑5 mm的病原菌菌餅接種于上述含藥PDA平板中央，每處理3皿，重復(fù)3次，后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，6 d后采用十字交叉法測量每個(gè)培養(yǎng)基的菌落直徑，計(jì)算抑制率，菌絲生長抑制率/%=[（對照組菌落直徑-藥劑處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）]×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

在DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件上，計(jì)算4種殺菌劑對供試菌株的有效抑制中濃度EC50，并利用Duncan’s新復(fù)極差法對生物學(xué)特性，如溫度、光照和pH等結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生物學(xué)特性

2.1.1 溫度對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 從圖1可看出，在10～25 ℃時(shí)，菌落直徑隨溫度的升高而增加，25 ℃時(shí)菌落直徑最大，為74.66 mm，在30～40 ℃時(shí)，菌落直徑隨溫度的升高而減少。在15～30 ℃時(shí)，病原菌產(chǎn)孢量隨溫度的升高而增加，30 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，為16.53×105個(gè)·皿-1，溫度升至35 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量下降，在10 ℃和40 ℃時(shí)，病原菌無法產(chǎn)孢。結(jié)果表明，蜜柚炭疽病菌菌落生長最適溫度為25 ℃，產(chǎn)孢最適溫度為30 ℃。

2.1.2 pH值對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖2可看出，蜜柚炭疽病菌在pH為4～10時(shí)均能產(chǎn)孢和生長，在pH為4～7時(shí)，菌落直徑和產(chǎn)孢量隨溫度的升高而增加，在pH為7時(shí)菌落直徑和產(chǎn)孢量最大，分別為70.67 mm和13.33×105個(gè)·皿-1，且差異極顯著。在pH為8～10時(shí)，菌落直徑和產(chǎn)孢量隨溫度的升高而減少。結(jié)果表明，蜜柚炭疽病菌菌落生長和產(chǎn)孢的最適pH均為7。

2.1.3 光照條件對病原菌菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響由圖3可看出，在全黑暗、半光照和全光照 3種條件下，蜜柚炭疽病菌菌絲能正常生長，均能產(chǎn)孢。3個(gè)光照條件下菌絲均生長旺盛，3個(gè)處理間差異不顯著。但不同光照條件下的產(chǎn)孢量不同，全光照條件下產(chǎn)孢量最高，為11.73×105個(gè)·皿-1，顯著高于其他2個(gè)處理。結(jié)果表明，不同光照條件對蜜柚炭疽病菌菌絲生長影響不大，但光照有利于產(chǎn)孢。

2.1.4 病原菌菌絲致死溫度 蜜柚炭疽病菌菌落在45～55 ℃水浴處理10 min，再于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后進(jìn)行觀察，結(jié)果表明經(jīng)45～50 ℃水浴處理10 min的菌碟均能生長并形成新菌落，而51 ℃水浴處理10 min的菌碟不能生長并形成新菌落（圖4），表明蜜柚炭疽病菌菌絲生長的致死溫度為51 ℃、10 min。

2.2 蜜柚炭疽病防治藥劑篩選

室內(nèi)毒力測定結(jié)果（表1）表明，供試的4種殺菌劑對蜜柚炭疽病菌菌絲生長均具有不同程度的抑制作用，其中咪鮮胺的抑菌效果最好，EC50為0.017 1 mg·L-1；其次為苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯，EC50分別為 0.023 7 mg·L-1和 0.034 5 mg·L-1；多菌靈的抑菌效果最低，EC50為0.258 6 mg·L-1。結(jié)果表明，相較于多菌靈，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯可能更適用于蜜柚炭疽病的防治。而多菌靈對蜜柚炭疽病菌抑制效果較弱的原因，可能與多菌靈的長期施用，病原菌抗藥性的產(chǎn)生等原因有關(guān)。

表1 4種供試藥劑對蜜柚炭疽病的毒力Table 1 Toxicities of 4 fungicides against C.gloeosporioides

3 討論與結(jié)論

炭疽病是琯溪蜜柚生產(chǎn)中的重要病害之一，主要為害蜜柚果實(shí)、葉片、花和枝梢等部位。筆者從福建漳州琯溪蜜柚炭疽病病株中分離到的病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[1]，膠孢炭疽菌最早于1882年在意大利的柑橘上被發(fā)現(xiàn)[8]，此外還在柑橘上發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽菌C.acutatum和平頭炭疽菌C.truncatum[9-10]，說明炭疽病的致病菌具有多樣性。但是福建地區(qū)蜜柚炭疽病是否還存在其他病原菌，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大采集病樣進(jìn)行分離、鑒定。該病原菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，其菌絲生長和產(chǎn)孢量均受溫度、pH值和光照等條件的影響，產(chǎn)孢最適溫度為30 ℃，與胡永亮等[11]報(bào)道的鐵皮石斛炭疽病菌產(chǎn)孢最適溫度一致；菌落生長最適溫度為25 ℃，與李戌清等[12]報(bào)道的三葉青炭疽病原菌的最適菌絲生長溫度一致；產(chǎn)孢和菌落生長的最適pH均為7，其中菌絲生長最適pH與楊子祥等[13]的報(bào)道一致，但產(chǎn)孢量最適pH高于報(bào)道中的pH值4，存在顯著差異，這可能與寄主差異有關(guān)；光照條件對蜜柚炭疽病菌菌絲生長影響不大，與程勛東等[14]報(bào)道的結(jié)果一致，但光照利于產(chǎn)孢，黑暗抑制產(chǎn)孢。菌絲生長致死溫度為51 ℃，10 min。

化學(xué)防治是防治作物病害的主要手段，因此，防治藥劑的篩選十分關(guān)鍵，科學(xué)精準(zhǔn)用藥不僅可以提高殺菌劑的防治效果，還可以減少用藥量和用藥次數(shù)，延緩病原菌的抗藥性[15]。目前，對藥劑防控蜜柚炭疽病的研究較少。本研究測定了4種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的殺菌劑對琯溪蜜柚炭疽病菌的室內(nèi)毒力，測定結(jié)果表明供試的4種殺菌劑對蜜柚炭疽病病原菌均具有不同程度的抑制作用，其中咪鮮胺的抑菌效果最好，EC50為0.017 1 mg·L-1；其次為苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯，EC50分別為0.023 7 mg·L-1和0.034 5 mg·L-1；多菌靈的抑菌效果最低，EC50為0.258 6 mg·L-1。本試驗(yàn)測得的EC50均低于鄭金龍等[16]報(bào)道中柱花草膠孢炭疽病菌的EC50，這可能是因?yàn)榧闹鞯牟町愋詫?dǎo)致的。試驗(yàn)結(jié)果說明，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯更適用于蜜柚炭疽病的防治，多菌靈對蜜柚炭疽病病原菌抑制效果較差，可能是由于多菌靈是常見的廣譜殺菌劑，在長期的使用過程中，蜜柚炭疽病菌對其產(chǎn)生了一定的抗藥性。本研究采用菌絲生長速率法測定4種殺菌劑對蜜柚炭疽病菌的室內(nèi)毒力，但室內(nèi)環(huán)境與田間存在一定差異，后續(xù)將對藥劑的田間應(yīng)用、藥劑殘留和對非靶標(biāo)生物的影響等方面開展研究，為蜜柚炭疽病的防治藥劑的選擇提供參考，同時(shí)為合理地使用化學(xué)藥劑、延緩抗藥性的發(fā)展提供理論依據(jù)。