非編碼RNA在結(jié)核病中的研究進(jìn)展

朱銀銀 張洪英

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)導(dǎo)致的嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染性疾病。MTB在與宿主共生存千年后已經(jīng)產(chǎn)生一套完美的免疫逃避機(jī)制[1]，加之在抗生素廣泛應(yīng)用的壓力下迅速產(chǎn)生的新耐藥突變，以及新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)大流行和艾滋病蔓延等各種情況的影響，結(jié)核病的防控形勢(shì)已越發(fā)嚴(yán)峻，亟需開(kāi)發(fā)新的診斷與治療方法。

人體感染病毒或細(xì)菌后會(huì)自發(fā)開(kāi)啟有效的免疫防御系統(tǒng)。既往關(guān)于免疫系統(tǒng)的研究多集中于蛋白質(zhì)及其免疫特性，然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA) 也是參與人體免疫防御環(huán)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[2]，其通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體中相關(guān)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控宿主抵御病毒或細(xì)菌的感染。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量的ncRNA在不同物種的不同生物學(xué)過(guò)程中不斷地被發(fā)現(xiàn)。越來(lái)越多的研究表明，ncRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控宿主基因表達(dá)，這與MTB適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境及產(chǎn)生致病性有緊密聯(lián)系。ncRNA可根據(jù)其長(zhǎng)度分為小于200 nt的小ncRNA[如微小RNA(microRNA，miRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)]和大于200 nt的長(zhǎng)ncRNA(long noncoding RNA，lncRNA)[3]。這些ncRNA在MTB感染人體的過(guò)程中，不僅在它們之間相互作用，也會(huì)與其他蛋白、DNA等相互作用，從而影響結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展。筆者現(xiàn)從lncRNA、miRNA 和circRNA三個(gè)角度闡述人體與MTB相互作用過(guò)程中ncRNA的研究現(xiàn)狀，以及MTB在宿主細(xì)胞中的存活機(jī)制及致病機(jī)理，為進(jìn)一步研究ncRNA在結(jié)核病診斷及治療方面的應(yīng)用及研發(fā)新型疫苗和藥物診斷方法等提供依據(jù)。

一、lncRNA

ncRNA中大約有80%為lncRNA[4]，由于其缺少完整的閱讀編碼框而不編碼蛋白質(zhì)，曾一度被認(rèn)為是基因表達(dá)過(guò)程中產(chǎn)生的“垃圾”，但后續(xù)研究表明，ncRNA不僅不是“垃圾”，反而在不同表達(dá)水平上影響著各種生物進(jìn)程[5]。根據(jù)lncRNA對(duì)DNA序列的影響將其分成可調(diào)節(jié)緊密連接基因表達(dá)的順式lncRNA和可調(diào)節(jié)遠(yuǎn)距離基因表達(dá)的反式lncRNA[6]。越來(lái)越多的研究表明，lncRNA參與癌癥和心血管等疾病的發(fā)生發(fā)展[7-8]，也參與宿主對(duì)侵襲性病原體的免疫應(yīng)答[9]，可從分子水平、細(xì)胞水平調(diào)控多種生物學(xué)活動(dòng)[10-11]。

對(duì)lncRNA的研究為機(jī)體對(duì)MTB的免疫反應(yīng)研究提供了一個(gè)新的方向。有證據(jù)表明，結(jié)核病患者中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA信號(hào)軸調(diào)控巨噬細(xì)胞的自噬和凋亡來(lái)影響MTB的免疫應(yīng)答[12]。例如，lncRNA HOTAIR下調(diào)表達(dá)后有利于特異性AT-rich序列結(jié)合蛋白1(special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1)和雙特異性MAP激酶磷酸酶4(dual specificity MAP kinase phosphatase 4，DUSP4)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而促進(jìn)強(qiáng)毒性MTB的生存[13]。Chen等[14]通過(guò)基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了結(jié)核病患者中有163個(gè)上調(diào)和348個(gè)下調(diào)的lncRNA，其中NR-038221、NR-003142、ENST00000570366和ENST00000422183均被qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證具有差異表達(dá)，且這4種lncRNA聯(lián)合診斷結(jié)核病的敏感度為79.2%，特異度為75%。另有研究利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)lnc-TGS1-1和lnc-AC145676.2.1-6在健康者和結(jié)核病患者中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩種lncRNA在結(jié)核病患者中的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，且lnc-TGS1-1在抗結(jié)核治療期間的較低表達(dá)與患者中血小板減少癥的發(fā)生存在相關(guān)性，這提示lnc-TGS1-1表達(dá)水平的降低有促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染發(fā)病的相關(guān)作用，可作為抗結(jié)核藥物治療不良反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，但還需要更大規(guī)模不同人群的研究證實(shí)[15]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，其作為關(guān)鍵調(diào)控因子在lncRNA中發(fā)揮著重要作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，與抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)相關(guān)的lncRNA AC079767.4上的SNPrs1055229和rs12477677可能會(huì)影響肺結(jié)核臨床表現(xiàn)，提示該lncRNA的遺傳變異可能是有前途的生物標(biāo)志物，可能有助于結(jié)核病診治相關(guān)技術(shù)的發(fā)展[17]。

巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)的源頭，是阻抗病原體入侵人體的第一道防線。MTB是一類胞內(nèi)寄生菌，主要寄生于感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此機(jī)體的抗結(jié)核免疫主要依賴于細(xì)胞免疫。宿主lncRNA的表達(dá)被MTB改變以逃避宿主免疫反應(yīng)[13]。田若男[18]研究發(fā)現(xiàn)，由基因反義鏈轉(zhuǎn)錄而成的長(zhǎng)非編碼反義RNA JHDM1D-AS1 (lncRNA JHDM1D antisense 1) 可能通過(guò)吸附miR-766-3p來(lái)調(diào)控靶基因OASL(oligoadenylate synthetase like)參與多重信號(hào)通路，促進(jìn)MTB感染巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6，這為結(jié)核病提供了新的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。Li等[19]發(fā)現(xiàn)基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA環(huán)氧化酶2(long intergenic non-coding RNA cyclooxygenase 2, lincRNA Cox2)在MTB感染的巨噬細(xì)胞中明顯高表達(dá)，lncRNA Cox2下調(diào)后可降低炎癥調(diào)節(jié)蛋白核轉(zhuǎn)錄因子kB(nuclear factor kappa B, NF-kB) 和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)感染巨噬細(xì)胞的凋亡。lncRNA還可發(fā)揮海綿樣作用，通過(guò)結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)，從而作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)來(lái)調(diào)控一系列的生物過(guò)程[20]。LncRNA母系表達(dá)基因3 (maternally expressed gene 3，MEG3) 在肺結(jié)核患者中高表達(dá)，通過(guò)建立MTB感染巨噬細(xì)胞模型后發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA MEG3的表達(dá)后，miR-145-5p的表達(dá)增加，同時(shí)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)和凋亡能力減弱[21]。與此類似，lncRNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(myocardial infarction associated transcript，MIAT)也可通過(guò)miR-665/ULK1信號(hào)軸調(diào)控MTB感染巨噬細(xì)胞的自噬和凋亡[12]。

機(jī)體內(nèi)的各類T細(xì)胞和B細(xì)胞也參與了MTB的清除過(guò)程。有研究報(bào)道，在結(jié)核病患者的T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有1113個(gè)lncRNA表達(dá)失調(diào)[22]，在B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有884個(gè)lncRNA表達(dá)失調(diào)[23]。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)lncRNA CD224可以通過(guò)阻斷CD224信號(hào)通路促進(jìn)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)，提高了CD8+T細(xì)胞的保護(hù)性免疫能力。lncRNA是免疫細(xì)胞反應(yīng)和宿主-病原體相互作用的重要調(diào)控因子。不同表達(dá)模式的lncRNA通過(guò)多種機(jī)制影響T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，從而在調(diào)節(jié)宿主對(duì)MTB的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。然而，我們對(duì)lncRNA在結(jié)核感染過(guò)程中的不同作用及可能的機(jī)制和功能的認(rèn)識(shí)仍然有限。

二、miRNA

miRNA是一類內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為20～24 nt的ncRNA，其在真核細(xì)胞中廣泛存在，在細(xì)胞內(nèi)有重要的調(diào)節(jié)作用。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因信使RNA(messenger RNA, mRNA)，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)靶基因。miRNA 一般通過(guò)切割靶基因使其降解、抑制翻譯或以這兩種模式共同作用來(lái)參與一系列生物過(guò)程，比如細(xì)菌病原體為了促進(jìn)自身在機(jī)體內(nèi)持久性存活、復(fù)制而抑制宿主miRNA的表達(dá)，miRNA的失調(diào)影響宿主基因調(diào)控，從而進(jìn)一步影響各種炎癥因子分泌的信號(hào)通路[25-26]。

考慮到miRNA在MTB感染免疫防御過(guò)程中的重要作用，差異表達(dá)的miRNA可能影響結(jié)核感染的結(jié)果，并可能作為結(jié)核病的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),故使用miRNA譜作為結(jié)核病的診斷、預(yù)后或預(yù)測(cè)標(biāo)記物的研究越來(lái)越多。在一項(xiàng)研究中，通過(guò)結(jié)核病患者血清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)20個(gè)上調(diào)和5個(gè)下調(diào)的miRNA，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)宿主基因組編碼(host-genome encoded) RNA (has-miR-146a) 和MTB基因組編碼RNA (MTB-miR5) 在患者血清中明顯上調(diào)，has-miR-125b明顯下調(diào)，以這3種miRNA建立的診斷方法的敏感度為100%，特異度為56.67%[27]，這在結(jié)核病患者中具有極高的診斷潛力。另有研究發(fā)現(xiàn)，相較于病毒性腦膜炎患者的腦脊液，基因芯片檢測(cè)中差異明顯的hsa-miR-21-5p在結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液中明顯上調(diào)，且受試者工作特征曲線下面積(AUC)高達(dá)85.7%[28]，可作為鑒別結(jié)核性腦膜炎和病毒性腦膜炎的潛在標(biāo)志物。來(lái)自結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞的不同免疫細(xì)胞亞群的miRNA譜也顯示這些細(xì)胞群的miRNA調(diào)控異常[29]。

絕大多數(shù)被MTB感染的個(gè)體因受到機(jī)體保護(hù)而不會(huì)發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，這一過(guò)程中T細(xì)胞具有重要的參與意義。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者、潛伏感染者和健康者的CD4+T細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA富集于絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路和病灶粘附處，這提示失調(diào)的miRNA可能參與結(jié)核病從潛伏期向活動(dòng)期轉(zhuǎn)化的過(guò)程[30]。與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的兒童相比，結(jié)核病患兒的CD4+T細(xì)胞中miR-26a、miR-29a和miR-142-3p水平均降低，這可能提示它們是MTB感染中疾病易感性和治療效果的候選生物標(biāo)志物[31]。分析結(jié)核病患者和健康者外周血單核細(xì)胞的miRNA發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核病患者中與中性粒細(xì)胞相關(guān)的miR-197-3p、miR-99b-5p和miR-191-5p明顯降低，與B細(xì)胞相關(guān)的miR-320a、miR-204-5p和miR331-3p則明顯升高，考慮到中性粒細(xì)胞和B細(xì)胞在MTB感染期間具有重要的保護(hù)作用，認(rèn)為miRNA有可能被用作診斷和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，并可用于治療干預(yù)[32]。

觸發(fā)凋亡途徑、誘導(dǎo)自噬、刺激IFN-γ和TNF-α的分泌均是宿主細(xì)胞在細(xì)菌感染過(guò)程中采用的一些防御機(jī)制。MTB可誘導(dǎo)或抑制miRNA表達(dá)以逃避免疫應(yīng)答。有研究表明，在結(jié)核病患者上調(diào)的miRNA中，miR-146a-5p、miR-21-5p、miR-99b-5p和miR-132-5p均可負(fù)調(diào)控骨髓細(xì)胞中Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)信號(hào)觸發(fā)的宿主炎癥通路，從而促進(jìn)MTB的生存[33]；miRNA-106a則通過(guò)靶向作用于自噬相關(guān)基因ULK1(unc-51 like autophagy activating kinase 1)、ATG7(autophagy related 7)和ATG16L1(autophagy related 16 like 1)從而抑制MTB感染巨噬細(xì)胞的自噬過(guò)程和抗菌反應(yīng)[34]。MTB在感染早期還可誘導(dǎo)腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導(dǎo)因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)上調(diào)，TWEAK通過(guò)激活A(yù)MP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)誘導(dǎo)自噬并促進(jìn)分枝桿菌自噬體成熟，而miR-889可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制TWEAK表達(dá)來(lái)抑制自噬，以維持肉芽腫中的MTB存活[35]，這為結(jié)核病提供潛在的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。MTB還可通過(guò)調(diào)控感染宿主的miR-325-3p[36]或miR-125b-5p[37]來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，一些miRNA被證實(shí)是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)應(yīng)對(duì)MTB感染，比如MTB脂質(zhì)體甘油酯是一種主要的包膜分子，這種包膜分子可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的miR-125b高表達(dá)，而抑制miR-155的表達(dá)。由于miR-125b可破壞TNF mRNA的穩(wěn)定，而miR-155則通過(guò)抑制含SH2的肌醇-5′-磷酸酶1(SH2-containing inositol-5′-phosphatase 1，SHIP1)的表達(dá)來(lái)穩(wěn)定TNF mRNA，所以MTB脂質(zhì)體甘油酯可通過(guò)破壞TNF mRNA的穩(wěn)定來(lái)抑制人巨噬細(xì)胞中TNF的產(chǎn)生[38]。

細(xì)胞代謝的重編程如糖酵解代謝增加和宿主脂質(zhì)代謝已成為控制免疫細(xì)胞反應(yīng)的指導(dǎo)機(jī)制，促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[39]、抗原呈遞[40]和細(xì)菌抑制[41]都依賴于糖酵解代謝的增加。有研究者觀察到，miR-21通過(guò)靶向抑制糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)磷酸果糖激酶(phospho-fructo-kinase-muscle isoform，PFK-m)從而限制促炎介質(zhì)(主要是IL-1β)的產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)[42]。另外，有研究表明，MTB誘導(dǎo)miR-33基因座重編程來(lái)抑制自噬，同時(shí)促進(jìn)脂質(zhì)體在巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生以作為其營(yíng)養(yǎng)來(lái)源[43]。

雖然miRNA在宿主抗MTB免疫應(yīng)答的主要機(jī)制，如細(xì)胞因子的產(chǎn)生和在巨噬細(xì)胞中自噬的研究較多，但對(duì)于結(jié)核病相關(guān)的miRNA在特定免疫細(xì)胞群中的表達(dá)譜和調(diào)控作用研究較少。此外，許多研究揭示了結(jié)核病活動(dòng)期間差異表達(dá)的miRNA可區(qū)分結(jié)核病與健康個(gè)體，或活動(dòng)性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，顯示了miRNA作為診斷結(jié)核病的生物標(biāo)志物的可能性。盡管尋求miRNA生物標(biāo)志物有可能改善結(jié)核病的診斷和管理，但目前miRNA作為結(jié)核病診斷的生物標(biāo)志物證據(jù)有限。

三、circRNA

circRNA是內(nèi)源性RNA，由于“反向剪接”的特殊機(jī)制，circRNA經(jīng)歷了一個(gè)環(huán)化過(guò)程，導(dǎo)致缺乏典型的末端結(jié)構(gòu)，這使得它們對(duì)外切酶具有抗性[44]，同時(shí)使它們?cè)跇悠诽幚磉^(guò)程中能選擇性富集，因而比其他類型的RNA更適合用于診斷某些疾病，比如結(jié)核病的候選分子生物標(biāo)志物[45]。另一方面，由于circRNA富集了miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，間接發(fā)揮了miRNA的海綿作用，從而參與到一系列生物過(guò)程中[46]。circRNA的異常表達(dá)已在腫瘤、骨質(zhì)疏松癥、動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中得到證實(shí)[47]，circ-RNA 也可能在對(duì)微生物感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[48]。

根據(jù)“海綿作用”機(jī)制，不同的研究者從下游信號(hào)通路入手，分析差異表達(dá)的circRNA，以識(shí)別具有潛在結(jié)合位點(diǎn)的潛在miRNA，并進(jìn)一步識(shí)別這些miRNA的潛在靶基因。這種方法已被用于識(shí)別結(jié)核病新的circRNA候選診斷標(biāo)志物[49]。Huang等[50]用circRNA微陣列和qRT-RCR分析了活動(dòng)性肺結(jié)核患者與健康對(duì)照者的血漿，發(fā)現(xiàn)circ_0003528在結(jié)核病患者中高表達(dá)，通過(guò)與靶向抑制mRNA CTLA4表達(dá)的miR-0003528靶向結(jié)合，形成circRNA-miRNA-mRNA調(diào)節(jié)通路，從而促進(jìn)MTB感染巨噬細(xì)胞的極化。在另一項(xiàng)研究中，通過(guò)微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)10個(gè)顯著上調(diào)的circRNA，對(duì)其中上調(diào)最高的3個(gè)circRNA(circRNA_051239、circRNA_029965和circRNA_404022)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這3個(gè) circRNA均具有作為結(jié)核病生物標(biāo)志物的潛力[51]。

生物信息學(xué)分析表明，hsa-circRNA-103571在MTB感染期間可能與hsa-miR-29a和hsa-miR-16相互作用；對(duì)hsa-circRNA-103571匹配的miRNA靶向mRNA進(jìn)行基因本體富集(gene ontology，GO)發(fā)現(xiàn)，hsa-circRNA-103571與自噬、脂肪酸生物合成和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控密切相關(guān)[52]。此外，有研究表明miR-29a在非小細(xì)胞肺癌中可作為自噬的有效抑制劑，而miR-16可作為自噬的誘導(dǎo)劑[53]。這些觀察結(jié)果表明，hsa-circRNA-103571與miRNA-mRNA相互作用可能為活動(dòng)性結(jié)核病提供新的機(jī)制。

由于對(duì)circRNA在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能和變化缺乏全面的研究，我們?nèi)孕枰嗟难芯縼?lái)闡明其在MTB與宿主相互作用中的生物學(xué)作用及其作為臨床指標(biāo)的真正潛力。

四、總結(jié)

不同的個(gè)體對(duì)MTB的易感性存在很大的差異，而感染MTB的個(gè)體也有不同的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核病。研究人員在結(jié)核病患者血漿或其他種類生物樣本中尋找生物標(biāo)志物時(shí)，發(fā)現(xiàn)ncRNA是潛在的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)部分ncRNA也有作為治療靶標(biāo)的潛力。目前對(duì)ncRNA的研究主要集中在miRNA，但對(duì)MTB感染相關(guān)的lncRNA和circRNA的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注。MTB感染宿主后，與宿主相互作用的生物過(guò)程形成精密而復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，由于ncRNA本身的復(fù)雜性，尚有許多宿主ncRNA未被發(fā)現(xiàn)，因此其功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。此外，對(duì)于正在發(fā)現(xiàn)的宿主ncRNA缺乏準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)庫(kù)，這使得研究局限于分析基因表達(dá)的差異，而相應(yīng)的基因調(diào)控功能、下游靶點(diǎn)的識(shí)別，以及參與調(diào)控的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)朱銀銀：起草和修改文章；張洪英：指導(dǎo)專業(yè)性知識(shí)，支持性貢獻(xiàn)