miR396-MsGRFs參與調(diào)控紫花苜蓿愈傷組織再生

陳筱冉，嚴(yán)建萍，仇如夢，劉燕蓉，張萬軍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是我國重要的豆科牧草，被譽為“飼料皇后”[1]，是我國廣泛栽培的優(yōu)良牧草[2]，其具有異花授粉、同源四倍體、自交不親和等特性。這些特性使得我國紫花苜蓿育種手段一直停留在以群體選擇和雜交選育為主的傳統(tǒng)育種階段[3-5]?，F(xiàn)有的高新育種技術(shù)手段如轉(zhuǎn)基因、基因編輯、分子設(shè)計育種等幾乎未進(jìn)入牧草育種領(lǐng)域，而這些技術(shù)的實施都是基于高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。因此，轉(zhuǎn)化體系的缺乏或不成熟是限制牧草分子育種的“卡脖子”技術(shù)之一[5]。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，如何刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞再生成完整可育的植株一直是植物育種者努力攻克的難題[6]。

紫花苜蓿不同基因型對愈傷組織體細(xì)胞胚的產(chǎn)生具有十分顯著的影響，有些研究者甚至認(rèn)為其產(chǎn)生的影響可以使培養(yǎng)基的差異忽略不計[6]。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿的雜合程度和胚狀體及再生苗的形成呈正相關(guān)，并且再生率高的材料用不同方式培養(yǎng)均可獲得愈傷組織，其他基因型對形成愈傷及再生條件都更加嚴(yán)格[7-9]。因此，苜蓿及多數(shù)草類植物的研究開始趨向于探索特定品種的培養(yǎng)條件。這嚴(yán)重限制了苜蓿遺傳改良中種質(zhì)資源的利用和育種進(jìn)程。

近年來，研究者鑒定了一批參與體細(xì)胞胚胎發(fā)生及形態(tài)建成的基因，如生長調(diào)控因子(GROWTH-REGULATING FACTOR，GRF)轉(zhuǎn)錄因子家族基因[6]。在多種植物中研究發(fā)現(xiàn)，異位過表達(dá)參與分生組織維持、體細(xì)胞胚胎發(fā)生或植物激素代謝的基因可克服植物再生障礙，這為體細(xì)胞再生及遺傳轉(zhuǎn)化提供了有用的工具[6]。GRF家族為植物體內(nèi)保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，其編碼的蛋白含有的QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域，分別介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-DNA的相互作用[10-12]。許多被子植物和裸子植物的GRF攜帶microRNA396(miR396)的靶位點，受miR396轉(zhuǎn)錄后剪切調(diào)控[13]。目前研究認(rèn)為，miR396-GRF通路是調(diào)控植物器官大小的重要途徑。其主要通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長，從而調(diào)控各器官的生長發(fā)育，如葉片擴張、莖和根的伸長、種子和花的形成等[14-15]。另外，植物體內(nèi)GRF蛋白與GIF輔助因子形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在體內(nèi)也與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用[16-17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)小麥GRF4-GIF1嵌合體的轉(zhuǎn)基因植物均表現(xiàn)出正常的表型，其再生效率較空載體對照高7.8倍[18]。GRF5的異位表達(dá)，在促進(jìn)各種作物物種的再生和遺傳轉(zhuǎn)化中有積極的作用[19]。而紫花苜蓿miR396-GRF通路基因信息及其對苜蓿再生的影響尚未見報道。

本研究中，我們鑒定了紫花苜蓿中含有miR396靶位點的MsGRFs基因，通過過表達(dá)MIM396基因獲得miR396降低的轉(zhuǎn)基因植株，評價轉(zhuǎn)基因植株愈傷組織的再生效率及愈傷組織中MsGRFs基因的表達(dá)量，探究miR396-MsGRFs通路調(diào)控紫花苜蓿愈傷再生的功能。本研究的實施為提高苜蓿再生效率及打破再生過程中的基因型限制提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫花苜?！熊?號’植株成熟葉片為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1MsGRFs基因查找及miR396結(jié)合位點預(yù)測 利用NCBI在線分析軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找擬南芥9個GRF蛋白的氨基酸序列，分別為AtGRF1(AT2G22840.1)，AtGRF2(AT4G37740.1)，AtGRF3(AT2G36400.1)，AtGRF4(AT3G52910.1)，AtGRF5(AT3G 13960.1)，AtGRF6(AT2G06200.1)，AtGRF7(AT5G53660.1)，AtGRF8(AT4G24150.1)，AtGRF9(AT2G45480.1)。以擬南芥AtGRFs氨基酸序列為模板，在紫花苜蓿基因庫The Alfalfa Gene Index and Expression Atlas Database(AGED，http://plantgrn.noble.org/AGED/index.jsp)中利用TBLAST在線比對，查找紫花苜蓿MsGRFs基因。利用DNAMAN6.0和MEGA5.0軟件對紫花苜蓿和擬南芥GRF蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對與進(jìn)化樹分析。利用免費RNA分析網(wǎng)站miRBase(http://www.mirbase.org/)和RegRNA 2.0(http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)對紫花苜蓿GRF基因和miR396的結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)及分化 選取兩株‘中苜1號’紫花苜蓿植株(WT49和WT1)葉片作為外植體，50%次氯酸鈉(NaClO)溶液震蕩漂洗5 min左右，無菌水沖洗5～10次。將消毒處理后的葉片置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，(25±1)℃，暗培養(yǎng)4周。將愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 2 mg·L-1+ KT 0.05 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，16 h光照/8 h黑暗，(25± 1)℃，培養(yǎng)，每2周繼代一次。分別取未分化的愈傷組織及胚性化愈傷組織為樣品，液氮速凍，用于基因表達(dá)檢測。

1.2.3基因表達(dá)量檢測 Trizol法提取愈傷組織RNA，取1 μg RNA為模板，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047，Takara)合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，應(yīng)用Starlighter SYBR Green qpcr Mix(北京啟衡星生物科技有限公司,FS-Q1002)試劑，qTOWER3G(analytik jena)儀器進(jìn)行基因表達(dá)量檢測。利用2-ΔΔCT方法[20]計算miR396和MsGRFs的表達(dá)量。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。引物信息詳見表1。

表1 基因及引物信息

1.2.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 菌液制備：將已報道的抑制miR396表達(dá)的MIM396基因[21]重組至植物表達(dá)載體pZH01中導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，潮霉素基因為篩選標(biāo)記基因。將含有目的基因的農(nóng)桿菌用YEP培養(yǎng)基(NaCl 10 g·L-1+酵母提取物5 g·L-1+胰蛋白胨10 g·L-1)搖培至OD600≈0.8。菌液3 000 r·min-1離心10 min，用重懸液(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮100 μM，pH值5.4)重懸菌液至OD600至0.5，28℃放置30 min，備用。

農(nóng)桿菌侵染：以‘中苜1號’紫花苜蓿成熟葉片為外植體，消毒處理后的葉片切為0.5×0.5 cm2左右大小，浸泡于侵染液，負(fù)壓處理10 min。然后80 r·min-1搖培浸染20 min，棄菌液。將侵染后的葉片置于含有一層無菌濾紙的共培養(yǎng)基中(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+乙酰丁香酮150 μM +瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，暗培養(yǎng)3天。

篩選培養(yǎng)及分化：將共培養(yǎng)后的植物材料置于篩選培養(yǎng)基(MS 4.43 g·L-1+蔗糖30 g·L-1+ 2,4-D 4 mg·L-1+ 6-BA 0.2 mg·L-1+特美汀200 mg·L-1+潮霉素10 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH 5.8)，光照培養(yǎng)2周。兩周后將愈傷組織置于添加有200 mg·L-1特美汀和10 mg·L-1潮霉素的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)。2周繼代一次。將胚狀體轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中(MS 2.95 g·L-1+蔗糖15 g·L-1+特美汀200 mg·L-1+潮霉素2 mg·L-1+瓊脂8 g·L-1，pH值5.8)，16 h光照/8 h黑暗，(25±1)℃培養(yǎng)，直至生長出再生植株。將再生植株移栽移栽至土壤中，置于日光溫室培養(yǎng)。

1.2.5轉(zhuǎn)基因材料鑒定 以野生型和轉(zhuǎn)基因抗性紫花苜蓿植株葉片為材料，利用CTAB法提取總DNA，以35 s_F：GAAACCTCCTCGGATTCCATT和MIM396_R：GAGGAATTCACTATAAAGAGAATCG為引物，進(jìn)行PCR檢測。Trizol法提取植株葉片總RNA。取1 μg RNA為模板，以stem-loop miR396a：GTCGTATCCAGTGCAGG-GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAG-TTC為引物，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047，Takara)合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，以miR396_F：CGGCGGTTCCACAGCTTTCTT和miR396_R：GTGCAGGGTCCGAGGT為引物，依據(jù)上述方法檢測miR396的表達(dá)量。每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.2.6再生效率比較 以野生型紫花苜蓿植株M49-5和轉(zhuǎn)基因陽性植株M17成熟葉片為外植體。消毒處理后，置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)。培養(yǎng)2周后，取葉片誘導(dǎo)的愈傷組織液氮速凍，用于基因表達(dá)檢測。培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計總外植體數(shù)量及再生出胚狀體的外植體數(shù)量，計算分化率(再生外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%)。每個材料包括2個生物學(xué)重復(fù)，應(yīng)用SAS9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsGRFs基因鑒定

以AtGRF蛋白序列為模板，在紫花苜?；蚪M數(shù)據(jù)庫同源比對獲得9個MsGRFs基因。MsGRFs和AtGRFs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)兩者具有較高的同源性(圖1A)。依據(jù)進(jìn)化關(guān)系將MsGRFs命名為：MsGRF1a(contig_6458)，MsGRF1c(contig_6458)，MsGRF1e(contig_55260)，MsGRF3a(contig_100313)，MsGRF3c(contig_20682)，MsGRF4a(contig_68482)，MsGRF5b(contig_100394)，MsGRF7a(contig_100293)，MsGRF9a(contig_106145)。對MsGRFs基因CDS序列中miR396的靶點進(jìn)行預(yù)測。發(fā)現(xiàn)6個GRF有zma-miR396c(MIMAT0010076)的靶點，另外3個則有zma-miR396 g×(MIMAT0015351)的靶點，初步確定這些MsGRFs基因為miR396靶基因(圖1B)。

2.2 MsGRFs在紫花苜蓿胚性愈傷中高表達(dá)

為了研究GRF家族基因是否參與調(diào)控紫花苜蓿愈傷組織再生，我們分別比較了兩個‘中苜1號’植株胚性愈傷組織(WT49ec和WT1ec)和非胚性愈傷組織(WT49c和WT1c)中MsGRFs的表達(dá)(圖1C和1E)。如圖1D所示，在胚性愈傷組織WT49ec中，除MsGRF3a外，其余8個MsGRFs的表達(dá)量均顯著高于WT49c。其中，MsGRF1a，MsGRF1c，MsGRF4a和MsGRF9a在WT49ec中的表達(dá)量為在WT49c中的5～7倍；MsGRF1e，MsGRF3c和MsGRF5b在WT49ec中的表達(dá)量比在WT49c中高20～80倍；在WT49ec中，MsGRF7a的表達(dá)量最高，相當(dāng)于WT49c材料中的600多倍。在WT1ec中，除MsGRF3a和MsGRF4a外，其余MsGRFs的表達(dá)量均顯著高于(約為5～20倍)其在WT1c中的表達(dá)(圖1F)。以上結(jié)果暗示，GRF家族基因可能參與調(diào)控紫花苜蓿愈傷組織胚狀體產(chǎn)生。

圖1 紫花苜蓿MsGRFs基因鑒定及表達(dá)模式分析

2.3 過表達(dá)MIM396轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的獲得

為了研究MsGRFs對紫花苜蓿愈傷再生效率的影響，我們借助Target mimicry技術(shù)降低苜蓿體內(nèi)miR396的活性(圖2A)。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將MIM396基因轉(zhuǎn)入‘中苜1號’紫花苜蓿中，經(jīng)PCR檢測獲得7個轉(zhuǎn)基因陽性株系(圖2B)。選取M49-5和M17為本研究試驗材料，qRT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株M49-5和M17葉片中miR396的含量顯著降低(圖2C)。

圖2 過表達(dá)MIM396植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿分子鑒定

2.4 過表達(dá)MIM396轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿愈傷再生率提高

為了研究miR396-MsGRF通路對紫花苜蓿愈傷再生效率的影響，我們以WT，M49-5和M17的成熟葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含2,4-D 4 mg·L-1和 6-BA 0.2 mg·L-1)中培養(yǎng)4周后，野生型植株葉片產(chǎn)生愈傷組織，但無胚狀體產(chǎn)生，MIM396轉(zhuǎn)基因株系葉片產(chǎn)生的愈傷組織直接分化產(chǎn)生胚狀體，分化率達(dá)80%以上(圖3)。以上結(jié)果表明，抑制miR396活性后可促進(jìn)愈傷組織分化，并且降低了再生過程中對細(xì)胞分裂素的需求。

圖3 野生型(WT)和MIM396過表達(dá)植株(M49-5和M17)愈傷分化率檢測

2.5 過表達(dá)MIM396紫花苜蓿愈傷中MsGRFs顯著高表達(dá)

對WT和M49-5植株成熟葉片誘導(dǎo)2周產(chǎn)生的愈傷組織中MsGRFs的表達(dá)量進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示，除MsGRF3a外，其余8個MsGRFs的表達(dá)在M49-5c中顯著高于其在WTc中的表達(dá)。其中，MsGRF3c和MsGRF5b的表達(dá)量在M49-5c中超過在WTc中200倍，可能是促進(jìn)愈傷組織再生的主要GRF基因。

圖4 野生型愈傷組織(WTc)和MIM396植株愈傷組織(M49-5c)中MsGRFs表達(dá)模式

3 討論

在植物組織培養(yǎng)過程中，調(diào)控培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的組合及含量是調(diào)控愈傷組織再生的主要方法[22]。而建立一個成功的再生體系通常需要針對外植體自身定制植物激素比例及其他影響因素條件，不僅費時費力，而且受基因型限制常導(dǎo)致無法成功[3]。紫花苜蓿具有復(fù)雜的遺傳背景，目前僅有十幾個品種對組培再生體系進(jìn)行了探索，且再生效率較低[3]。如抗逆性強的‘中苜1號’品種，再生及轉(zhuǎn)化效率不足5%[23]。近年來，人們逐漸認(rèn)識到通過對外部條件如培養(yǎng)基、外植體、菌株等的優(yōu)化已很難將苜蓿的再生效率進(jìn)行大幅度的改良。因此，亟需針對影響植物再生的內(nèi)在因素進(jìn)行調(diào)控及改良[6]。據(jù)報道，利用形態(tài)發(fā)生基因的表達(dá)是克服基因型限制再生這一障礙的有效策略[6,24]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)測的8個miR396靶MsGRFs基因在胚性愈傷中顯著上調(diào)，進(jìn)一步通過抑制紫花苜蓿中miR396表達(dá)，從而提高其靶基因MsGRFs表達(dá)，可顯著提高紫花苜蓿再生效率。

miR396-GRF通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長，調(diào)控各器官的生長發(fā)育中具有保守性功能[14-15]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的成員可以用于改進(jìn)基于器官發(fā)生或胚胎發(fā)生的遺傳轉(zhuǎn)化效率[18-19,25]。植物中GRF家族基因多為miR396的靶基因，本研究鑒定了9個含有miR396的MsGRFs基因，并且其中8個在胚性愈傷中顯著高表達(dá)。為了研究GRF家族基因在紫花苜蓿再生中的功能，我們過表達(dá)了MIM396基因，抑制了轉(zhuǎn)基因苜蓿中miR396的表達(dá)，間接提高了8個MsGRFs的表達(dá)量。組培試驗發(fā)現(xiàn)，MIM396轉(zhuǎn)基因植株葉片再生率顯著提高。在小麥中也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)抗miR396剪切的rGRFs相比過表達(dá)GRFs可進(jìn)一步提高愈傷再生效率[18]。說明miR396-GRF通路參與調(diào)控植物再生效率的功能在紫花苜蓿中具有保守性。

一般情況下，紫花苜蓿葉片誘導(dǎo)的愈傷組織通常需要在含有高水平細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生[23]。而此過程往往需要根據(jù)愈傷組織狀態(tài)多次調(diào)整激素含量，費時費力。以過表達(dá)MIM396的植株葉片為外植體，誘導(dǎo)的愈傷組織在含有較高水平生長素的培養(yǎng)基中即可分化出胚狀體，這大大縮短了再生時間。相似的是，過表達(dá)GRF4-GIF融合基因的小麥愈傷組織，在不含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中即可分化出再生芽[18]。作者推測，這可能是由于GRF-GIF復(fù)合物在促進(jìn)植物細(xì)胞增殖的能力有關(guān)[26]。

研究表明，一些發(fā)育基因的持續(xù)過表達(dá)導(dǎo)致了植物發(fā)育過程中嚴(yán)重的生長缺陷，如營養(yǎng)器官和生殖器官的異常發(fā)育和不育，如過表達(dá)AP2/ERF家族的一種轉(zhuǎn)錄因子BABY BOOM(BBM)和WUS基因等[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MIM396轉(zhuǎn)基因苜蓿雖然顯著提高了葉片愈傷再生效率，但顯著抑制了轉(zhuǎn)基因植株地上部分的生長。因此，使用這些發(fā)育基因仍然需要通過基因切除或使用誘導(dǎo)性或組織特異性啟動子等方法來限制或消除它們在植物中的持續(xù)表達(dá)[29-30]。因此，如何應(yīng)用MIM396基因使之促進(jìn)苜蓿再生的同時不影響植株生長發(fā)育仍需進(jìn)一步研究。

GRF為多基因家族，不同的GRF基因在提高植物再生效率中作用不同[18]。在小麥中含有10個GRF基因，研究者發(fā)現(xiàn)GRF4-GIF1和GRF5-GIF1融合表達(dá)后可顯著提高小麥的再生效率，其中GRF4-GIF1融合表達(dá)后愈傷的再生率最高，而GRF1和GRF9基因分別與GIF1融合表達(dá)后對小麥再生效率無顯著影響[18]。但是，在本研究中鑒定獲得的9個MsGRFs基因中，比較其在野生型胚性愈傷組織及MIM396轉(zhuǎn)基因材料愈傷組織中表達(dá)，MsGRF3c，MsGRF5b均顯著高表達(dá)，而MsGRF4a雖然也均上調(diào)，但上調(diào)倍數(shù)顯著低于MsGRF5b的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥GRF5(AtGRF5)在愈傷組織細(xì)胞中的異位表達(dá)加速了芽的形成，顯著提高了轉(zhuǎn)化效率。AtGRF5和GRF5同源物引入油菜(甘藍(lán)型油菜)、大豆和向日葵中，均顯著增加了外植體組織的遺傳轉(zhuǎn)化。過表達(dá)GRF5，AtGRF6和AtGRF9對油菜中轉(zhuǎn)基因愈傷組織細(xì)胞的增殖均有積極作用。在大豆和向日葵中，GRF5基因的過表達(dá)似乎增加了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因芽的形成。此外，兩個AtGRF5同源基因在玉米(ZeamaysL.)中的轉(zhuǎn)化顯著提高了轉(zhuǎn)化效率，并獲得了完全可育的轉(zhuǎn)基因植株[19]。因此我們推測在MIM396轉(zhuǎn)基因材料中，MsGRF3c和MsGRF5b可能是促進(jìn)紫花苜蓿再生的重要GRF基因。

4 結(jié)論

本研究在紫花苜蓿中鑒定了9個含有miR396靶位點MsGRFs基因，除MsGRF3a外，其余MsGRFs基因均顯著響應(yīng)愈傷組織胚性化。過表達(dá)MIM396基因，間接提高M(jìn)sGRFs表達(dá)，可顯著提高苜蓿葉片的再生效率和速度，消除愈傷組織再生對細(xì)胞分裂素的需求。結(jié)合靶MsGRFs在胚性與非胚性愈傷組織、MIM396轉(zhuǎn)基因及野生型愈傷組織間的表達(dá)模式，我們推測MsGRF3c和MsGRF5b可能在促進(jìn)苜蓿再生中起著重要作用?？傊?，我們明確了miR396-MsGRF通路在苜蓿再生中的重要作用，為提高苜蓿再生效率，并打破基因型對不同苜蓿品種再生的限制提供了候選基因。