青光安顆粒劑對DBA/2J小鼠視網(wǎng)膜中自噬途徑相關(guān)蛋白表達的影響

吳凱，陳立浩，時健，劉倩宏，姚小磊

青光眼為第2 大常見視力喪失原因，全球超過6,000 萬人受到青光眼導(dǎo)致的視力喪失的影響[1]。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells，RGCs）的凋亡是青光眼致盲的主要原因[2-3]，而線粒體自噬又與RGCs 的凋亡密切相關(guān)[4]。臨床上，保護RGCs 的方法十分局限，尋找保護RGCs 的中藥顯得十分重要。有研究[5]指出，眼血流量減少和波動是青光眼發(fā)展的重要原因，驗證了青光眼的病機為血瘀水停[6]。據(jù)此青光安顆粒劑（QingguanganGranules，QGA）應(yīng)運而生，由黃芪、茯苓、白術(shù)、赤芍、生地黃、地龍、紅花、車前子組成，具有益氣活血，利水明目之功。前期研究[7]證明QGA 能夠保護RGCs 形態(tài)并減少其凋亡，其療效在臨床上也得到有效驗證[8]，但作用機制尚未探明。根據(jù)線粒體自噬與RGCs 損傷的關(guān)系，猜測QGA 可能是通過調(diào)控線粒體自噬來保護RGCs 的，為了驗證這一猜想，本研究擬采用高眼壓動物模型進行實驗。DBA/2J 小鼠為近年來基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的自發(fā)性高眼壓實驗動物模型，8～9 月齡出現(xiàn)RGCs 凋亡和視神經(jīng)變性，18月齡可出現(xiàn)90%以上的視神經(jīng)變性。因此，以DBA/2J 小鼠為實驗對象，就QGA 對自噬途徑相關(guān)蛋白表達的影響進行探索，以闡明QGA 保護RGCs的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6J 小鼠10 只，雌性，質(zhì)量18～22 g，2 月齡，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（湘）2020-0002；動物DBA/2J 小鼠30 只，雌性，質(zhì)量18～22 g，56～76 日齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2020-0006。本研究實驗動物及實驗所用條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》相關(guān)規(guī)定，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗福利倫理審查委員會獲批，倫理審批號：LL2019100802。

1.2 試劑、儀器與藥品

放射免疫沉淀法（radio immune precipitation assay，RIPA）細(xì)胞裂解液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，C1053）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，CW0014S)；兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule-associated protein light chain 3B，LC3B）抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司，ab51520）；兔抗細(xì)胞色素C（cytochrome C，CytC）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，10993-1-ap）；兔抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（美國Immunoway公司，YT0656）；兔抗溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司，df7033）；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2301)；超純RNA 提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，CW0581M）。

低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司，5424R）；全自動酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠，WD-2102B）；蛋白垂直電泳儀（北京市六一儀器廠，DYY-6C）；熒光PCR 儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，CFX ConnectTM）；筆式眼壓計（美國Reichert公司，Tono-pen AVIA）。

QGA 藥物組成：QGA 由顆粒劑黃芪30 g、茯苓20 g、白術(shù)10 g、赤芍10 g、生地黃10 g、地龍10 g、紅花5 g、車前子20 g 組成，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，根據(jù)小鼠每天的用藥劑量分袋密封包裝，室溫條件下儲存在陰涼干燥處，灌胃前加入適量水溶解并加熱。

1.3 青光眼動物模型的建立

本實驗青光眼動物模型的建立采用DBA/2J 轉(zhuǎn)基因小鼠[9]，本實驗喂養(yǎng)DBA/2J 小鼠至38 周齡自動成模，并用Tono-pen 筆式眼壓計動態(tài)觀察小鼠眼壓變化。

1.4 青光眼小鼠分組及給藥方法

10 只C57BL/6J 小鼠設(shè)為對照組（control group，CG），30只DBA/2J小鼠采用隨機數(shù)字法分為模型組（model group，MG）、QGA 低劑量組（low-doseQingguangangroup，LQGA）青光安高劑量組（highdoseQingguangangroup，HQGA）。CG 組和MG 組以生理鹽水0.9 mL灌胃，每日1次；低劑量組、高劑量組分別以20.75 g/kg、103.75 g/kg的劑量每日灌胃1次，每次0.9 mL，共給藥15 d。

1.5 檢測眼壓

將小鼠眼球表面麻醉后，使用Tono-pen 筆式眼壓計輕觸小鼠眼球，連續(xù)輕觸10次讀取顯示屏上的眼壓值，從第10 周開始，每4 周測1 次，待DBA/2J 小鼠眼壓升高以及趨于穩(wěn)定后停測。

1.6 取材

取各組小鼠，麻醉后取出左眼球。左眼球鈍性分離，剝離視網(wǎng)膜，按照視網(wǎng)膜4 個象限，將視網(wǎng)膜對稱剪成上下2 份，置入EP 管內(nèi)，放入液氮罐中低溫保存。

1.7 Western Blot 檢 測LC3、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表達

各組采用Western Blot 研 究LC3、LAMP1、Caspase-3、CytC 蛋白表達。提取視網(wǎng)膜組織蛋白，測定蛋白濃度并進行蛋白定量，經(jīng)凝膠、電泳和轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗室溫孵育2 h，后將膜沖洗之后加入二抗37°C 孵育1 h，最后采用化學(xué)發(fā)光顯影，以GAPDH 為內(nèi)參計算目的蛋白的相對表達量。

1.8 qRT-PCR 檢測Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA表達

各組采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）方法檢測Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA的表達。剪取組織樣品置于離心管內(nèi)，研磨充分后進行震蕩和離心，把離心后的水相層轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入乙醇后混勻，反復(fù)離心，提取RNA。測定RNA濃度、純度。然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后熒光定量PCR，引物信息如表所示（表1）。

表1 引物信息

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料，使用方差分析（ANOVA）進行多組變量間的相互比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。不符合正態(tài)分布或方差不齊的計量資料采用以下檢驗方式：同組小鼠不同時間點的眼壓比較采用多個相關(guān)樣本的非參數(shù)Friedman 檢驗，同一時間點不同組小鼠眼壓比較采用兩獨立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗，不同組小鼠蛋白量或mRNA表達量比較采用Wilcoxon 秩和檢驗，當(dāng)P＜0.05 時被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓檢測結(jié)果

10只C57BL/6J小鼠（20眼）在第10周至第38周眼壓波動于10～16 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）之間，30 只DBA/2J 小鼠（60 只眼）眼壓在第10 周至第38 周，隨時間逐漸上升（表2）。同組小鼠不同時間點的眼壓比較，不符合正態(tài)分布，采用多個相關(guān)樣本的非參數(shù)Friedman 檢驗，結(jié)果顯示C57BL/6J小鼠在第10 周至第38 周眼壓均無明顯差異（P>0.05），DBA/2J 小鼠在第10 周至第38 周眼壓逐漸上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=136.034，P=0.000）。同一時間點不同組小鼠比較，眼壓不符合正態(tài)分布，采用兩獨立樣本非參數(shù)Mann-Whitney U 檢驗。結(jié)果顯示，DBA/2J 組小鼠眼壓逐漸升高，在第10 周顯著高于C57BL/6J組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.645，P=0.008）。

表2 C57BL/6J小鼠與DBA/2J小鼠第10周到第38周不同時相點眼壓比較（，n=20）

表2 C57BL/6J小鼠與DBA/2J小鼠第10周到第38周不同時相點眼壓比較（，n=20）

注：*與C57BL/6J組同時間點比較，P<0.05.

2.2 QGA 對DBA/2J 小鼠視網(wǎng)膜LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1蛋白表達的影響

4 組間小鼠視網(wǎng)膜中LAMP1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表達的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.207，P=0.000）。兩兩比較：與CG 相比，MG 小鼠視網(wǎng)膜LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表達升高（t=4.697，P=0.000）；與MG 比較，LQGA 與HQGA 小鼠視網(wǎng)膜LC3-Ⅱ/LC3-I 蛋白表達降低（tLQGA=5.140，tHQGA=4.946，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表3，圖1）。

表3 Western Blot檢測各組LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表達結(jié)果（，n=10）

表3 Western Blot檢測各組LC3-Ⅱ/LC3-I、LAMP1、Caspase-3、CytC蛋白表達結(jié)果（，n=10）

注：*與CG 相比P<0.05；#與MG 相比，P<0.05；CG 對照組；MG模型組；LQGA 青光安低劑量組；HQGA 青光安高劑量組；LC3 微管相關(guān)蛋白輕鏈3；LAMP1 溶酶體相關(guān)膜蛋白1；Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；CytC 細(xì)胞色素C

圖1 線粒體自噬經(jīng)典泛素化途徑相關(guān)蛋白Western Blot條帶結(jié)果

2.3 QGA 對DBA/2J 小鼠視網(wǎng)膜Parkin、LAMP1 mRNA相對表達量的影響

4 組間小鼠視網(wǎng)膜中Parkin mRNA、LAMP1 mRNA 表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FParkin=153.634，P=0.000，F(xiàn)LAMP1=6.157，P=0.018）。兩兩比較，（1）Parkin：與CG 相比，MG 小鼠Parkin mRNA 表達降低（t=18.447，P=0.000）；與MG 相比，HQGA 小鼠Parkin mRNA表達升高（t=11.143，P=0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）LAMP1：與CG 相比，HQGA 小鼠LAMP1 mRNA 表達降低（t=3.837，P=0.001）；與MG 相比，LQGA 與HQGA 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；與LQGA 相比，HQGA 小鼠LAMP1 mRNA 表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.454，P=0.003）（表4，圖2）。

2.4 QGA 對各組Caspase-3、CytC 蛋白表達以及Caspase-3 mRNA相對表達量的影響

4 組間小鼠視網(wǎng)膜中Caspase-3、CytC 表達量的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（FCaspase-3=11.379，P=0.003，F(xiàn)CytC=8.015，P=0.009）。兩兩比較，（1）Caspase-3 蛋白：與CG 相比，MG 小鼠Caspase-3 表達增高（t=5.408，P=0.000）；與MG 相比，LQGA 與HQGA 小鼠Caspase-3表達降 低（tLQGA=4.529，P=0.000；tHQGA=2.764，P=0.013），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。（2）CytC 蛋白：與CG相比，MG 小鼠CytC 表達升高（t=4.705，P=0.000）；與MG 相比，LQGA 小鼠CytC 表達降低（t=2.915，P=0.009），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表3，圖1）。（3）Caspase-3 mRNA：4 組間Caspase-3 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表4、圖2）。

圖2 qRT-PCR擴增曲線圖

表4 qRT-PCR檢測各組Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA結(jié)果（，n=10）

表4 qRT-PCR檢測各組Parkin、LAMP1、Caspase-3 mRNA結(jié)果（，n=10）

注：* 與CG 相比，P<0.05；# 與MG 相比，P<0.05；&與LQGA 相比，P<0.05；CG 對照組；MG 模型組；LQGA 青光安低劑量組；HQGA青光安高劑量組；Parkin E3泛素連接酶；LAMP1 溶酶體相關(guān)膜蛋白1、Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

3 討論

青光眼可因脾氣陽虛、肝腎虧虛導(dǎo)致目竅失養(yǎng)，神水阻滯[10]，病機歸納為“血瘀水停”，因此活血化瘀中藥被多數(shù)學(xué)者所運用[11]。QGA 重用黃芪益氣利水，配合茯苓健脾利水，輔以生地黃養(yǎng)血補血，赤芍、紅花共奏活血祛瘀之功，地龍力專善走，引諸藥到達病所，白術(shù)健脾化濕，助茯苓健脾制水，車前利水明目，全方共奏益氣活血，利水明目之功。青光眼病理因素包含“痰濁”“瘀血”[12]，異常積累的蛋白與自噬水平的下降導(dǎo)致蛋白無法降解，印證了自噬的不足與“血瘀水?！泵芮邢嚓P(guān)[13]。

自噬途徑相關(guān)蛋白的表達可以反映自噬的完整程度。自噬體形成時，LC3-I 轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)形式的LC3-II，因此LC3-II/LC3-I 的比值與自噬體的數(shù)量與完整性相關(guān)[14-15]。Parkin 的表達反映了線粒體自噬的信號強度[16]，Caspase-3 反映了細(xì)胞凋亡程度[17]，LAMP1 常用于檢測自噬溶酶體的形成[18]。線粒體功能障礙時，磷酸酶及張力蛋白同源物誘導(dǎo)的蛋白激酶1（Pink1）磷酸化并附著在線粒體外膜蛋白質(zhì)上的泛素Ser65位點，靶向募集Parkin至線粒體外膜使線粒體外膜蛋白泛素化[16]。泛素化蛋白被RGCs 的受體蛋白optineurin 識別，同時LC3 與受體蛋白optineurin 結(jié)合，LC3-I 轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II，LC3-II與自噬體外膜內(nèi)膜相關(guān)聯(lián)[19]，使線粒體被自噬小泡包裹成自噬體，自噬體與溶酶體結(jié)合并在溶酶體中降解，完成完整的Pink1/Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬過程。若自噬體降解受阻，將對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[20]。此外，線粒體自噬本身會使累積的自噬體去極化，膜通透性增加，致使CytC 釋放[4]，進而激活Caspase-3，導(dǎo)致RGCs凋亡[21]。

在本實驗中，與CG 相比，MG 小鼠中LC3-II/LC3-I、Caspase-3、CytC 蛋白表達均增加，可知MG中線粒體自噬的數(shù)量以及RGCs 的凋亡均升高，根據(jù)已有的研究[22]，青光眼能誘導(dǎo)線粒體自噬的增加和RGCs 的凋亡，代表模型建立成功。MG 中線粒體自噬增加，自噬體快速堆積，溶酶體降解能力并不能代償自噬體的堆積速度，過剩的自噬體沒有得到有效的清除而積累，使得線粒體自噬不能完成全部過程，大量CytC 釋放，激活Caspase-3，導(dǎo)致RGCs 的凋亡。MG 小鼠Parkin mRNA 的含量低于CG，筆者認(rèn)為造成這種現(xiàn)象可能有3 種原因，一是由于qRTPCR 檢測方法的誤差，二是在MG 小鼠中，隨著視神經(jīng)中線粒體自噬增加，視網(wǎng)膜RGCs 中的Parkin 已隨軸突運行到視神經(jīng)中，故在視網(wǎng)膜組織中的含量少，三是由于部分CG 小鼠在檢測之前就有多余的Parkin蛋白儲備，但未行使其功能。

與 MG 相比，LQGA 小鼠 LC3-II/LC3-I、Caspase-3、CytC 蛋白表達均降低，Parkin mRNA、LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA 表達無明顯變化，HQGA 小 鼠LC3-II/LC3-I、Caspase-3 蛋白表達降低，Parkin mRNA 表達增加，LAMP1 mRNA、Caspase-3 mRNA 表達無明顯變化。提示青光眼小鼠喂養(yǎng)QGA 后，線粒體自噬信號強度未降低，自噬體的形成減少，減少了自噬體的堆積，使得溶酶體降解能力足夠代償自噬體的堆積，QGA 有利于保護RGCs。雖然以上指標(biāo)的qRT-PCR 檢測和Western Blot檢測結(jié)果并不完全一致，但沒有相反的結(jié)果，推測可能是由檢測誤差引起，或者部分小鼠在檢測之前就有多余的蛋白儲備，但未行使其功能。

綜上所述，QGA 可在一定程度上降低青光眼小鼠視網(wǎng)膜中LC3-II/LC3-I、Caspase-3 的蛋白表達，升高Parkin mRNA 的表達，加強線粒體自噬的信號，降低青光眼小鼠視網(wǎng)膜中過剩的線粒體自噬數(shù)量，有利于減少自噬體的堆積，降低RGCs的凋亡。