3種紅樹植物根際與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征

曾志浩，袁宗勝，陳雪瑩，林鴻艷，黃曉南，劉 芳

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.閩江學(xué)院地理與海洋學(xué)院，福建 福州 350108；3.福州市海洋與漁業(yè)技術(shù)中心，福建 福州 350007）

0 引言

【研究意義】紅樹林多分布在熱帶與亞熱帶地區(qū)，其生存環(huán)境特殊，兼具陸地生態(tài)與海洋生態(tài)系統(tǒng)的特征，具有保護海岸、維護生物多樣性等重要作用，被譽為“海岸衛(wèi)士”[1]。但隨著人為活動影響的加劇以及氣候變化等因素，紅樹林面積正大量減少[2]，如何對紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)進行生態(tài)保護與修復(fù)，已成為濕地研究工作的重點內(nèi)容。紅樹林蘊含的微生物資源豐富，而根際微生物已被證明在植物生長發(fā)育和防治病害過程中起到重要作用。同時土壤微生物在土壤養(yǎng)分循環(huán)、礦物質(zhì)分解等方面起到重要作用，研究它們的群落結(jié)構(gòu)對生態(tài)環(huán)境變化起到預(yù)警作用[3]。因此研究紅樹植物根際土壤微生物群落對于紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。【前人研究進展】紅樹林土壤微生物極具珍稀性[4]且多樣性高于海岸非紅樹林區(qū)[5]，已逐漸成為研究熱點。殷萌清等對不同生境下紅樹林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異進行了研究[6]；藍(lán)亦琦等[7]將紅樹林引種到淡水區(qū)域研究其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化；研究表明紅樹林生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌為微生物主要類群[8]，而聚焦于不同紅樹植物根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的研究目前較少?！颈狙芯壳腥朦c】秋茄（Kandelia candel）、白骨 壤 （Avicennia marina）、 桐 花 樹 （Aegiceras corniculatum）作為福建紅樹植物的主要優(yōu)勢樹種，其根際土壤細(xì)菌與非根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異與多樣性特征有待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選取同一生長區(qū)域內(nèi)的3種紅樹植物的根際土壤以及它們的生長區(qū)內(nèi)非根際土壤，通過Illumina高通量測序技術(shù)[9]研究紅樹植物根際土壤細(xì)菌與非根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)差異與多樣性特征。旨在了解紅樹植物根際與非根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，對進一步研究土壤細(xì)菌與紅樹植物生長發(fā)育及生態(tài)功能的關(guān)聯(lián)性具有重要意義，同時為探究紅樹植物最適生長土壤微生態(tài)環(huán)境以及通過微生物調(diào)控紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護與修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取福建省泉州灣河口濕地自然保護區(qū)內(nèi)分布在同一生長區(qū)域的秋茄、白骨壤、桐花樹等紅樹植物，分別采集其根際土壤，以及它們的生長區(qū)內(nèi)非根際土壤，4組樣本按順序編號為QQ.D、QB.D、QT.D、QCK.D，每組取3個重復(fù)，依次編號為01、02、03。

1.2 土壤樣品采集

在選定的采樣區(qū)內(nèi)，采用多點混合采樣法，采集每種紅樹植物20～40 cm的根際土壤樣本，剔除植物殘體、根系、小石塊等雜質(zhì)后，裝入無菌密封袋，置于冰盒內(nèi)，同時采集它們的生長區(qū)內(nèi)非根區(qū)采集土壤樣本，送回實驗室，-20 ℃ 條件下冷凍保藏待用。

1.3 基因組DNA提取及細(xì)菌群落組成測定

采用天根土壤基因組DNA提取試劑盒提取土壤樣本的總DNA，以提取土樣的DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA特異性引物799F （5＇-AACMGGATTAG ATA CCCKG-3＇）和 1193R (5＇-ACGTCATCCCCACC TTC C-3＇)擴增各樣本 16SrRNA 基因的 V5～V7 可變區(qū)[10]。PCR 體系：5 μL 10×Buffer；5 μL dNTPs（2 mmol·L-1）；1 μL DNA 聚合酶；引物各 1.5 μL；50 ngDNA模板；雙蒸水補足50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。隨后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行Illumina NovaSeq高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)處理后得到有效數(shù)據(jù)，隨后在97%相似水平下進行 OTUs聚類，利用RDP classifier進行OTU物種分類學(xué)注釋，并在不同物種分類水平下統(tǒng)計每個樣本的群落組成。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線和樣本等級聚類曲線；采用mothur軟件計算Alpha多樣性指數(shù)Chao 1、Shannon指數(shù)等，并采用Wilxocon秩和檢驗進行Alpha多樣性的組間差異分析；使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計算觀測物種數(shù)（Observed-OTUs）、香農(nóng)指數(shù)、Ace指數(shù)、文庫覆蓋率（Goods-coverage）以及譜系多樣性指數(shù)；使用R軟件（Version 2.15.3）繪制PCA圖；基于Greengene數(shù)據(jù)庫中 OTU的tree和 OTU上的基因信息，進行PICRUSt軟件進行16S功能預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌測序結(jié)果分析

經(jīng)高通量測序后，12個樣本共得到759 513條高質(zhì)量序列，有效序列531 818條，平均長度378 bp，樣本測序深度在0.944～0.974，且每組處理中的3個樣本之間測序結(jié)果較為一致，測序結(jié)果符合預(yù)期，較為理想。從圖1可以看出，隨著測序量的增大，各組稀釋曲線趨于平緩，接近飽和，更多的測序量只能夠產(chǎn)生少量新的OTUs[11]，說明測序數(shù)據(jù)合理，能覆蓋大部分主要細(xì)菌。

2.2 細(xì)菌群落組成分析

秋茄、白骨壤、桐花樹根際土壤樣本以及非根際土壤樣本共鑒定出細(xì)菌39門、55綱、126目、244科、511屬。由圖2-a可以看出在秋茄根際土壤樣本QQ.D、白骨壤根際土壤樣本QB.D、桐花樹根際土壤樣本QT.D和非根際土壤樣本QCK.D中有2 309種共有 OTU，各有 704、641、537和 577種特有 OTU。各組樣本中QCK.D的OTU數(shù)目最多，特有OTU數(shù)低于QQ.D和QT.D。從圖2-b可以看出，秋茄根際土壤樣本QQ.D、白骨壤根際土壤樣本QB.D、桐花樹根際土壤樣本QT.D中有2 509種共有OTU，特有OTU數(shù) QQ.D（934）＞QB.D（836）＞QT.D（713）。

由圖3可知，在門水平上，4組樣本土壤細(xì)菌主要包括變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria、芽單胞菌門 Gemmatimonadetes、酸桿菌門Acidobacteria、硝化螺旋菌門Nitrospirae、Calditrichaeota、梭桿菌門 Fusobacteria、綠彎菌門Chloroflexi。其中變形菌門占比最大，其次是擬桿菌門。4組樣本的變形菌門的相對豐度相差不大，但是非根際土樣的擬桿菌門的相對豐度低于其他3組根際土樣。秋茄根際土壤樣本QQ.D中厚壁菌門的相對豐度（5.48%）高于白骨壤根際土壤樣本QB.D（2.88%）和非根際土壤樣本QCK.D（2.91%），而桐花樹根際土壤樣本QT.D（1.52%）則較低于其他3組。非根際土壤樣本QCK.D的芽單胞菌門、放線菌門和硝化螺旋菌門的相對豐度高于其他3組樣本，秋茄根際土壤樣本QQ.D的梭桿菌門的相對豐度（1.80%）較其他3組更高。其他門的細(xì)菌豐度則相差不大。

由圖4可知，在綱水平上，4組樣本土壤細(xì)菌中占比最大的是變形菌綱，白骨壤根際土壤樣本QB.D（39.01%）和桐花樹根際土壤樣本QT.D（38.69%）的相對豐度基本一致，大于非根際土壤樣本QCK.D（32.00%），大于秋茄根際土壤樣本QQ.D（26.30%）。其次是γ-變形菌綱，白骨壤根際土壤樣本QB.D的相對豐度為16.88%，較其他3組樣本低。

由圖5可知，在目水平上，4組樣本土壤細(xì)菌主要包括脫硫桿菌目Desulfobacterales、擬桿菌目Bacteroidales、假單胞菌目Pseudomonadales、芽孢桿菌目Bacillales、脫硫單胞菌目Desulfuromonadales、黏球菌目Myxococcales、梭菌目Clostridiales、脫硫盒菌目Desulfarculales、腸桿菌目Enterobacteriales。白骨壤根際土壤樣本QB.D和桐花樹根際土壤樣本QT.D在脫硫桿菌目、擬桿菌目、脫硫盒菌目的相對豐度大于秋茄根際土壤樣本QQ.D和非根際土壤樣本QCK.D；QQ.D在假單胞菌目、芽孢桿菌目、梭菌目、腸桿菌目的相對豐度大于其他3組樣本；QCK.D在脫硫單胞菌目、黏球菌目有更高豐富度。

由圖6可知，在科水平上，4組樣本土壤細(xì)菌主要包括脫硫桿菌科Desulfobacteraceae、脫硫球莖菌科 Desulfobulbaceae、 假 單 胞 菌 科Pseudomonadaceae、伍斯氏菌科Woeseiaceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、脫硫盒菌科Desulfarculaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae。白骨壤根際土壤樣本QB.D和桐花樹根際土壤樣本QT.D在脫硫桿菌科、脫硫盒菌科的相對豐度大于秋茄根際土壤樣本QQ.D和非根際土壤樣本QCK.D，在亞硝化單胞菌科的相對豐度低于QQ.D和QCK.D。QQ.D在假單胞菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科上較其他3組更具豐富度，QT.D在脫硫球莖菌科上的豐富度高于其他3組樣本。

由圖7可知，在屬水平上，4組樣本土壤細(xì)菌主要包括Desulfatitalea、假單胞菌屬Pseudomonas、Woeseia、芽孢桿菌屬Bacillus、Desulfatiglans、脫硫疊 球 菌 屬Desulfosarcina、 泛 菌 屬Pantoea、Hypnocyclicus。秋茄根際土壤樣本QQ.D的細(xì)菌在假單胞菌（4.44%）、Hypnocyclicus（1.63%）、芽孢桿菌（1.52%）、泛菌屬（0.75%）上更具豐富度，白骨壤根際土壤樣本QB.D的細(xì)菌分布在Desulfatitalea（3.13%）較其他3組樣本更多，桐花樹根際土壤樣本QT.D的細(xì)菌分布在脫硫疊球菌屬（1.84%）較其他3組樣本更多，非根際土壤樣本QCK.D的細(xì)菌則在屬水平上與其他3組樣本比較無更高豐富度。

2.3 細(xì)菌群落Alpha多樣性分析

各組樣本基于OTU數(shù)的Alpha多樣性指數(shù)如表1所示，觀測物種數(shù)常用于近似表示實際觀測到的樣本中的OTU數(shù)；ACE指數(shù)則與觀測物種數(shù)相關(guān)聯(lián)，反映樣本菌群的豐富度[12]；譜系多樣性指數(shù)則反映樣本細(xì)菌群落的系統(tǒng)發(fā)育多樣性[13]；香農(nóng)指數(shù)表示樣本細(xì)菌群落的多樣性[11]；文庫覆蓋率coverage指數(shù)可以顯示測序的深度以及覆蓋率[14]。以上指數(shù)越大，則說明群落多樣性越高。

非根際土壤樣本QCK.D觀測到的物種數(shù)最多，其次是秋茄根際土壤樣本QQ.D和白骨壤根際土壤樣本QB.D基本一致，桐花樹根際土壤樣本QT.D觀測到的物種數(shù)最少。QCK.D在各個多樣性指數(shù)上均高于QQ.D、QB.D和QT.D，說明紅樹植物的非根際土壤細(xì)菌群落有著更高的豐富度與多樣性，這與鄭梅霞等[15]對于土壤細(xì)菌群落多樣性的研究結(jié)果一致。

2.4 細(xì)菌群落Beta多樣性分析

PCA是一種基于歐式距離的應(yīng)用方差分解，對多維數(shù)據(jù)進行降維，從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法[16]。從圖8中可以看出，白骨壤根際土壤樣本QB.D與桐花樹根際土壤樣本QT.D的其中一個樣本以及非根際土壤樣本QCK.D組與秋茄根際土壤樣本QQ.D的其中一個樣本在PCA圖中的距離較為接近，說明群落組成較接近，從總體上看，4組樣本群落組成各不相同，都可單獨聚為一類，但是QB.D與QT.D的群落組成，QQ.D與QCK.D的群落組成更為接近。

2.5 細(xì)菌功能預(yù)測

功能預(yù)測分析結(jié)果如圖9，可以看出4組樣本的根際細(xì)菌群落對應(yīng)的 COG 類目大致相同，分別為氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運、碳水化合物代謝、復(fù)制和修復(fù)、能量代謝、翻譯、輔酶和維生素代謝、細(xì)胞運動、細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程。差異COG類目如圖10，秋茄根際土壤樣本QQ.D、白骨壤根際土壤樣本QB.D、桐花樹根際土壤樣本QT.D、非根際土壤樣本QCK.D的特有COG類目分別為22、10、5、6，共有5 806 COG類目。

3 討論與結(jié)論

土壤是營養(yǎng)來源的基礎(chǔ)，其環(huán)境對紅樹植物能否存活、繁衍至關(guān)關(guān)鍵。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)對土壤質(zhì)量有著很大的影響[17]。主要表現(xiàn)在土壤微生物與紅樹植物之間的相互作用，以及在物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和能量流動上起到促進作用，不僅影響著紅樹植物的生長發(fā)育，同時還會為紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)中的其他生物提供營養(yǎng)來源與生態(tài)位[18-19]。

基于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要性，本研究對福建泉州灣河口濕地自然保護區(qū)內(nèi)分布在同一生長區(qū)的秋茄、白骨壤、桐花樹的根際土壤以及它們的非根際土壤進行Illumina高通量測序和分析，發(fā)現(xiàn)以下幾點規(guī)律。

（1）紅樹植物根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度低非根際土壤QCK.D的OTU數(shù)目大于其他3組根際土壤樣本，同時非根際土壤QCK.D的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在Alpha多樣性指數(shù)上表現(xiàn)出較3組根際土壤更高的豐富度和多樣性。造成這一特征的原因可能是植物根際通過分泌物創(chuàng)造不同的環(huán)境，而這種環(huán)境對于某些細(xì)菌有利，使得它們能夠占據(jù)競爭優(yōu)勢，從而成為優(yōu)勢種群，同時降低了細(xì)菌群落的豐富度。在鄭梅霞等[15]、殷萌清等[6]以及Srensen等[20]的研究中也發(fā)現(xiàn)了這類現(xiàn)象。

（2）不同紅樹植物對根際微生物具有選擇性4組樣本細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門分別為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和芽單胞菌門。本研究紅樹植物土壤細(xì)菌優(yōu)勢群落與Sadaf等[21]的研究結(jié)果類似。但4組土壤樣本的第一優(yōu)勢門均為變形菌門，其次是擬桿菌門，但細(xì)菌群落分布各有不同。秋茄根際土壤QQ.D在厚壁菌門、梭桿菌門有更高的豐富度，桐花樹根際土壤QT.D在變形菌門上的相對豐度高于其他3組，而白骨壤根際土壤QB.D則在擬桿菌門有一定優(yōu)勢。非根際土壤QCK.D在芽單胞菌門較3組根際土壤樣本有一定的優(yōu)勢，但擬桿菌門低于3組根際土壤樣本?？梢钥闯霾煌t樹植物對根際微生物的影響不同，具有一定選擇性，導(dǎo)致細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)各異，這與一些研究[20,22-23]的結(jié)果相似。雖然不同紅樹植物土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)各異，但本研究通過PCA分析發(fā)現(xiàn)桐花樹與白骨壤根際土壤的群落組成更為接近，而秋茄根際土壤卻與非根際土壤的細(xì)菌群落組成接近。推測白骨壤與桐花樹的根系分泌物有一定相似性，起到相同的篩選作用，該方面有待進一步研究。

（3）在濕地生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)分解與能量來源的功能菌資源豐富在4組土壤樣本中，變形菌門的相對豐度均大于60%，占據(jù)絕對主導(dǎo)地位。變形菌門多數(shù)菌屬與氮循環(huán)相關(guān)，有研究報道稱變形菌門為濕地環(huán)境第一優(yōu)勢門[24]，與本研究結(jié)果相同。但是紅樹植物不同于其他植物，土壤細(xì)菌在硝化螺旋菌門、Calditrichaeota、梭桿菌門有一定豐富度。硝化螺旋菌門多為功能菌，能夠催化亞硝酸鹽的氧化過程[25]；Calditrichaeota為新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌門，多發(fā)現(xiàn)于海洋細(xì)菌群落，目前發(fā)現(xiàn)的該門下細(xì)菌具有降解蛋白質(zhì)基質(zhì)的能力[26]；在科水平上，秋茄根際土壤樣本QQ.D在假單胞菌科、芽孢桿菌科、腸桿菌科較其他3組樣本相對豐度更高，假單胞菌能分解葡萄糖，同時與硝酸鹽還原有關(guān)；芽孢桿菌則能夠防治病蟲害、促進植物生長[27]；腸桿菌科與代謝、發(fā)酵方面功能相關(guān)，并參與還原硝酸鹽。白骨壤和桐花樹的根際土壤QB.D、QT.D則在脫硫桿菌科、脫硫球莖菌科、脫硫盒菌科這些與硫循環(huán)有關(guān)的菌群上具更高的豐富度。猜測與紅樹植物的生長過程有關(guān)，紅樹植物會從土壤中吸收硫酸根離子，并轉(zhuǎn)化為硫化物的形式累積在體內(nèi)[23]。

本研究對秋茄、白骨壤、桐花樹根際土壤以及它們的非根際土壤細(xì)菌群落組成進行了研究，比較了不同水平上的相對豐度，分析了優(yōu)勢菌群的相關(guān)作用，有助于研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對紅樹植物的生長促進作用，為紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護與修復(fù)奠定基礎(chǔ)。有關(guān)紅樹植物與土壤菌群的相互作用及其調(diào)控機制，有待進一步研究。