孫銀輝,何 曉,李涵宇,竇 嫻,陳 晟,彭慧婷,楊 曉,劉 華,李 菁,王理槐*
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)
癌癥惡病質(zhì)(cancer cachexia, CC)是一組常見于惡性腫瘤晚期消耗性癥狀的總稱,是腫瘤患者死亡的原因之一,但其發(fā)病機制及有效治療策略尚待探索。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性降解(ER-associated degradation, ERAD)-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA)途徑是機體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和質(zhì)量控制的關(guān)鍵機制,ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[1],多項研究[2-3]證實,上調(diào)ERAD 途徑蛋白表達抗凋亡對細胞具有保護作用。 然而如何通過ERAD 途徑影響CC 肌肉代謝的抗凋亡機制則缺乏研究。課題組基于“脾在體合肉,主四肢,腎在體合骨”的生理特性及明代李中梓“脾腎互贊”學(xué)說,提出了“健脾益腎法干預(yù)CC 骨骼肌消耗”的治療思路,并創(chuàng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑扶正口服液(主要由茯苓、黨參、太子參、熟地黃、黃精、女貞子、淫羊藿等組成)。 前期[4-8]研究證實,扶正口服液可通過降低腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的表達改善CC,但其機制有待深入研究。 基于此,本研究擬使用扶正口服液干預(yù)不同階段的CC 模型裸鼠, 觀察不同時間段腫瘤體積、裸鼠攝食量、體質(zhì)量變化,檢測ERAD 通路調(diào)控蛋白X 盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein1, XBP1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白激酶1(inositol requiring enzyme 1, IRE1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白1(Derlin-1)、滑膜細胞凋亡抑制物1(synovial apoptosis inhibitor 1, SYVN1) 表達和ERSIA 信號通路CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白 (CCAAT/enhancer-binding protein-homologous protein, CHOP)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)蛋白表達情況,探討扶正口服液對CC 的作用及其機制。
BALB/c-nu 裸鼠36 只,雄性,購自湖南安生美藥物研究院有限公司,許可證號:SCXK(湘)2019-0004,鼠齡4~5 周。 分籠喂養(yǎng),自由采食,溫度為(24±3) ℃,濕度為40%~60%。實驗全程完成于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。 研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審批(審批號:LL2020052601),對動物的各種處理均遵循中華人民共和國科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。
扶正口服液(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,批號:20210518);SYVN1、IRE1、XBP1、CHOP、p-JNK(江蘇親科生物研究中心有限公司,批號:DF12235、DF7709、AF5110、DF6025、AF3318);Derlin-1[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司,批號:Ab176732];羊抗兔-HRP(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號:bs-0295GHRP);30%制膠液(索萊寶生物技術(shù)有限公司,批號:A1010)。 YLS-Q6 型裸鼠灌胃器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);Leica Dm LB2 型顯微鏡(美嘉儀器股份有限公司);HXT/C 型低溫解剖操作臺(上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司);H2050R-1 型低溫高速離心機(上海華巖設(shè)備有限公司);ACS-3 型電子記價秤(上海臺衡儀器儀表有限公司)。
選取36 只6~7 周齡BALB/c-nu SPF 級裸鼠,依據(jù)前期研究基礎(chǔ)及相關(guān)文獻[9-10]造模,采用苦寒瀉下、饑飽失常、力竭運動三因素誘導(dǎo)法誘導(dǎo)14 d,建立脾虛證裸鼠模型,隨機取12 只分為A 組(正常裸鼠生理鹽水灌胃)、B 組(正常裸鼠扶正口服液灌胃)。 剩余24 只脾虛證裸鼠右前腋下接種CT26 結(jié)腸癌細胞,接種劑量0.1 mL/只,接種過程在1 h 完成。接種后同時采用苦寒瀉下、饑飽失常兩因素誘導(dǎo)法,繼續(xù)誘導(dǎo)14 d,致瘤后體質(zhì)量顯著下降,裸鼠右側(cè)腋下捫及腫塊,精神萎靡,無明顯自主活動,同時出現(xiàn)攝食量下降、體質(zhì)量下降、毛發(fā)干枯及活動減少等癥狀時,提示CC 模型已建立。成功建立脾虛證裸鼠CC 模型的24 只裸鼠隨機分成A、B、C、D 組,每組6 只。
A 組:生理鹽水40 mL/kg 灌胃,連續(xù)56 d;B組:按人-小鼠等效劑量換算,灌胃扶正口服液(40 mL/kg),連續(xù)56 d;C 組:生理鹽水(40 mL/kg)于CC 后灌胃14 d;D 組:CC 后扶正口服液(40 mL/kg)灌胃14 d;E 組:生理鹽水(40 mL/kg)于CC 后灌胃28 d;F 組:CC 后連續(xù)灌胃扶正口服液(40 mL/kg)28 d。
1.4.1 體質(zhì)量測定 分別在0、14、28、42、56 d 解剖取材前各稱重1 次, 精確到0.01 g, 稱重時間選在14:00~16:00,最后以頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠,剝離出整個瘤體,測量比對其最大直徑,腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定,以備組織切片及免疫組化分析使用;肌腱無損失分離雙側(cè)后肢骨骼肌備用。1.4.2 攝食量觀察 裸鼠同籠喂養(yǎng),提供同一飼料,每日14:00~16:00 記錄每組裸鼠攝食總量。攝食量=前一日飼料量-次日剩余飼料量,測第14、28、42、56天的攝食量。
1.4.3 腫瘤體積測定 頸椎脫臼法處死各組實驗裸鼠,剝離瘤體,開始用游標(biāo)卡尺測定腫瘤的長、短徑,按以下公式計算腫瘤體積:腫瘤體積(V)=1/2×a×b2,其中a、b 分別代表腫瘤的長徑(mm)、短徑(mm)。
將裸鼠肌肉組織放于標(biāo)記編號的包埋盒中,脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片,再進行HE 染色,在100 倍、400 倍視野進行采集。 將切片置于顯微鏡下,選取每塊肌肉橫截面內(nèi)300~400 條肌纖維進行測量,在每塊肌肉橫截面切片圖像上,隨機選擇一個不位于圖像邊緣的方格作為起點,有規(guī)律地間隔若干個方格,分別計數(shù)各選定方格內(nèi)的肌纖維(通過調(diào)整方格大小,保證最終能采集到足夠的肌纖維總數(shù)),在計數(shù)每個方格內(nèi)的肌纖維數(shù)目時,方格上方及左側(cè)邊框上的肌纖維不作計數(shù)和測量。 采集到足夠數(shù)量的肌纖維,并采用Image-Pro Plus 6.0 醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析,計算每塊肌肉的肌纖維橫截面積。
各組裸鼠取材后提取RNA,經(jīng)多功能酶標(biāo)儀檢查濃度后,去除殘留基因組DNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序,逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,稀釋10 倍,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?以2-ΔΔCt法(Livak 法)進行定量分析,再用校準(zhǔn)樣本的ΔCt 值歸一試驗樣本的ΔCt值,最后計算表達水平比率。 引物序列見表1。
表1 RT-PCR 引物序列
從冰箱中取出凍存的樣本,稱取適量的組織按照1∶9 的比例加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液,在4 ℃的條件下震蕩至組織塊全部破碎,置于冰上裂解20 min,4 ℃,12 000 r/min 離心20 min,離心半徑8 cm,吸取上清。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度,根據(jù)測定結(jié)果對蛋白濃度進行調(diào)整,保證不同組別之間蛋白濃度一致,根據(jù)實際情況計算樣本最終上樣量,與適量loading buffer 混勻,95 ℃煮5 min,冰浴冷卻后于-80 ℃保存。 制備電泳膠,上樣,電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫印跡顯色,將每個指標(biāo)與內(nèi)參GAPDH 進行灰度值比較,計算出每個指標(biāo)的相對灰度值,使用Graphpad prism(6.01)軟件進行繪圖。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件完成,計量資料用“±s”表示,正態(tài)分布計量資料用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行比較,偏態(tài)分布計量資料采用秩和檢驗。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
實驗過程中,A、B 組裸鼠一直保持體格大小正常,體質(zhì)量波動小,膚色紅潤等健康體征,未見異常;C、E 組腫瘤體積隨時間增長而增大,體格逐漸消瘦,裸鼠活動性差,膚色蒼白,皮褶度變大,CC 體征逐漸加重;D 組與C 組相比略顯紅潤,稍活躍;F 組與E 組相比體征有略微的改善。圖1a 為裸鼠處死前的拍照。
實驗?zāi)┢谄嗜×鲶w拍照,測量計算腫瘤長短徑估算體積并對比。與C 組比較,D 組腫瘤體積減?。≒<0.05),E 組腫瘤體積明顯增大(P<0.05);與E 組比較,F(xiàn) 組腫瘤體積減?。≒<0.05)。 詳見圖1b、圖1c。
圖1 各組裸鼠一般情況及腫瘤體積變化情況
與A、B 組比較,C、D 組攝食量均下降(P<0.05);與C 組比較,D 組攝食量增加,E、F 組攝食量下降(P<0.05);與D 組比較,E、F 組攝食量下降(P<0.05);與E 組比較,F(xiàn) 組攝食量增加(P<0.05)。 與A、B 組比較,在第6 周C、D 組體質(zhì)量下降(P<0.05),在第8周E、F 組體質(zhì)量下降(P<0.05);與C 組比較,第6周D 組體質(zhì)量增加(P<0.05);與E 組比較,第8 周F組體質(zhì)量增加(P<0.05)。 詳見圖2。
圖2 各組裸鼠攝食量、體質(zhì)量變化情況
A、B 組骨骼肌組織肌纖維排列規(guī)則整齊,可見線粒體分布于相鄰的肌原纖維之間,C、D、E、F 組骨骼肌組織肌纖維腫脹,結(jié)構(gòu)紊亂,排列不齊,肌橫紋不清晰,局部肌膜不完整,肌核分布不均,出現(xiàn)核聚集或部分肌細胞核消失,肌間隙嚴(yán)重消失;D、F 組較C、E 組肌纖維排列整齊,條理較清晰,只有少部分肌纖維腫脹,肌細胞核較均勻分布在肌膜下,無增生和腫脹或固縮,肌纖維間隙尚正常,且F 組較D 組改善更明顯。 詳見圖3。
圖3 各組裸鼠骨骼肌組織HE 染色
與A 組比較,B、C、D、E、F 組CHOP mRNA 及CHOP 蛋白表達下降(P<0.05),C、D、E 組p-JNK 蛋白表達升高(P<0.05),B、F 組p-JNK 蛋白表達下降(P<0.05)。與B 組比較,C 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達升高(P<0.05),D、E、F 組CHOP mRNA 表達下降(P<0.05),D、E 組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高(P<0.05),F(xiàn) 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降(P<0.05)。 與C 組比較,D、E、F 組CHOP mRNA及蛋白表達下降(P<0.05),D、F 組p-JNK 蛋白表達下降(P<0.05),E 組p-JNK 蛋白表達升高(P<0.05)。與D 組比較,F(xiàn) 組CHOP mRNA 表達下降(P<0.05),E組CHOP、p-JNK 蛋白表達升高(P<0.05),F(xiàn) 組CHOP、p-JNK 蛋白表達下降(P<0.05)。 與E 組比較,F(xiàn) 組CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白表達下降(P<0.05)。 詳見圖4。
圖4 各組裸鼠骨骼肌組織CHOP mRNA 及CHOP、p-JNK 蛋白相對表達量比較
與A 組比較,B 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1蛋白及mRNA 表達升高(P<0.05);C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA表達升高(P<0.05),XBP1、IRE1、SYVN1 蛋白表 達 升高(P<0.05),Derlin-1 蛋 白 表 達 下 降(P<0.05);D組XBP1 mRNA 表達下降(P<0.05),Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達升高(P<0.05),XBP1、Derlin-1、SYVN1蛋白表達升高(P<0.05),IRE1 蛋白表達下降(P<0.05);E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA 表達升高(P<0.05),XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達下降(P<0.05);F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA 表達升高(P<0.05),XBP1、Derlin-1 蛋白表達下降(P<0.05),IRE1、SYVN1 蛋白表達升高(P<0.05)。 與B組比較,C 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA 及蛋白表達升高(P<0.05);D 組XBP1、DREL1、SYVN1、IRE1 mRNA表達下降(P<0.05),XBP1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達升高(P<0.05),IRE1 蛋白表達下降(P<0.05);E組XBP1、Derlin-1、SYVN1、mRNA 表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA 表達升高(P<0.05),XBP1、Derlin-1、SYVN1、IRE1 蛋白表達下降(P<0.05);F 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降(P<0.05),IRE1 mRNA表達升高(P<0.05),XBP1、SYVN1 蛋白表達升高(P<0.05),IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降(P<0.05)。 與C組比較,D 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達升高(P<0.05),IRE1 mRNA 及蛋白表達下降(P <0.05);E 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 及蛋白表達下降(P<0.05);F 組IRE1 mRNA 表達下降(P<0.05),XBP1、SYVN1 蛋白表達升高(P<0.05),IRE1、Derlin-1 蛋白表達下降(P<0.05)。 與D 組比較,E 組XBP1、Derlin-1、SYVN1 mRNA 表 達 下 降(P<0.05),IRE1 mRNA 表達升高(P<0.05),XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降(P<0.05);F 組IRE1 mRNA 表達升高(P<0.05),Derlin-1、SYVN1 mRNA 表達下降(P<0.05),XBP1、Derlin-1、SYVN 蛋白表達下降(P<0.05),IRE1 蛋白表達升高(P<0.05)。與E 組比,F(xiàn) 組XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白及mRNA 表達均升高(P<0.05)。 詳見圖5。
圖5 各組裸鼠骨骼肌組織中XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN11mRNA 及蛋白相對表達量比較
CC 狀態(tài)下,骨骼肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)通過減少錯誤折疊蛋白的生成緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,不能被重新折疊的錯誤折疊蛋白通過ERAD 途徑予以降解以促進骨骼肌細胞生存。 若持續(xù)的ERAD 都不能恢復(fù)肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能,則細胞啟動ERSIA 促進細胞死亡。 因此,“ERADERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡”在CC 骨骼肌消耗過程中扮演重要角色[11],促進恢復(fù)“ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)”是治療CC的潛在策略。
研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體通路、死亡受體通路及氧化應(yīng)激等均參與了細胞凋亡,其中ERS 是目前的研究熱點[12]。研究發(fā)現(xiàn),ERS 包括未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡和整合應(yīng)激反應(yīng)是3 個相互聯(lián)系的動態(tài)過程,其中最主要的是未折疊蛋白反應(yīng)[13]。研究證實,ERS 表達過強或者持續(xù)時間過長均會引發(fā)細胞凋亡,ERS 是引發(fā)細胞凋亡的重要途徑[14]。ERS 主要通過CHOP、JNK、Caspase-12 途徑誘導(dǎo)凋亡,其中CHOP 介導(dǎo)的細胞凋亡信號通路是ERSIA的主要形式[15]。 同時,ERAD 的大致過程為羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1(hydroxymethylglutaryl-goA reductase degradation protein 1, Hrd1)通過一種目前尚未知的機制識別并結(jié)合錯誤折疊蛋白,接著由Derlin-1、硒蛋白(VCP/P97-interacting membrane protein, VIMP)、E3 泛素連接酶和p97 組成的復(fù)合物也加入其中,最終形成一個更大的轉(zhuǎn)位復(fù)合物。錯誤折疊蛋白經(jīng)泛素化修飾后,通過跨膜通道轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)蛋白酶體中降解,XBP1、IRE1、SYVN1也被證實在ERAD 途徑中有重要作用[16]。
本研究顯示,隨著腫瘤的增長,C、D、E、F 組裸鼠的體質(zhì)量逐漸下降,第6 周發(fā)現(xiàn),在扶正口服液的作用下D 組裸鼠體質(zhì)量較C 組有升高的趨勢,第8周發(fā)現(xiàn),在扶正口服液的作用下F 組裸鼠體質(zhì)量較E 組有升高的趨勢,緩解了CC。同時,D、F 組裸鼠的攝食量較未給藥的裸鼠有所提升。CC 病程中腫瘤體積會逐漸增大,但D、F 組較同期C、E 組腫瘤體積減小,提示扶正口服液可能通過減小腫瘤體積緩解CC。 通過RT-PCR、Western blot 法檢測組織蛋白、mRNA 的表達發(fā)現(xiàn):ERSIA 主要通路蛋白CHOP、p-JNK 在D 組較C 組表達下降,在F 組較E 組表達下降;ERAD 途徑的主要通路蛋白XBP-1、Derlin-1、SYVN1 則 在D 組 較C 組 表 達 升 高,XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白在F 組較E 組表達升高。上述結(jié)果提示在CC 過程中,扶正口服液可能通過抑制ERSIA 的促骨骼肌凋亡途徑和促進ERAD 的骨骼肌細胞抗凋亡途徑,糾正“ERAD-ERSIA 失衡”而改善CC 狀態(tài)。
同時,本研究團隊發(fā)現(xiàn)扶正口服液干預(yù)晚期CC 優(yōu)于早期CC。中醫(yī)認(rèn)為,腫瘤初期,正氣未虛,瘀毒邪氣內(nèi)盛,此時當(dāng)以驅(qū)邪為主[17-19]。 若此時重用健脾益腎法為主的扶正口服液,則閉門留寇,邪毒更甚,故早期使用扶正口服液干預(yù)CC 無明顯療效優(yōu)勢;腫瘤晚期時,機體邪正俱虛,但正虛更甚,難以驅(qū)邪外出[20-22]。 此時使用扶正口服液以扶正祛邪,用藥切合病機,故晚期扶正口服液干預(yù)CC 的療效明顯。
綜上所述,本研究證實扶正口服液的抗CC 作用及其優(yōu)勢作用時間,初步揭示了ERAD-ERSIA 通路在CC 中的作用。 扶正口服液通過上調(diào)骨骼肌XBP1、IRE1、Derlin-1、SYVN1 蛋白表達激活ERAD通路,下調(diào)CHOP、p-JNK 蛋白表達抑制ERSIA 通路,糾正“ERAD-ERSIA 穩(wěn)態(tài)失衡”是其抗CC 的機制之一。 這為扶正口服液臨床用于改善腫瘤晚期CC提供了支撐,后續(xù)將繼續(xù)對該制劑的藥理機制做深入探索。
湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2022年11期