神經(jīng)損傷標(biāo)志物在兒童結(jié)核性腦膜炎中的動(dòng)態(tài)變化特征及意義

石家云 王曼知 周海依 張小佛 危松青

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種常見的肺外結(jié)核，可導(dǎo)致兒童高病亡率和致殘率，是肺外結(jié)核中病情最重、危害最大、破壞性最強(qiáng)的類型，嚴(yán)重威脅兒童生命健康[1]。近年來，TBM的發(fā)病率也明顯增加，尤其在發(fā)展中國家，兒童結(jié)核病患者中TBM的發(fā)病率高達(dá)20%[2]。盡管規(guī)范和足量的化療有助于控制病情，但至今TBM病亡率仍高達(dá)30%，且幸存者中約53.9%留有永久性神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[3]。早期診斷并盡早開始治療對(duì)于TBM的治愈至關(guān)重要。然而，目前TBM早期精準(zhǔn)診斷的分子標(biāo)志物仍極為缺乏。

近年研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)組織標(biāo)志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、S100B、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在感染、創(chuàng)傷、中風(fēng)、出血、神經(jīng)退行性疾病等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可作為疾病診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物，其血清及腦脊液濃度與患者腦損傷的程度及患者的不良預(yù)后呈明顯正相關(guān)，且與疾病的病理改變一致[4-6]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的研究中，這些分子標(biāo)志物目前主要應(yīng)用于病毒性腦炎和化膿性腦膜炎，而其在TBM中的潛在應(yīng)用價(jià)值尚缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。因此，筆者探討NSE、S100B、GFAP在結(jié)核性腦膜炎患兒血清及腦脊液的變化及對(duì)患兒預(yù)后的影響，為臨床早期診斷和評(píng)估TBM的腦損傷嚴(yán)重程度及預(yù)后提供新的量化指標(biāo)。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象遴選

1.研究對(duì)象：采用前瞻性研究方法，連續(xù)納入2018年1月1日至2021年12月31日于南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院兒童結(jié)核科收治的72例TBM患兒作為TBM組。搜集同期住院，診斷為肺結(jié)核同時(shí)排除TBM的患兒20例作為肺結(jié)核組。對(duì)照組為入院時(shí)反復(fù)高熱，伴或不伴頭痛和嘔吐，精神欠佳等疑似腦膜炎癥狀患兒。所有研究對(duì)象均進(jìn)行血液、腦脊液、頭顱CT掃描和MRI檢查。本研究獲得南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(2019-S0129)，獲得所有研究對(duì)象父母或其他監(jiān)護(hù)人的知情同意。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)TBM組：①符合TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②臨床資料完整，依從性好；③經(jīng)知情同意，并簽署知情同意書。(2)肺結(jié)核組：①符合肺結(jié)核診斷[8]；②臨床資料完整。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)TBM組：①復(fù)治的TBM患者；②入院前已行抗結(jié)核治療；③無法排除其他原因的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；④耐藥TBM。(2)肺結(jié)核組：①合并TBM患者；②入院前已行抗結(jié)核治療。

二、資料收集

通過查閱病歷資料，收集研究對(duì)象和對(duì)照組的臨床信息，包括性別、年齡、治療、預(yù)后；對(duì)照組入院后48 h內(nèi)的血清及腦脊液NSE、S100B、GFAP濃度值；TBM組入院后48 h內(nèi)及治療后1、2、3周的血清及腦脊液NSE、S100B、GFAP濃度值。

三、治療與預(yù)后

1.TBM組：參照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)指南推薦[9]，采用標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療方案，即：2H-R-Z-E/10H-R(H：異煙肼，10～20 mg·kg-1·d-1， 最大劑量500 mg；R：利福平，10～20 mg·kg-1·d-1，最大劑量600 mg；Z：吡嗪酰胺，30～35 mg·kg-1·d-1，最大劑量 2000 mg；E：乙胺丁醇，15～20 mg·kg-1·d-1，最大劑量1000 mg；異煙肼、利福平、乙胺丁醇給藥頻率均為1次/d；吡嗪酰胺給藥頻率為2次/d)。同時(shí)，給予糖皮質(zhì)激素輔助治療(2 mg/kg，最大劑量60 mg，6～8周逐漸減停)。個(gè)別患兒因病情嚴(yán)重、合并感染、繼發(fā)肝功能受損等，加用利奈唑胺或氟喹諾酮類藥物。正規(guī)抗結(jié)核治療6個(gè)月后，急性癥狀及體征減少或消失，處于疾病后遺癥期，國內(nèi)外學(xué)者常以6個(gè)月為時(shí)間節(jié)點(diǎn)研究及判斷預(yù)后[10-11]。治療6個(gè)月后，門診或電話隨訪患兒，參照Thee等[11]的標(biāo)準(zhǔn)，分為完全康復(fù)組(無神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥)和預(yù)后不良組(出現(xiàn)以下任一項(xiàng)：肢體癱瘓，痙攣，顱神經(jīng)麻痹，癲癇，發(fā)育遲緩，慢性腦積水，視力、聽力及語言障礙，植物人，死亡)。

2. 肺結(jié)核組：兒童涂片陰性藥物敏感肺結(jié)核患者采用2H-R-Z/4H-R治療方案，涂片陽性、肺廣泛實(shí)變者采用2H-R-Z-E/4H-R治療方案[12]，即強(qiáng)化期常規(guī)異煙肼(10 mg·kg-1·d-1，最大劑量300 mg，1次/d)、利福平(15 mg·kg-1·d-1，最大劑量600 mg，1次/d)、吡嗪酰胺(35 mg·kg-1·d-1，2次/d)和(或)乙胺丁醇(20 mg·kg-1·d-1，1次/d)，治療2個(gè)月，鞏固期采用異煙肼和利福平治療4個(gè)月。

四、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

TBM組于入院48 h內(nèi)及治療后1、2、3周收集4 ml外周靜脈血及2 ml腦脊液。肺結(jié)核組于入院48 h內(nèi)收集4 ml外周靜脈血及2 ml腦脊液。收集的血液標(biāo)本置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，4 ℃，3000 r/min(離心半徑10 cm)，離心10 min，取上清液置于-80 ℃保存?zhèn)溆?；腦脊液標(biāo)本標(biāo)記好置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定TBM組及肺結(jié)核組入院48 h內(nèi)血清及腦脊液中NSE、S100B、GFAP的含量；測(cè)定TBM組治療后1、2、3周NSE、S100B、GFAP的動(dòng)態(tài)變化情況。酶標(biāo)檢測(cè)儀購自美國BioTeK公司(型號(hào)Epoch)；檢測(cè)試劑均購自美國R&D公司，NSE、S100B、GFAP檢測(cè)試劑貨號(hào)分別為DY2062、DY1820、DY2594，批次分別為P184753、P186491、P185817。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析，偏態(tài)分布的計(jì)量資料用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述，組間差異的比較采用秩和檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及曲線下面積(area under the curve，AUC)分析TBM患兒入院時(shí)腦脊液NSE、S100B、GFAP水平，預(yù)測(cè)其不良預(yù)后的閾值、敏感度及特異度。

結(jié) 果

一、基本情況

TBM組72例，其中，男38例(52.8%)，女34例(47.2%)；年齡[M(Q1，Q3)]為59(1，168)月；年齡分組參照Rohlwink 等[13]標(biāo)準(zhǔn)：0～2歲35例(48.6%)，3～5歲7例(9.7%)，>5歲30例(41.7%)。肺結(jié)核組20例，其中，男12例(60.0%)，女8例(40.0%)；年齡[M(Q1，Q3)]為73(4，168)月； 0～2歲8例(40.0%)，3～5歲3例(15.0%)，>5歲9例(45.0%)。TBM組與肺結(jié)核組年齡及性別分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z值分別為-1.243和-0.860，P值分別為0.217和0.390)。

TBM組中47例(65.3%)完全康復(fù)，25例(34.7%)預(yù)后不良(肢體癱瘓6例，繼發(fā)癲癇8例，慢性腦積水2例，動(dòng)眼神經(jīng)麻痹2例，語言障礙1例，死亡6例)。

二、神經(jīng)組織標(biāo)志物水平比較

1.治療前情況比較：NSE、S100B、GFAP在TBM組及肺結(jié)核組入院時(shí)血清及腦脊液的表達(dá)比較顯示，與肺結(jié)核組相比，TBM組血清及腦脊液的NSE、S100B、GFAP表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。與完全康復(fù)組比較，預(yù)后不良組血清NSE、S100B、GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z值分別為-0.604、-0.728、-1.049，P值分別為0.513、0.467、0.071)；而腦脊液NSE、S100B、GFAP表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z值分別為-4.855、-3.212、-6.334，P值分別為0.000、0.001、0.000)。

表1 結(jié)核性腦膜炎患兒與肺結(jié)核患兒治療前神經(jīng)組織標(biāo)志物水平的比較 [μg/L,M(Q1，Q3)]

2.治療后動(dòng)態(tài)變化情況：比較NSE、S100B、GFAP在完全康復(fù)組和預(yù)后不良組治療后1、2、3周的動(dòng)態(tài)變化。(1)經(jīng)治療后1周，完全康復(fù)組和預(yù)后不良組血清NSE、S100B、GFAP降至基本正常；治療后1、2、3周NSE、S100B、GFAP組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與完全康復(fù)組比較，預(yù)后不良組治療后1、2、3周血清NSE、S100B、GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。(2)完全康復(fù)組與預(yù)后不良組腦脊液NSE、S100B、GFAP表達(dá)在治療后1、2、3周比較，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與完全康復(fù)組比較，預(yù)后不良組腦脊液NSE、S100B、GFAP在治療后1、2、3周表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表2 血清中神經(jīng)組織標(biāo)志物水平在不同治療預(yù)后結(jié)核性腦膜炎患兒中的比較 [μg/L，M(Q1，Q3)]

表3 腦脊液中神經(jīng)組織標(biāo)志物水平在不同治療預(yù)后結(jié)核性腦膜炎患兒中的比較 [μg/L，M(Q1，Q3)]

三、神經(jīng)組織標(biāo)志物對(duì)TBM預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析顯示，TBM患兒入院時(shí)腦脊液NSE、S100B、GFAP預(yù)測(cè)TBM預(yù)后不良的AUC分別為0.753(95%CI：0.637～0.868，P<0.01)、0.879(95%CI：0.759～0.963，P<0.01)、0.803(95%CI：0.702～0.904，P<0.01)。依據(jù)ROC曲線，分別以其最大約登指數(shù)確定3種生物標(biāo)志物的檢測(cè)閾值，可知NSE水平為51.92 μg/L時(shí)，預(yù)測(cè)TBM預(yù)后不良的敏感度為76.24%、特異度為78.95%。S100B水平為2.75 μg/L時(shí)，預(yù)測(cè)TBM預(yù)后不良的敏感度為85.7%、特異度為96.5%。GFAP水平為77.54 μg/L時(shí)，預(yù)測(cè)TBM預(yù)后不良的敏感度為76.43%、特異度為70.97%(圖1)。

圖1 腦脊液神經(jīng)組織標(biāo)志物預(yù)測(cè)結(jié)核性腦膜炎患兒預(yù)后不良的受試者工作特征曲線

討 論

盡管近年來兒童TBM診治取得一定進(jìn)展，但由于兒童TBM早期癥狀錯(cuò)綜復(fù)雜，缺乏敏感度高、特異度好的精準(zhǔn)分子生物學(xué)檢測(cè)手段，早期診斷困難，病情易被延誤，以致錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)；雖經(jīng)積極抗結(jié)核和抗炎治療，但仍有較高病亡率或遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[3]。因此，早期診斷、盡早進(jìn)行臨床干預(yù)、及時(shí)恰當(dāng)評(píng)估預(yù)后是降低兒童TBM病亡率和致殘率的關(guān)鍵。

近年來，越來越多的學(xué)者關(guān)注神經(jīng)組織損傷標(biāo)志物，它們可以反映神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度，將臨床和影像學(xué)資料難以量化的損傷進(jìn)行定量分析，能更早提示神經(jīng)損傷。NSE是1965年首次被發(fā)現(xiàn)于腦組織中而不存在于非神經(jīng)組織中的酸性可溶性蛋白，是中樞神經(jīng)元損傷的敏感和特異標(biāo)志[14]。S100B被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白，在哺乳動(dòng)物分布具有特異性，主要分布于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及施萬細(xì)胞，也可反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的程度[15]。GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中獨(dú)有的細(xì)胞骨架蛋白，是星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要成分。星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦的發(fā)育和正常功能中起到重要作用[16]。DeKosky等[17]研究發(fā)現(xiàn)，GFAP在新型冠狀病毒肺炎患者腦損傷檢測(cè)中有明確的預(yù)測(cè)價(jià)值。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、創(chuàng)傷或炎癥后，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和死亡增多，NSE、S100B、GFAP從受損和死亡的細(xì)胞中溢出，進(jìn)入細(xì)胞間隙，可通過血腦屏障進(jìn)入血液中，使腦脊液及血液中NSE、S100B、GFAP表達(dá)增加，可作為定性和定量評(píng)價(jià)腦損傷的特異指標(biāo)。

本研究尚存在一定局限性：(1)樣本量小，有少部分臨床數(shù)據(jù)缺失(死亡病例后期血清及腦脊液缺失)；(2)無其他顱內(nèi)感染性疾病患者的橫向?qū)Ρ?，可能?duì)分析結(jié)果造成一定偏倚。因此，NSE、S100B、GFAP對(duì)TBM診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值尚需進(jìn)行大樣本和多中心的研究。

綜上，本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患兒血清和腦脊液NSE、S100B、GFAP水平增加時(shí)，可疑診TBM，應(yīng)積極完善頭顱影像學(xué)及腦脊液結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢查，以盡早進(jìn)行干預(yù)治療。TBM患兒入院時(shí)NSE≥51.92 μg/L、S100B≥2.75 μg/L或GFAP≥77.54 μg/L，且經(jīng)治療腦脊液NSE、S100B、GFAP水平下降緩慢時(shí)，提示預(yù)后不良的可能，應(yīng)盡早進(jìn)行臨床干預(yù)，降低病亡率和致殘率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)石家云：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱；王曼知：獲取研究經(jīng)費(fèi)、指導(dǎo)；周海依和張小佛：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱、支持性貢獻(xiàn)；危松青：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、采集數(shù)據(jù)、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn)