紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌定位及滅菌方法研究

何 龍，師尚禮，康文娟，劉旵旵，王文娟，武 蓓

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物內(nèi)生菌是一類能在植物組織中定殖、運(yùn)轉(zhuǎn)和生存，但不引起宿主植物病害癥狀的微生物[1]。研究表明，內(nèi)生菌廣泛存在于玉米(ZeamaysL.)[2]、水稻(OryzasativaL.)[3]、煙草(NicotianatabacumL.)[4]、苜蓿(MedicagosativaL.)[5]等多種植物的根、莖、葉組織和種子內(nèi)[6]。苜蓿是優(yōu)質(zhì)的豆科牧草，蛋白含量高，與根瘤菌形成根瘤后可將大氣中的無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，供給植物營養(yǎng)[7]。苜蓿-根瘤菌共生體系的固氮作用不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)在提高作物和牧草產(chǎn)量與質(zhì)量、改善生態(tài)環(huán)境和土壤肥力等方面具有重要作用[8]。但在構(gòu)建共生固氮體系的過程中，萌發(fā)的種子胚根首先接觸內(nèi)生根瘤菌，然后才能接觸到外源接種的根瘤菌，內(nèi)生根瘤菌對(duì)于外源根瘤菌接種效果產(chǎn)生干擾[9]。因此，種子內(nèi)生根瘤菌的有效滅除對(duì)外源接種根瘤菌的高效固氮及促生效應(yīng)研究具有重要意義。

在根瘤菌接種過程中，菌類污染是常見且必須高度重視的問題，其污染來源一般可分為材料帶菌、接種過程污染和生長(zhǎng)過程污染等方面[10]。接種過程和生長(zhǎng)過程中的菌類污染可以通過無菌操作來避免，但材料帶菌只能通過滅菌來消除[11]，對(duì)材料進(jìn)行滅菌處理時(shí)還要兼顧滅菌方法對(duì)種子發(fā)芽率、幼苗生長(zhǎng)和操作人員的安全等的影響[12]。目前對(duì)苜蓿種子的滅菌主要采用0.1%升汞、98%濃硫酸、10%次氯酸鈉和碘伏溶液等[12-16]其中一種或幾種溶液進(jìn)行漂洗，其中低濃度的Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性、酶失活，是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，對(duì)操作人員健康和環(huán)境安全存在很大隱患[17]；濃硫酸的強(qiáng)酸性能夠腐蝕種皮，打破柵欄組織屏障，使種殼變薄并消除珠孔等部位的堵塞物，增大種皮透性，促進(jìn)吸水萌發(fā)[18]，但處理時(shí)間較難控制易造成酸害，廢棄液存在安全隱患[19]。因此，研發(fā)高效安全的紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌滅菌處理方法是苜蓿與根瘤菌精準(zhǔn)匹配高效固氮效應(yīng)研究的必要條件。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試苜蓿種子 ‘甘農(nóng)9號(hào)’紫花苜蓿(M.sativa‘Gannong No.9’)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2培養(yǎng)基 酵母甘露瓊脂(Yeast mannitol agar，YMA)剛果紅培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、酵母粉1.0 g·L-1,K2HPO40.5 g·L-1、瓊脂15 g·L-1、0.5%剛果紅液4 mL·L-1、蒸餾水1 000 mL·L-1，pH值7.0±0.1。

1.1.3滅菌試劑 碘伏(聚乙烯吡咯烷酮碘)消毒液：有效碘含量為0.45%～0.55% W/V(德州億康消毒制品有限公司)。

氯化鈉-吐溫溶液(Sodium chloride-Tween solution，ST液)：0.9%無菌氯化鈉溶液，0.5%吐溫80(天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)。

10%次氯酸鈉溶液：購自天津市北辰方正試劑廠。

3%次氯酸鈉溶液：將濃度為10%的次氯酸鈉加入蒸餾水稀釋至3%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子滅菌

(1)種子解剖

選取籽粒飽滿、無病蟲害[20]的‘甘農(nóng)9號(hào)’種子1 200粒，其中150粒在無菌解剖鏡(MOTIC體視顯微鏡SMZ-171)下，用無菌手術(shù)刀及解剖針將種子的種皮剖開，分離為種皮、胚、子葉、子葉+胚、子葉-胚連接處5個(gè)部位放置備用。

(2)滅菌處理

DF處理：碘伏浸泡6 min→無菌水沖洗。

DS處理：碘伏浸泡5 min→無菌水沖洗→ST液浸泡1 min→無菌水沖洗。

SH3處理：3%次氯酸鈉浸泡6 min→無菌水沖洗。

SH10處理：10%次氯酸鈉浸泡6 min→無菌水沖洗。

CK處理：無菌水浸泡6 min。

1.2.2種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量測(cè)定 將挑選的種子10粒為一組，置于5個(gè)無菌三角瓶中，分別進(jìn)行DF，DS，SH3，SH10和CK處理，備用。另取種皮、胚、子葉、子葉+胚、子葉-胚連接處5個(gè)部位，處理方法同上，備用。取上述備用材料，以10粒種子或種子部位為單位，將消毒后的種子加入無菌研缽中，加2 mL無菌水充分研磨后倒入2 mL離心管中，離心(4 000 r·min-1，10 min，4℃)后，配制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5濃度稀釋液，每一濃度梯度3次重復(fù)，取上清液0.2 mL用涂抹法分別接種在YMA剛果紅固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HHWS-II-400，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)中培養(yǎng)48 h，參照霍平慧[21]的方法鑒別并記錄每個(gè)培養(yǎng)皿中的根瘤菌數(shù)，以每平板30～300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算1 mL稀釋菌液的根瘤菌數(shù)[22]，單位為個(gè)·粒-1。計(jì)算公式為：1 mL稀釋液含菌數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5。

1.2.3滅菌種子萌發(fā)能力檢測(cè) 將挑選的種子以100粒為一組，置于5個(gè)無菌三角瓶中，分別進(jìn)行DF，DS，SH3，SH10和CK處理滅菌后備用。另取500粒種子在無菌解剖鏡下，用無菌手術(shù)刀及解剖針將種子的種皮剖開，以100粒為一組，置于5個(gè)無菌三角瓶中，對(duì)去皮種子分別進(jìn)行DF，DS，SH3，SH10和CK處理滅菌。

在培養(yǎng)皿(直徑90 mm)內(nèi)放置兩層濾紙并加入2 mL蒸餾水潤濕，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)均勻放置25粒滅菌后的完整種子或去皮種子，重復(fù)4次。置于25℃、日光照12 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)一周，并記錄發(fā)芽種子數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)和幼苗長(zhǎng)，并計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

1.2.4指標(biāo)測(cè)定 種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為胚根突破種皮，長(zhǎng)出0.3 cm左右長(zhǎng)的白色種根。

幼苗長(zhǎng)度(Seedling length)(cm)=胚芽長(zhǎng)+胚根長(zhǎng)，隨機(jī)從各處理中選取10株紫花苜蓿幼苗，測(cè)量幼苗從根基部到胚芽最高部位的絕對(duì)長(zhǎng)度為胚芽長(zhǎng)；測(cè)量根基部到根尖的長(zhǎng)度為胚根長(zhǎng)。

幼苗鮮重(Fresh weight)的測(cè)定：隨機(jī)從各處理中選10株紫花苜蓿幼苗，濾紙吸干表面水分后稱其鮮重。

活力指數(shù)(Vitality index)=S×Gi(S為幼苗平均長(zhǎng)度)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并用Prism 8軟件作圖；運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD法比較分析種子部位和滅菌處理及二者交互作用對(duì)內(nèi)生根瘤菌數(shù)量的影響，及不同處理對(duì)種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對(duì)種子不同部位根瘤菌數(shù)量的影響

不同滅菌處理均降低了種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量，DS處理可全面滅除種子內(nèi)生根瘤菌。如圖1所示，所有的部位在不同滅菌處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量均顯著低于CK(P<0.05)。在4種滅菌處理間，種皮和子葉中，DF處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其余處理(P<0.05)；胚中，SH10處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量著高于其余處理(P<0.05)；子葉+胚中，SH10處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量著低于DF，SH3處理(P<0.05)；種子中，DS處理的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著低于其余處理(P<0.05)，其余部位中滅菌處理間的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量差異不顯著。

圖1 種子不同部位在不同滅菌處理后的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量

在DF，DS，SH3和CK中，子葉+胚的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他部位(P<0.05)；在DF和CK中，胚的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著低于其他部位；SH10中，種子的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量顯著高于其他部位(P<0.05)，其余處理中各部位間的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量差異不顯著。

2.2 不同滅菌處理對(duì)種子發(fā)芽能力的影響

如圖2所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。不同滅菌處理下，完整種子處理間的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異不顯著；去皮種子中，DS，SH3，SH10處理的發(fā)芽率顯著高于CK(P<0.05)，同比增長(zhǎng)124%，136%，244%，DF，DS，SH3，SH10處理的發(fā)芽勢(shì)顯著高于CK(P<0.05)，同比增長(zhǎng)163%，300%，163%，655%。同一滅菌處理中，DF，DS，SH3和CK處理下完整種子的發(fā)芽率顯著高于去皮種子(P<0.05)，同比增長(zhǎng)188%，70%，61%，288%；DF，DS，SH3和CK處理下完整種子的發(fā)芽勢(shì)顯著高于去皮種子(P<0.05)，同比增長(zhǎng)217%，109%，228%，763%。

圖2 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)

如圖3所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。不同滅菌處理下，完整種子中，DF，DS和SH10處理的活力指數(shù)顯著低于CK(P<0.05)，同比減少21.14%，15.17%，18.52%；去皮種子中，DS，SH3和SH10處理的發(fā)芽指數(shù)顯著高于CK(P<0.05)，同比增長(zhǎng)165.96%，116.20%，302.96%，SH10處理的活力指數(shù)顯著高于CK(P<0.05)，同比增長(zhǎng)77.8%。同一滅菌處理中，各處理完整種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于去皮種子(P<0.05)。

圖3 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

2.3 不同滅菌處理對(duì)幼苗長(zhǎng)度的影響

如圖4所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)和幼苗長(zhǎng)。不同滅菌處理下，完整種子處理間的胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)和幼苗長(zhǎng)差異均不顯著；去皮種子中，SH3處理的胚芽、胚根和幼苗長(zhǎng)均顯著低于CK(P<0.05)，分別同比減少50.39%，89.68%，77.98%，說明SH3滅菌處理對(duì)幼苗伸長(zhǎng)的抑制效果最明顯。同一滅菌處理中，各處理完整種子的胚芽長(zhǎng)顯著高于去皮種子(P<0.05)；DF，DS，SH3和SH10處理完整種子的胚根長(zhǎng)和幼苗長(zhǎng)顯著高于去皮種子(P<0.05)。

圖4 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)和幼苗長(zhǎng)

2.4 不同滅菌處理對(duì)幼苗生物量的影響

如圖5所示，與CK相比，各滅菌處理均不同程度影響了紫花苜蓿種子的幼苗鮮重。不同滅菌處理下，完整種子中，DF處理的幼苗鮮重顯著低于CK(P<0.05)，同比減少21.74%；去皮種子中，DF，SH3處理的幼苗鮮重顯著低于CK(P<0.05)，分別同比減少38.06%，40.20%。同一滅菌處理中，SH3處理完整種子的幼苗鮮重顯著高于去皮種子(P<0.05)，其余處理間差異不顯著。

圖5 完整種子和去皮種子在不同滅菌處理下的幼苗鮮重

3 討論

3.1 苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌分布及不同滅菌方法對(duì)種子內(nèi)生菌數(shù)量的影響

種皮、子葉、胚、子葉-胚連接處的內(nèi)生根瘤菌分別占種子內(nèi)生根瘤菌總量的23.47%，14.18%，6.11%，56.23%，與李劍峰[6]、張淑卿[23]等人的研究結(jié)果一致，即內(nèi)生根瘤菌在苜蓿種子中主要存在于種皮及其空隙處，在子葉、胚中只有少量分布，研究進(jìn)一步將內(nèi)生根瘤菌定位至子葉-胚連接處。根瘤菌可以隨苜蓿的生長(zhǎng)被運(yùn)送到營養(yǎng)器官或繁殖器官中[23]，種子作為繁殖器官是下一代新苜蓿內(nèi)生根瘤菌的重要來源，苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌可為苜蓿-根瘤菌共生體系提供物質(zhì)基礎(chǔ)[24]。在種子內(nèi)生根瘤菌滅菌，接種根瘤菌，構(gòu)建高效共生固氮體系方面，子葉-胚連接處是滅菌的靶向部位，在紫花苜蓿根瘤菌的傳代方面，子葉-胚連接處微環(huán)境適宜，是目的根瘤菌的最佳儲(chǔ)存部位，但需要進(jìn)一步利用標(biāo)記菌株進(jìn)行示蹤試驗(yàn)。

紫花苜蓿種子在不同滅菌處理下的滅菌效果不同，其中紫花苜蓿種子的內(nèi)生根瘤菌數(shù)量低于子葉+胚中的原因可能是種皮中的一些酚類化合物具有較高的抑菌活性[25]，可以抑制內(nèi)生根瘤菌的繁殖，吸水后這些酚類化合物被釋放出來降低了種子內(nèi)生根瘤菌數(shù)量。在4種滅菌方法中，DF，DS滅菌效果比SH3，SH10好的的原因可能是碘伏和次氯酸鈉的消毒原理不同，碘伏引起細(xì)菌芽孢發(fā)生腫脹、變形、凹陷或局部破核，使殼質(zhì)層與皮質(zhì)層的通透屏障破壞[26]，當(dāng)溶液與種子接觸時(shí)，能形成一層極薄的水溶性殺菌膜逐漸解聚釋放出游離碘，從而達(dá)到持續(xù)滅菌的目的[27]；次氯酸鈉通過水解形成次氯酸后又分解成新生態(tài)氧，新生態(tài)氧將菌體和病毒上的蛋白質(zhì)氧化后變性從而殺死病原微生物[28]，在相同的滅菌時(shí)間中，碘伏可持續(xù)滅菌，擁有更好的滅菌效果。DS比DF滅菌效果更好可能是吐溫-80本身具有一定的抑菌作用[29]，且ST液可提高消毒液的表面活性，增強(qiáng)消毒效果[23]，與碘伏搭配使用可以更好的達(dá)到滅菌目的。

3.2 不同滅菌方法對(duì)紫花苜蓿種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響

好的消毒方法需要滿足兩個(gè)條件：消滅種子內(nèi)生根瘤菌和減少消毒試劑對(duì)種子的傷害。從整體上看，完整種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、幼苗長(zhǎng)和幼苗鮮重明顯高于去皮種子。其原因可能是豆類植物種皮含有豐富的化合物，如黃酮、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、生物堿、類萜及類固醇等，這些化合物被種皮吸水釋放后，能調(diào)控種胚的液態(tài)、氣態(tài)微環(huán)境[30]，對(duì)種子有保護(hù)作用，能降低滅菌試劑對(duì)種子的傷害。在4種滅菌方法中，DF，DS滅菌處理的完整種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)效果好于SH3，SH10滅菌處理，其原因可能是碘伏溶液是一種含碘的表面活性劑[31]，化學(xué)成分隨載體的不同而變化[32]，可以刺激種子生長(zhǎng)。DS處理的完整種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)效果好于DF處理，其原因可能是ST液中吐溫-80可以提高細(xì)胞通透性[33]，低濃度的氯化鈉溶液可調(diào)節(jié)滲透壓，促進(jìn)種子吸水[34]，刺激發(fā)芽。在完整種子的不同滅菌處理中，種子發(fā)芽率均大于90%，除DF處理的胚芽長(zhǎng)小于CK外，其余處理的胚芽長(zhǎng)均大于CK，而所有處理胚根長(zhǎng)均小于CK，說明吐溫-80和次氯酸鈉可以抑制胚根的生長(zhǎng)，促進(jìn)胚芽的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌主要存在于子葉-胚連接處，當(dāng)前研究表明相同處理時(shí)間下四種滅菌方式的滅菌效果不同，其中碘伏與ST液的聯(lián)合滅菌效果優(yōu)于單獨(dú)使用碘伏或次氯酸鈉，紫花苜蓿種子的最佳滅菌方式為碘伏浸泡5 min→無菌水沖洗→ST液浸泡1 min→無菌水沖洗。以后可通過控制滅菌時(shí)間開展紫花苜蓿種子內(nèi)生根瘤菌滅菌效果研究，篩選最高效的滅菌方式。