扶正口服液對誘導(dǎo)性癌癥惡病質(zhì)裸鼠骨骼肌中ERAD/ERSIA 通路的影響

孫銀輝，何 曉，李涵宇，竇 嫻，陳 晟，彭慧婷，楊 曉，劉 華，李 菁，王理槐*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

癌癥惡病質(zhì)（cancer cachexia, CC）是一組常見于惡性腫瘤晚期消耗性癥狀的總稱，是腫瘤患者死亡的原因之一，但其發(fā)病機制及有效治療策略尚待探索。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS）介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性降解（ER-associated degradation, ERAD）-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡（endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA）途徑是機體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和質(zhì)量控制的關(guān)鍵機制，ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[1]，多項研究[2-3]證實，上調(diào)ERAD 途徑蛋白表達抗凋亡對細胞具有保護作用。 然而如何通過ERAD 途徑影響CC 肌肉代謝的抗凋亡機制則缺乏研究。課題組基于“脾在體合肉，主四肢，腎在體合骨”的生理特性及明代李中梓“脾腎互贊”學(xué)說，提出了“健脾益腎法干預(yù)CC 骨骼肌消耗”的治療思路，并創(chuàng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑扶正口服液（主要由茯苓、黨參、太子參、熟地黃、黃精、女貞子、淫羊藿等組成）。 前期[4-8]研究證實，扶正口服液可通過降低腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的表達改善CC，但其機制有待深入研究。 基于此，本研究擬使用扶正口服液干預(yù)不同階段的CC 模型裸鼠， 觀察不同時間段腫瘤體積、裸鼠攝食量、體質(zhì)量變化，檢測ERAD 通路調(diào)控蛋白X 盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein1, XBP1）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶1（inositol requiring enzyme 1, IRE1）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白1（Derlin-1）、滑膜細胞凋亡抑制物1（synovial apoptosis inhibitor 1, SYVN1） 表達和ERSIA 信號通路CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白 （CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein, CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）蛋白表達情況，探討扶正口服液對CC 的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c-nu 裸鼠36 只，雄性，購自湖南安生美藥物研究院有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，鼠齡4～5 周。 分籠喂養(yǎng)，自由采食，溫度為（24±3） ℃，濕度為40%～60%。實驗全程完成于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。 研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審批（審批號：LL2020052601），對動物的各種處理均遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗藥品、試劑及器材

扶正口服液（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：20210518）；SYVN1、IRE1、XBP1、CHOP、p-JNK（江蘇親科生物研究中心有限公司，批號：DF12235、DF7709、AF5110、DF6025、AF3318）；Derlin-1[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號：Ab176732]；羊抗兔-HRP（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0295GHRP）；30%制膠液（索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號：A1010）。 YLS-Q6 型裸鼠灌胃器（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）；Leica Dm LB2 型顯微鏡（美嘉儀器股份有限公司）；HXT/C 型低溫解剖操作臺（上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司）；H2050R-1 型低溫高速離心機（上海華巖設(shè)備有限公司）；ACS-3 型電子記價秤（上海臺衡儀器儀表有限公司）。

1.3 CC 模型建立[9-11]及分組干預(yù)

選取36 只6～7 周齡BALB/c-nu SPF 級裸鼠，依據(jù)前期研究基礎(chǔ)及相關(guān)文獻[9-10]造模，采用苦寒瀉下、饑飽失常、力竭運動三因素誘導(dǎo)法誘導(dǎo)14 d，建立脾虛證裸鼠模型，隨機取12 只分為A 組（正常裸鼠生理鹽水灌胃）、B 組（正常裸鼠扶正口服液灌胃）。 剩余24 只脾虛證裸鼠右前腋下接種CT26 結(jié)腸癌細胞，接種劑量0.1 mL/只，接種過程在1 h 完成。接種后同時采用苦寒瀉下、饑飽失常兩因素誘導(dǎo)法，繼續(xù)誘導(dǎo)14 d，致瘤后體質(zhì)量顯著下降，裸鼠右側(cè)腋下捫及腫塊，精神萎靡，無明顯自主活動，同時出現(xiàn)攝食量下降、體質(zhì)量下降、毛發(fā)干枯及活動減少等癥狀時，提示CC 模型已建立。成功建立脾虛證裸鼠CC 模型的24 只裸鼠隨機分成A、B、C、D 組，每組6 只。

A 組：生理鹽水40 mL/kg 灌胃，連續(xù)56 d；B組：按人-小鼠等效劑量換算，灌胃扶正口服液（40 mL/kg），連續(xù)56 d；C 組：生理鹽水（40 mL/kg）于CC 后灌胃14 d；D 組：CC 后扶正口服液（40 mL/kg）灌胃14 d；E 組：生理鹽水（40 mL/kg）于CC 后灌胃28 d；F 組：CC 后連續(xù)灌胃扶正口服液（40 mL/kg）28 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 體質(zhì)量測定 分別在0、14、28、42、56 d 解剖取材前各稱重1 次， 精確到0.01 g， 稱重時間選在14:00～16:00，最后以頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠，剝離出整個瘤體，測量比對其最大直徑，腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，以備組織切片及免疫組化分析使用；肌腱無損失分離雙側(cè)后肢骨骼肌備用。1.4.2 攝食量觀察 裸鼠同籠喂養(yǎng)，提供同一飼料，每日14:00～16:00 記錄每組裸鼠攝食總量。攝食量=前一日飼料量-次日剩余飼料量，測第14、28、42、56天的攝食量。

1.4.3 腫瘤體積測定 頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠，剝離瘤體，開始用游標(biāo)卡尺測定腫瘤的長、短徑，按以下公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（V）=1/2×a×b2，其中a、b 分別代表腫瘤的長徑(mm)、短徑(mm)。

1.5 HE 染色觀察骨骼肌組織病理學(xué)變化

將裸鼠肌肉組織放于標(biāo)記編號的包埋盒中，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片，再進行HE 染色，在100 倍、400 倍視野進行采集。 將切片置于顯微鏡下，選取每塊肌肉橫截面內(nèi)300～400 條肌纖維進行測量，在每塊肌肉橫截面切片圖像上，隨機選擇一個不位于圖像邊緣的方格作為起點，有規(guī)律地間隔若干個方格，分別計數(shù)各選定方格內(nèi)的肌纖維(通過調(diào)整方格大小，保證最終能采集到足夠的肌纖維總數(shù))，在計數(shù)每個方格內(nèi)的肌纖維數(shù)目時，方格上方及左側(cè)邊框上的肌纖維不作計數(shù)和測量。 采集到足夠數(shù)量的肌纖維，并采用Image-Pro Plus 6.0 醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析，計算每塊肌肉的肌纖維橫截面積。

1.6 RT-PCR 檢測ERAD/ERSIA 信號通路激活情況

各組裸鼠取材后提取RNA，經(jīng)多功能酶標(biāo)儀檢查濃度后，去除殘留基因組DNA，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，稀釋10 倍，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?以2-ΔΔCt法(Livak 法)進行定量分析，再用校準(zhǔn)樣本的ΔCt 值歸一試驗樣本的ΔCt值，最后計算表達水平比率。 引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.7 Western blot 檢測ERAD/ERSIA 信號通路激活情況

從冰箱中取出凍存的樣本，稱取適量的組織按照1∶9 的比例加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，在4 ℃的條件下震蕩至組織塊全部破碎，置于冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，離心半徑8 cm，吸取上清。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)測定結(jié)果對蛋白濃度進行調(diào)整，保證不同組別之間蛋白濃度一致，根據(jù)實際情況計算樣本最終上樣量，與適量loading buffer 混勻，95 ℃煮5 min，冰浴冷卻后于-80 ℃保存。 制備電泳膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫印跡顯色，將每個指標(biāo)與內(nèi)參GAPDH 進行灰度值比較，計算出每個指標(biāo)的相對灰度值，使用Graphpad prism（6.01）軟件進行繪圖。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件完成，計量資料用“±s”表示，正態(tài)分布計量資料用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行比較，偏態(tài)分布計量資料采用秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠一般情況比較

實驗過程中，A、B 組裸鼠一直保持體格大小正常，體質(zhì)量波動小，膚色紅潤等健康體征，未見異常；C、E 組腫瘤體積隨時間增長而增大，體格逐漸消瘦，裸鼠活動性差，膚色蒼白，皮褶度變大，CC 體征逐漸加重；D 組與C 組相比略顯紅潤，稍活躍；F 組與E 組相比體征有略微的改善。圖1a 為裸鼠處死前的拍照。

2.2 各組裸鼠腫瘤體積比較

實驗?zāi)┢谄嗜×鲶w拍照，測量計算腫瘤長短徑估算體積并對比。與C 組比較，D 組腫瘤體積減?。≒＜0.05），E 組腫瘤體積明顯增大（P＜0.05）；與E 組比較，F(xiàn) 組腫瘤體積減?。≒＜0.05）。 詳見圖1b、圖1c。

圖1 各組裸鼠一般情況及腫瘤體積變化情況

2.3 各組裸鼠攝食量、體質(zhì)量比較

與A、B 組比較，C、D 組攝食量均下降（P＜0.05）；與C 組比較，D 組攝食量增加，E、F 組攝食量下降（P＜0.05）；與D 組比較，E、F 組攝食量下降（P＜0.05）；與E 組比較，F(xiàn) 組攝食量增加（P＜0.05）。 與A、B 組比較，在第6 周C、D 組體質(zhì)量下降（P＜0.05），在第8周E、F 組體質(zhì)量下降（P＜0.05）；與C 組比較，第6周D 組體質(zhì)量增加（P＜0.05）；與E 組比較，第8 周F組體質(zhì)量增加（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 各組裸鼠攝食量、體質(zhì)量變化情況

2.4 各組裸鼠骨骼肌組織病理變化

A、B 組骨骼肌組織肌纖維排列規(guī)則整齊，可見線粒體分布于相鄰的肌原纖維之間，C、D、E、F 組骨骼肌組織肌纖維腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，排列不齊，肌橫紋不清晰，局部肌膜不完整，肌核分布不均，出現(xiàn)核聚集或部分肌細胞核消失，肌間隙嚴(yán)重消失；D、F 組較C、E 組肌纖維排列整齊，條理較清晰，只有少部分肌纖維腫脹，肌細胞核較均勻分布在肌膜下，無增生和腫脹或固縮，肌纖維間隙尚正常，且F 組較D 組改善更明顯。 詳見圖3。

圖3 各組裸鼠骨骼肌組織HE 染色

2.5 各組裸鼠骨骼肌組織中CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達比較

與A 組比較，B、C、D、E、F 組CHOP mRNA 及CHOP 蛋白表達下降（P＜0.05），C、D、E 組p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），B、F 組p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。與B 組比較，C 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），D、E、F 組CHOP mRNA 表達下降（P＜0.05），D、E 組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），F(xiàn) 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與C 組比較，D、E、F 組CHOP mRNA及蛋白表達下降（P＜0.05），D、F 組p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05），E 組p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05）。與D 組比較，F(xiàn) 組CHOP mRNA 表達下降（P＜0.05），E組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高（P＜0.05），F(xiàn) 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與E 組比較，F(xiàn) 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達下降（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組裸鼠骨骼肌組織CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白相對表達量比較

2.6 各組裸鼠骨骼肌組織中XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達比較

與A 組比較，B 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1蛋白及mRNA 表達升高（P＜0.05）；C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、SYVN1 蛋白表 達 升高（P＜0.05），Derlin-1 蛋 白 表 達 下 降（P＜0.05）；D組XBP1 mRNA 表達下降（P＜0.05），Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN1蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05），IRE1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05）。 與B組比較，C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 及蛋白表達升高（P＜0.05）；D 組XBP1、DREL1、SYVN1、IRE1 mRNA表達下降（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；E組XBP1、Derlin-1、SYVN1、mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05）,XBP1、Derlin-1、SYVN1、IRE1 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），IRE1 mRNA表達升高（P＜0.05）,XBP1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與C組比較，D 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1 mRNA 及蛋白表達下降（P ＜0.05）；E 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組IRE1 mRNA 表達下降（P＜0.05），XBP1、SYVN1 蛋白表達升高（P＜0.05），IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降（P＜0.05）。 與D 組比較，E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表 達 下 降（P＜0.05），IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降（P＜0.05）；F 組IRE1 mRNA 表達升高（P＜0.05），Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降（P＜0.05），XBP1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降（P＜0.05），IRE1 蛋白表達升高（P＜0.05）。與E 組比，F(xiàn) 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA 表達均升高（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組裸鼠骨骼肌組織中XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN11mRNA 及蛋白相對表達量比較

3 討論

CC 狀態(tài)下，骨骼肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)通過減少錯誤折疊蛋白的生成緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，不能被重新折疊的錯誤折疊蛋白通過ERAD 途徑予以降解以促進骨骼肌細胞生存。 若持續(xù)的ERAD 都不能恢復(fù)肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，則細胞啟動ERSIA 促進細胞死亡。 因此，“ERADERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡”在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[11]，促進恢復(fù)“ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)”是治療CC的潛在策略。

研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體通路、死亡受體通路及氧化應(yīng)激等均參與了細胞凋亡，其中ERS 是目前的研究熱點[12]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS 包括未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡和整合應(yīng)激反應(yīng)是3 個相互聯(lián)系的動態(tài)過程，其中最主要的是未折疊蛋白反應(yīng)[13]。研究證實，ERS 表達過強或者持續(xù)時間過長均會引發(fā)細胞凋亡，ERS 是引發(fā)細胞凋亡的重要途徑[14]。ERS 主要通過CHOP、JNK、Caspase-12 途徑誘導(dǎo)凋亡，其中CHOP 介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路是ERSIA的主要形式[15]。 同時，ERAD 的大致過程為羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1(hydroxymethylglutaryl-goA reductase degradation protein 1, Hrd1)通過一種目前尚未知的機制識別并結(jié)合錯誤折疊蛋白，接著由Derlin-1、硒蛋白（VCP/P97-interacting membrane protein, VIMP)、E3 泛素連接酶和p97 組成的復(fù)合物也加入其中，最終形成一個更大的轉(zhuǎn)位復(fù)合物。錯誤折疊蛋白經(jīng)泛素化修飾后，通過跨膜通道轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)蛋白酶體中降解，XBP1、IRE1、SYVN1也被證實在ERAD 途徑中有重要作用[16]。

本研究顯示，隨著腫瘤的增長，C、D、E、F 組裸鼠的體質(zhì)量逐漸下降，第6 周發(fā)現(xiàn)，在扶正口服液的作用下D 組裸鼠體質(zhì)量較C 組有升高的趨勢，第8周發(fā)現(xiàn)，在扶正口服液的作用下F 組裸鼠體質(zhì)量較E 組有升高的趨勢，緩解了CC。同時，D、F 組裸鼠的攝食量較未給藥的裸鼠有所提升。CC 病程中腫瘤體積會逐漸增大，但D、F 組較同期C、E 組腫瘤體積減小，提示扶正口服液可能通過減小腫瘤體積緩解CC。 通過RT-PCR、Western blot 法檢測組織蛋白、mRNA 的表達發(fā)現(xiàn)：ERSIA 主要通路蛋白CHOP、p-JNK 在D 組較C 組表達下降，在F 組較E 組表達下降；ERAD 途徑的主要通路蛋白XBP-1、Derlin-1、SYVN1 則 在D 組 較C 組 表 達 升 高，XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白在F 組較E 組表達升高。上述結(jié)果提示在CC 過程中，扶正口服液可能通過抑制ERSIA 的促骨骼肌凋亡途徑和促進ERAD 的骨骼肌細胞抗凋亡途徑，糾正“ERAD-ERSIA 失衡”而改善CC 狀態(tài)。

同時，本研究團隊發(fā)現(xiàn)扶正口服液干預(yù)晚期CC 優(yōu)于早期CC。中醫(yī)認(rèn)為，腫瘤初期，正氣未虛，瘀毒邪氣內(nèi)盛，此時當(dāng)以驅(qū)邪為主[17-19]。 若此時重用健脾益腎法為主的扶正口服液，則閉門留寇，邪毒更甚，故早期使用扶正口服液干預(yù)CC 無明顯療效優(yōu)勢；腫瘤晚期時，機體邪正俱虛，但正虛更甚，難以驅(qū)邪外出[20-22]。 此時使用扶正口服液以扶正祛邪，用藥切合病機，故晚期扶正口服液干預(yù)CC 的療效明顯。

綜上所述，本研究證實扶正口服液的抗CC 作用及其優(yōu)勢作用時間，初步揭示了ERAD-ERSIA 通路在CC 中的作用。 扶正口服液通過上調(diào)骨骼肌XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達激活ERAD通路，下調(diào)CHOP、p-JNK 蛋白表達抑制ERSIA 通路，糾正“ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡”是其抗CC 的機制之一。 這為扶正口服液臨床用于改善腫瘤晚期CC提供了支撐，后續(xù)將繼續(xù)對該制劑的藥理機制做深入探索。