2,4-表油菜素內(nèi)酯對(duì)甜高粱和青貯玉米幼苗耐澇性的影響

蘇 杭, 翟建榮, 鄧苛莉, 栗 揚(yáng), 楊建峰, 綦 才, 郭彥軍

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山東 青島266109；3.西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716)

甜高粱(SorghumsaccharatumMoench)與青貯玉米(Zeamays)是生產(chǎn)中使用較為廣泛的C4禾本科(Gramineae)飼草作物，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)良、適口性好、種植地區(qū)廣的特點(diǎn)[1-2]。然而，春播時(shí)作物將面臨干旱問(wèn)題，而夏播時(shí)(6月中下旬)，遇到短時(shí)間強(qiáng)降雨極易遭受澇害的影響,造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[3]。在水澇脅迫下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，水中可溶性氧被消耗完，植物的根系處于低氧或缺氧環(huán)境中，有氧呼吸轉(zhuǎn)換為無(wú)氧呼吸，產(chǎn)生酒精、乙酸等物質(zhì)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[4]，使細(xì)胞氣孔關(guān)閉、胞間CO2濃度和植物光合速率下降，最終導(dǎo)致植物產(chǎn)量下降[5]。為了盡早適應(yīng)淹水脅迫，植物可通過(guò)改變根系形態(tài)，調(diào)節(jié)理化指標(biāo)來(lái)提高缺氧條件下的生存能力，如促進(jìn)植株偏上性和偏下性生長(zhǎng)、不定根、通氣組織的形成[6]。此外，在水澇脅迫下，細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除之間的平衡遭到破壞，大量O2-積累使丙二醛(Malonyldialdehyde，MDA)含量增加。植物為了緩解水澇脅迫對(duì)它的毒害作用，體內(nèi)抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)活性增強(qiáng)，提高了清除活性氧自由基的能力，使膜脂過(guò)氧化降低，減少了相關(guān)代謝產(chǎn)物如MDA的積累。淹水脅迫下，植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的積累也被認(rèn)為是植物對(duì)缺氧脅迫的生理適應(yīng)[7]。一般情況下，短期水澇對(duì)植物造成的傷害較小；長(zhǎng)期水澇導(dǎo)致根部厭氧呼吸產(chǎn)生大量乙醇、乙醛等物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。因此，如何提高植物苗期的抗?jié)承砸殉蔀樯a(chǎn)中亟待解決的實(shí)際問(wèn)題。

種子引發(fā)是指控制種子緩慢吸水，使種子進(jìn)入萌動(dòng)但胚根不突破種皮的階段，然后再使種子緩慢回干的種子處理技術(shù)[8]。種子引發(fā)處理可以打破種子休眠，提升發(fā)芽速率和發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)[9]。種子引發(fā)還能提升種子在低溫、澇害、干旱、鹽堿等非生物脅迫環(huán)境中的抗逆性[10]。根據(jù)引發(fā)劑中溶質(zhì)的不同可分為無(wú)機(jī)鹽溶液引發(fā)、激素引發(fā)、營(yíng)養(yǎng)引發(fā)等。2,4-表油菜內(nèi)酯(2,4-epibrassionolide，EBR)是一種內(nèi)源性多羥基甾體植物激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)過(guò)程中有重要的作用[11]。EBR增強(qiáng)植物抗逆性的機(jī)制可能與其可以激活細(xì)胞合成自由基清除酶的能力有關(guān)。雷新慧等[12]的研究表明，使用0.1 μmol·L-1的EBR浸種12 h，顯著增加蕎麥(Fagopyrumesculentum)種子和幼苗葉片中SOD，POD，CAT活性，降低MDA含量，促進(jìn)鹽脅迫條件下蕎麥種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)。低氧脅迫下外源EBR處理顯著提高了黃瓜(Cucumissativus)幼苗SOD和APX活性，降低了O2-，H2O2及MDA含量，增強(qiáng)了植株抗低氧脅迫的能力[13]。EBR通過(guò)調(diào)節(jié)大豆(Glycinemax)植株的滲透性和關(guān)鍵酶活性調(diào)節(jié)大豆的耐鹽機(jī)制，緩解鹽脅迫帶來(lái)的傷[14]。然而，用EBR引發(fā)種子是否可以提高作物耐澇性，目前尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)用EBR引發(fā)甜高粱和青貯玉米種子，然后在苗期不同發(fā)育時(shí)期(一葉期、三葉期和五葉期)進(jìn)行淹水處理，測(cè)定植物株高、干重、生物量、丙二醛和脯氨酸含量、抗氧化酶活性等，旨在揭示種子引發(fā)提高作物抗?jié)承缘睦砘饔脵C(jī)制，為合理利用種子引發(fā)提高作物耐澇性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水淹試驗(yàn)中所用的青貯玉米種子來(lái)源于云南曲辰種業(yè)有限公司，品種為‘曲辰11’，為高淀粉玉米；甜高粱種子來(lái)源于北京克沃集團(tuán)，品種為‘牧樂(lè)8 000’，是美國(guó)培育的高產(chǎn)甜高粱品種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇大小均勻、籽粒飽滿的種子(約2 000粒)，分別用0，0.001，0.01，0.1，1和10 μmol·L-1的2，4-表油菜素內(nèi)酯(EBR)浸泡24 h。浸泡結(jié)束后取出，用蒸餾水將種子沖洗干凈，用吸水紙擦去種子表面水分后在室溫條件下自然風(fēng)干，每12 h稱重一次，直至種子重量回到引發(fā)前的原始重量備用(種子重量回到引發(fā)前的原始重量后將風(fēng)干過(guò)程中萌發(fā)的種子棄掉)。其中0 μmol·L-1EBR為水引發(fā)處理，未浸泡種子為對(duì)照處理。

種子萌發(fā)試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱(RXZ-500A)進(jìn)行。培養(yǎng)皿(12 cm×2.5 cm)底部鋪設(shè)兩層吸水濾紙，然后將種子整齊擺放于培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿擺放甜高粱種子30粒，青貯玉米25粒。培養(yǎng)皿傾斜，防止培養(yǎng)皿中的水沒過(guò)種子，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽。每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù)。環(huán)境條件為光照強(qiáng)度為10 000 lx，光/暗培養(yǎng)分別為12 h/12 h，溫度25℃/20℃晝夜交替，相對(duì)濕度為85%。每日觀察記錄種子發(fā)芽情況，一周后將萌發(fā)的幼苗取出進(jìn)行發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)量。

種子在室溫條件下于培養(yǎng)皿(底部鋪設(shè)濾紙)保濕催芽24 h，露白后播種于花盆(15 cm × 15 cm)中。每盆裝土4 kg(中性黃壤)，播種5粒。待植物生長(zhǎng)至一葉期、三葉期、五葉期，分別開始進(jìn)行淹水處理。淹水時(shí)，將花盆至于裝水培養(yǎng)盤(30 cm高)中，保持水面高于土壤表面2 cm，每日補(bǔ)水兩次。對(duì)照組土壤保持田間持水量的75%。于每日的上午7點(diǎn)和下午7點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)水。每處理設(shè)置3次重復(fù)。待連續(xù)淹水10 d后，測(cè)株高。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

1.3.1發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定 每天記錄發(fā)芽(胚根達(dá)種子長(zhǎng)度、胚芽鞘達(dá)1/2種子長(zhǎng)度)種子數(shù)，并在種子萌發(fā)第7 d，計(jì)算發(fā)芽率(發(fā)芽種子數(shù)占總種子數(shù)的百分比)；以發(fā)芽第3 d的發(fā)芽率作為發(fā)芽勢(shì)。在種子萌發(fā)第7 d，隨機(jī)選取10株幼苗，用千分尺測(cè)量其胚根長(zhǎng)度和胚芽長(zhǎng)度，幼苗于105℃殺青20 min,并在70℃條件下烘干至恒重。

1.3.2形態(tài)指標(biāo) 盆栽試驗(yàn)在淹水10 d后，用卷尺測(cè)量株高，每盆測(cè)量5株，求取平均值。將各盆植株整株取出后用自來(lái)水沖洗干凈，然后放入烘箱中，105℃殺青后，于70℃烘干至恒重(約48 h)。

1.3.3理化指標(biāo)測(cè)定 淹水10 d后，采集植株完全展開的第2片葉(從植株頂端由上往下)進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[15]測(cè)定，丙二醛(MDA)含量(以鮮質(zhì)量計(jì))采用硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定[16]；超氧化物歧化酶(SOD)活性(以鮮質(zhì)量計(jì))參照Rawat等[17]的方法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(POD)活性采用木酚法測(cè)定[18]；過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用過(guò)氧化氫法測(cè)定[19]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性測(cè)定參考Amorati[20]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù)、GraphPad Prism 9作圖，采用SPSS 23.0 進(jìn)行方差分析，Duncan方法檢驗(yàn)各處理水平在P<0.05水平的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBR引發(fā)對(duì)種子萌發(fā)特性的影響

2,4-表油菜素內(nèi)酯(EBR)引發(fā)種子顯著影響了甜高粱和青貯玉米的種子萌發(fā)性能(表1)。隨著EBR濃度從0.001 μmol·L-1增加到0.01 μmol·L-1，兩個(gè)品種胚根和胚芽長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05)，但之后隨著EBR濃度的上升，胚根、胚芽長(zhǎng)度呈下降趨勢(shì)。當(dāng)EBR濃度達(dá)到10 μmol·L-1時(shí)，除甜高粱胚根長(zhǎng)度與對(duì)照無(wú)顯著差異外，兩個(gè)品種的胚芽長(zhǎng)及玉米胚根長(zhǎng)仍大于對(duì)照(P<0.05)。引發(fā)對(duì)胚根干重整體無(wú)顯著影響，而EBR濃度1 μmol·L-1時(shí)，甜高粱胚根干重顯著低于其它處理(P<0.05)，而玉米胚根干重顯著高于其它處理(P<0.05)。胚芽干重在低濃度EBR(0.01和0.1 μmol·L-1)時(shí)顯著高于對(duì)照及其它處理(P<0.05)。引發(fā)對(duì)種子發(fā)芽率無(wú)顯著影響，提高了種子發(fā)芽勢(shì)，且EBR濃度為0.01 μmol·L-1時(shí)玉米的發(fā)芽勢(shì)均顯著高于其它處理(P<0.05)。相較于EBR引發(fā)，水引發(fā)也能促進(jìn)種子萌發(fā)，但其整體效果不如0.01 μmol·L-1EBR。

表1 2,4-表油菜素內(nèi)酯引發(fā)對(duì)甜高粱和玉米種子萌發(fā)特性的影響

2.2 水澇脅迫下種子引發(fā)對(duì)甜高粱與玉米生長(zhǎng)發(fā)育的影響

甜高粱和玉米的株高、干重均受淹水處理、種子引發(fā)、發(fā)育時(shí)期及它們交互作用的顯著影響(表2)。淹水后，兩種作物在三個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)為株高和干重顯著下降(圖1)。在未引發(fā)對(duì)照中，一葉期、三葉期和五葉期，甜高粱淹水后的株高較未淹水處理分別下降24.39%，35.16%和19.21%，干重下降14.96%，5.94%和16.91%；玉米株高下降27.35%，18.24%和13.95%，干重下降47.47%，53.33%和32.33%。EBR引發(fā)種子后，兩種作物均表現(xiàn)為株高及干重顯著上升(P<0.05)，且EBR引發(fā)效果顯著好于水。整體上，EBR引發(fā)種子后，兩種作物在一葉期和三葉期均表現(xiàn)為水澇條件下株高和干重增加幅度高于正常水分條件下株高和干重的增加幅度。對(duì)于甜高粱而言，與未引發(fā)對(duì)照比較，一葉期、三葉期和五葉期，正常水分條件下EBR引發(fā)使甜高粱株高分別增加18.29%，20.31%和13.91%，而水淹條件下分別增加29.03%，27.71%和13.93%。對(duì)于玉米而言，一葉期、三葉期和五葉期，正常水分條件下EBR引發(fā)使甜高粱株高分別增加25.64，29.05%和16.89%，而水淹條件下分別增加32.94%，41.32%和16.89%。

圖1 種子引發(fā)對(duì)淹水脅迫下甜高粱(A,B)和青貯玉米(C,D)株高和干重的影響

表2 種子引發(fā)影響水澇脅迫下甜高粱和玉米理化指標(biāo)的方差分析(F值)

2.3 水澇脅迫下種子引發(fā)對(duì)甜高粱和玉米中脯氨酸和丙二醛含量的影響

淹水后，甜高粱和玉米葉中的脯氨酸含量和丙二醛含量均上升(圖2)。而EBR引發(fā)種子后，葉片中游離脯氨酸含量較未引發(fā)對(duì)照增加幅度呈上升趨勢(shì)。如在淹水條件下，玉米一葉期、三葉期和五葉期未引發(fā)對(duì)照較正常水分條件分別增加52.43%，11.53%和42.71%，而EBR引發(fā)處理分別增加94.98%，95.78%和101.45%；甜高粱未引發(fā)對(duì)照分別增加63.99%，29.08%和18.30%，而EBR引發(fā)分別增加84.38%，66.33%和80.69%。

圖2 引發(fā)對(duì)淹水脅迫下甜高粱(A,B)和玉米(C,D)苗期脯氨酸和丙二醛含量的影響

與未引發(fā)對(duì)照比較，引發(fā)處理降低了淹水條件下甜高粱和玉米葉中的MDA含量。如玉米中，一葉期、三葉期和五葉期未引發(fā)對(duì)照MDA含量淹水后分別增加201.55%，288.67%和323.93%，而EBR引發(fā)處理后分別增加143.87%，184.26%和159.00%。在甜高粱中，一葉期、三葉期和五葉期未引發(fā)對(duì)照MDA含量淹水后分別增加294.25%，197.82%和372.51%，而EBR引發(fā)后分別增加93.92%，107.27%和150.85%。

水引發(fā)處理與未引發(fā)對(duì)照相比也提高了淹水脅迫下植株體內(nèi)的脯氨酸含量，降低了MDA含量的增加幅度，但其效果整體低于EBR引發(fā)處理。

2.4 水澇脅迫下種子引發(fā)對(duì)甜高粱和玉米抗氧化酶活性的影響

淹水后，不同時(shí)期玉米和甜高粱葉片中的SOD，POD，APX，CAT活性均呈上升趨勢(shì)(圖3)。與未引發(fā)相比，EBR引發(fā)相對(duì)增加了淹水脅迫下植物體內(nèi)各氧化酶活性，而在正常水分條件下葉片抗氧化酶活性整體無(wú)顯著變化。對(duì)甜高粱而言，水澇脅迫條件下EBR引發(fā)植株各氧化酶活性的增幅整體上大于水引發(fā)植株各氧化酶活性的增幅。對(duì)玉米而言，在水澇脅迫下EBR引發(fā)植株的SOD，CAT酶活性顯著高于水引發(fā)植株，APX活性在水引發(fā)和EBR引發(fā)間無(wú)顯著差異，五葉期EBR引發(fā)植株P(guān)OD活性顯著高于水引發(fā)處理。

圖3 種子引發(fā)對(duì)淹水脅迫下甜高粱(A，B，C，D)和青貯玉米(E，F(xiàn)，G，H)抗氧化酶活性的影響

3 討論

種子引發(fā)是一種低成本、有效的生理生化過(guò)程，能刺激種子萌發(fā)，改善植物在非生物脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。本試驗(yàn)中，EBR引發(fā)種子后，胚芽、胚根長(zhǎng)度顯著提高，說(shuō)明引發(fā)時(shí)EBR透過(guò)種皮，進(jìn)入種子，繼而影響了種子的早期萌發(fā)。但EBR的引發(fā)效果與引發(fā)濃度直接相關(guān)，當(dāng)EBR濃度為0.01 μmol·L-1時(shí)，甜高粱和玉米的胚芽和胚根長(zhǎng)均顯著高于其它濃度水平，且在高濃度時(shí)(10 μmol·L-1)最低。于此同時(shí)，EBR濃度為0.01 μmol·L-1時(shí)，胚根干重與對(duì)照無(wú)顯著差異，甜高粱胚芽干重仍然是所有濃度處理中最高的。說(shuō)明引發(fā)在促進(jìn)胚根伸長(zhǎng)的同時(shí)，使胚根變細(xì)。本試驗(yàn)中，EBR引發(fā)未顯著增加兩個(gè)品種的種子發(fā)芽率，但0.01 μmol·L-1的EBR使種子發(fā)芽勢(shì)顯著提高。這與多數(shù)研究研究一致，即引發(fā)對(duì)發(fā)芽率的改善效果低于發(fā)芽勢(shì)[22]。發(fā)芽勢(shì)提高有利于田間整齊發(fā)芽，便于苗期田間管理，提高生產(chǎn)力[23]。整體而言，0.01 μmol·L-1的EBR引發(fā)種子，對(duì)甜高粱和青貯玉米的發(fā)芽勢(shì)及胚芽、胚根長(zhǎng)發(fā)育有較為顯著的影響。

當(dāng)植物遭受水澇脅迫時(shí)，缺氧環(huán)境將影響根系的有氧呼吸與養(yǎng)分吸收[24]，最終影響生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)中，兩種作物在三個(gè)時(shí)期均表現(xiàn)為株高和干重顯著下降，其中甜高粱干重下降幅度(平均26.25%)小于玉米干重下降幅度(43.82%)。說(shuō)明淹水脅迫對(duì)兩種作物的影響不同，其中玉米較甜高粱對(duì)淹水敏感。在壩地玉米、甜高粱耐淹試驗(yàn)中，在同等淹水條件下，玉米受害程度較重，甜高粱受害程度較輕，即甜高粱的耐淹性能優(yōu)于玉米[25]。這與本試驗(yàn)在苗期的研究結(jié)果一致。因此，在作物生長(zhǎng)期存在淹水風(fēng)險(xiǎn)的地區(qū)，可優(yōu)先考慮種植甜高粱。

EBR引發(fā)種子后，兩種作物在一葉期和三葉期均表現(xiàn)為水澇條件下株高和干重增加幅度高于正常水分條件。這說(shuō)明引發(fā)提高了兩種作物對(duì)淹水脅迫的適應(yīng)能力。種子經(jīng)EBR引發(fā)后，苗期進(jìn)行水澇處理時(shí)植株體內(nèi)相關(guān)的抗氧化酶(POD，SOD，APX，CAT)活性較未引發(fā)處理顯著增加。這種變化將清除體內(nèi)因無(wú)氧呼吸產(chǎn)生的大量自由基[26]，使MDA的含量下降，減輕淹水脅迫對(duì)植物細(xì)胞膜的損害。同時(shí)，本試驗(yàn)中，EBR引發(fā)后植株體內(nèi)游離脯氨酸含量上升，說(shuō)明引發(fā)處理通過(guò)增加脯氨酸積累提高細(xì)胞的滲透壓。耐缺氧品種‘綠巴春4號(hào)’和缺氧敏感品種‘中農(nóng)8號(hào)’的幼苗在添加或不添加EBR的常氧或缺氧營(yíng)養(yǎng)液中水培8 d，EBR處理顯著提高了缺氧脅迫下的幼苗生長(zhǎng)和SOD，APX等抗氧化酶的含量[27]，這和本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。因此，EBR引發(fā)甜高粱和玉米種子，可在苗期淹水脅迫時(shí)，提高抗氧化酶活性，降低膜脂過(guò)氧化，同時(shí)合成較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸)，以維持穩(wěn)定的細(xì)胞滲透壓。EBR種子引發(fā)的甜高粱與青貯玉米比較，淹水脅迫后，甜高粱MDA含量增加幅度(三個(gè)時(shí)期分別為66%，120%和93%)低于青貯玉米(分別為143%，147%和140%)，脯氨酸含量增加幅度也表現(xiàn)出相似趨勢(shì)，說(shuō)明EBR種子引發(fā)的甜高粱在淹水后受到的脅迫較玉米輕。這與青貯玉米淹水脅迫后干重下降幅度較甜高粱大的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

0.01 μmol·L-1的EBR引發(fā)種子可提高甜高粱與青貯玉米的發(fā)芽勢(shì)，增加淹水脅迫下植株體內(nèi)的抗氧化酶活性，降低膜脂過(guò)氧化水平，同時(shí)合成較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸，適應(yīng)淹水脅迫，最終提高株高和干重。EBR種子引發(fā)后，甜高粱在淹水脅迫后積累的丙二醛和脯氨酸少于青貯玉米，干重下降幅度也低于青貯玉米，說(shuō)明甜高粱苗期耐澇性強(qiáng)于青貯玉米。在生產(chǎn)中，建議選用0.01 μmol·L-1的EBR引發(fā)甜高粱和青貯玉米種子，提高植物的耐澇性。