王理槐,竇 嫻,陳 晟,彭慧婷,何 曉,李涵予,楊 曉,劉 華,孫銀輝*
(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208)
流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,惡性腫瘤目前已是危害我國人民健康的最主要影響因素之一[1-2]。在惡性腫瘤進(jìn)展過程中,癌癥惡病質(zhì)(cancer cachexia, CC)成為惡性腫瘤中晚期的常見并發(fā)癥,發(fā)病率為60%~80%,死亡率則高達(dá)80%,已成為晚期癌癥患者的直接死因之一[3-4]。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)營養(yǎng)支持只能在一定程度上緩解CC,總體療效欠佳。目前,有研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)與CC 骨骼肌萎縮密切相關(guān)[5]。適度的ERS 時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性降解(endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD)通路被激活,有利于細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持存活,但持續(xù)或高強(qiáng)度的ERS 將激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡(endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA)途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。 越來越多的實(shí)驗(yàn)證明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白1(Derlin-1)的表達(dá)與ERS 關(guān)系密切,是調(diào)控細(xì)胞ERSIA 的關(guān)鍵點(diǎn)[7-11]。CC 屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇,久病導(dǎo)致氣血陰陽俱虛,以脾腎不足為主,本著“虛則補(bǔ)之、損則益之”的治則,CC 的治療當(dāng)著重脾腎雙補(bǔ)、氣血同調(diào)[12-13]。 本課題組運(yùn)用湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑扶正口服液治療CC,療效滿意并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。 本研究以Derlin-1 介導(dǎo)的ERAD-ERSIA通路為研究切入點(diǎn),通過體外培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)并使用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(CT26)代謝液制備C2C12萎縮模型,給予扶正口服液含藥血清干預(yù),從細(xì)胞、分子水平,初步探究扶正口服液改善CC 的可能作用機(jī)制。
C2C12(品系:C3H,批號:CL-0044)細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司;CT26(品系:BALB/c;批號:CL-0071)細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司;BALB/C 小鼠40 只購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,雄性,許可證號SCXK(湘)1019-0014,體質(zhì)量25~30 g,鼠齡8 周。
1.2.1 主要試劑 總RNA 提取試劑盒(批號:R1200)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(批號:PC0020)、30%制膠液(批號:A1010)均來自索萊寶生物技術(shù)有限公司;通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:11141ES60)、RT-PCR熒光定量試劑盒(批號:11201ES08)均來自翊圣生物科技有限公司;TEMED(批號:Amresc00761)來自卡邁舒(上海)生物科技公司;蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(批號:P1045)來自碧云天生物技術(shù)研究所;SYVN1(批號:DF12235)、IRE1(批號:DF7709)、XBP1(批號:AF5110)、DDIT3(批號:DF6025)、p-JNK(批號:AF3318)均來自江蘇親科生物研究中心有限公司;Derlin-1(批號:Ab176732)來自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;羊抗兔-HRP(批號:bs-0295G-HRP)來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;扶正口服液(批號:20210518)來自湖南中醫(yī)醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。
1.2.2 主要儀器 電泳儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司,型號:1645070];電轉(zhuǎn)儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司,型號:BE6085];pH 計[梅特勒托利多科技(上海)有限公司,型號:LP115];酶標(biāo)儀(美國博騰儀器有限公司,型號:800TS);全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海醫(yī)療器械,型號:5200);臺式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械,型號:80-2);RT-PCR 儀(蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司,型號:MA-6000);核酸檢測儀(杭州遂真生物技術(shù)有限公司,型號:F-1100)。
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按照細(xì)胞培養(yǎng)方法(84%DMEM培養(yǎng)基、15%胎牛血清及1%青-鏈霉素)進(jìn)行培養(yǎng)傳代,并于37 ℃、5%CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)C2C12 細(xì)胞、CT26 細(xì)胞,完全培養(yǎng)基成分配比為89%RPMI-1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%PB 雙抗,將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2、95%濕度)中培養(yǎng),隔1 天換液1 次。 細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底約90%時,PBS 沖洗后胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
1.3.2 肌細(xì)胞萎縮模型建立 利用CT26 誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞萎縮[1],用源CT26 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理C2C12 細(xì)胞,收集CT26 細(xì)胞的代謝液備用。 棄C2C12 細(xì)胞上清液,用PBS 清洗1 次,加入70%CT26 細(xì)胞濾后代謝液+30%C2C12 完全培養(yǎng)基,48 h后于倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài),可觀察到肌管細(xì)胞萎縮現(xiàn)象,提示模型制備成功。
1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用于敲除Derlin-1 的靶序列(表1),針對Derlin-1 和陰性對照干擾RNA(siRNA)委托吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。 轉(zhuǎn)染前1 天,將C2C12細(xì)胞傳入24 孔板,5×104個/孔,加入完全培養(yǎng)基,50 μL/孔,待轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合達(dá)到30%~50%時進(jìn)行慢病毒感染。稀釋病毒,稀釋濃度為1×108個/mL。病毒懸液加完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,稀釋病毒懸液、完全培養(yǎng)基、感染A 液配制成完全液感染病毒,按照每孔20 μL加入24 孔板中,按同樣的方法同時進(jìn)行陰性對照組的感染,感染24 h 后更換完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞后行Western blot 和RT-PCR 檢測Derlin-1蛋白及其mRNA 表達(dá)。
1.3.4 制備含藥血清 將40 只BALB/C 小鼠,隨機(jī)分成空白血清組和含藥血清組,每組20 只。 含藥血清組以扶正口服液灌胃,60 kg 給藥量為30 mL/d,根據(jù)人和小鼠的等效計量比[小鼠作用用藥劑量=30×9.1×(30 mL/60 kg)],小鼠給藥量為136.5 mL/(kg·d);空白血清組以同等劑量生理鹽水灌胃。灌胃1 次/d,持續(xù)7 d,第7 天灌胃1 h 后,眼眶靜脈叢采血,采集的各組血液保存于4 ℃冰箱,24 h 內(nèi)以4 ℃、3000 r/min、半徑8 cm 離心15 min,用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,無菌試管分裝并標(biāo)記組別及日期,放置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。
1.3.5 分組干預(yù) 將含有Derlin-1 慢病毒穩(wěn)定感染的C2C12 傳代細(xì)胞和空載細(xì)胞以5×104個/cm2的密度接種在6 孔板,分為空載組(A 組)、沉默組(B組)、惡病質(zhì)+空載體+對照血清組(C 組)、惡病質(zhì)+空載體+含藥血清組(D 組)、惡病質(zhì)+沉默+含藥血清組(E 組)。 24 h 后PBS 洗滌3 次后,A、B 組加入普通培養(yǎng)基,在C、D、E 組分加入含有CT26 細(xì)胞條件培養(yǎng)基,培養(yǎng)96 h 即可構(gòu)建惡病質(zhì)細(xì)胞萎縮模型。96 h 換液后在A、B、C 組加入8%空白血清培養(yǎng)基,D、E 組加入8%含藥血清培養(yǎng)基,每組3 個復(fù)孔,在加藥后36 h 收取細(xì)胞,用于指標(biāo)測定。
1.4.1 RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) 用TRIzol 試劑提取組織或細(xì)胞中的RNA,用Bio-Rad 的ScriptcDNAsynthesis 試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。
mRNA 定量使用Qiagen 公司的QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒,循環(huán)條件為:95 ℃15 min 進(jìn)行45 個循環(huán),每個再進(jìn)行94 ℃15 s、57.5 ℃20 s、72 ℃20 s。測定結(jié)果分析使用Phafl 方法,計算基因表達(dá)的相對拷貝數(shù)。 引物設(shè)計見表1。
表1 引物列表
1.4.2 Western blot 檢測蛋白相對表達(dá) 在RIPA裂解緩沖液中提取來自細(xì)胞的總蛋白,并使用Bradford方法進(jìn)行定量。 通過SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜,并在4 ℃下與用1% BSA 封閉液稀釋相應(yīng)的一抗,使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中,4 ℃孵育過夜。稀釋倍數(shù)如下:GAPDH 1∶10 000 稀釋、Derlin-1 1∶2000 稀釋、p-JNK 1∶2000 稀釋、CHOP 1∶500 稀釋、XBP1 1∶1000 稀釋、SYVN1 1∶2000 稀釋,用封閉液稀釋HRP 標(biāo)記二抗1∶5000 稀釋與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在37 ℃溫育2 h。使用ECL 試劑盒顯現(xiàn)PVDF 膜上的靶蛋白,曝光結(jié)果使用Image J軟件分析灰度值。
1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6 孔板,待細(xì)胞長至70%融合后分別加入空載siRNA 和Derlin-1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后48 h,C、D、E 組加入70% CT26 細(xì)胞濾后代謝液+30% C2C12 完全培養(yǎng)基,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h 后,C 組加入對照血清,D、E 組加入含藥血清,24 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞,PBS 離心洗滌2 次,用400 μL Binding Buffer 懸浮,加5 μL Annexin VFITC,混勻,加5 μL 碘化丙啶混勻,室溫避光10 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料數(shù)據(jù)用“±s”表示。 若符合參數(shù)檢驗(yàn)條件,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用SNK-q 檢驗(yàn);若不符合參數(shù)檢驗(yàn)條件,兩獨(dú)立樣本采用近似t 檢驗(yàn),兩兩比較用秩和檢驗(yàn)法。 均以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與A 組比較,B 組熒光表達(dá)減弱(P<0.05)(圖1A);與A 組比較,B 組Derlin-1 蛋白及其mRNA表達(dá)亦降低(P<0.05)(圖1B、1C)。
圖1 熒光顯微鏡下C2C12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、Derlin-1 蛋白及其mRNA 表達(dá)比較
與A 組比較,B、C、D 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降(P<0.05),E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與B 組比較,C 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降(P<0.05),D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與C 組比較,D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與D 組比較,E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。 詳見圖2。
圖2 C2C12 細(xì)胞各組中Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)比較
與A 組比較,B、C、D、E 組凋亡率明顯上升(P<0.05);與B 組比較,C、D、E 組凋亡率下降(P<0.05);與C 組比較,D、E 組凋亡率下降(P<0.05);與D 組比較,E 組凋亡率下降(P<0.05)。 詳見圖3。
圖3 各組C2C12 細(xì)胞凋亡率比較
與A 組比較,B、C、D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與B 組比較,C組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)升高(P<0.05),D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)下降(P<0.05);與C 組比較,D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)下降(P<0.05);與D組比較,E 組p-JNK 蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。 詳見圖4。
圖4 各組C2C12 細(xì)胞中CHOP、p-JNK mRNA 及其蛋白表達(dá)比較
與A 組比較,B 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降(P<0.05),C、D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與B 組比較,C、D、E組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與C 組比較,D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與D 組比較,E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。 詳見圖5。
圖5 各組c2c12 細(xì)胞中SYVN1、XBPB1 mRNA 及其蛋白表達(dá)比較
CC 是一種破壞性、多因素且通常不可逆的綜合征,根據(jù)腫瘤類型的不同,它會影響50%~80%的癌癥患者,導(dǎo)致大量患者的體質(zhì)量減輕,影響后續(xù)抗癌治療的依從性。 迄今為止,尚無有效的干預(yù)措施完全逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)。 因此,探索CC 潛在的分子機(jī)制尋求有效的干預(yù)策略有重要意義[14]。 骨骼肌萎縮被認(rèn)為是CC 發(fā)生發(fā)展的重要原因之一,因此,探索改善癌性肌肉萎縮的線粒體機(jī)制,尋求干預(yù)肌肉萎縮作用靶點(diǎn)的有效藥物得以引起研究者們的重視。目前的研究提示,中醫(yī)藥可通過促進(jìn)線粒體生成和改善線粒體氧化磷酸化功能改善癌因性肌肉萎縮[15]。
《素問·至真要大論》中有“諸濕腫滿,皆屬于脾”,在癌癥后期,臟腑功能受損,水谷精微生成運(yùn)化功能失常,對肌肉供養(yǎng)不足,痰、飲、濕、瘀等病理產(chǎn)物停聚,再作為病理因素作用于機(jī)體,形成惡性循環(huán),正所謂“百病皆由脾胃衰而生”。夏孟蛟等[16]認(rèn)為CC 的關(guān)鍵病機(jī)是“寒濕入營”,大病后期,脾腎陽氣均虛,陰寒內(nèi)生,濕阻經(jīng)絡(luò),深入探究了陽氣在CC發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵地位,強(qiáng)調(diào)化氣溫陽是治療的重要治則。張媛等[17]認(rèn)為癌癥后期正虛邪實(shí)并存,不忘陰虛合并血瘀這一特殊證型,強(qiáng)調(diào)以養(yǎng)陰填精、活血化瘀為主的治法,破除陰虛與血瘀互為因果的惡性循環(huán),改善患者生活質(zhì)量。因此,中醫(yī)治療CC的關(guān)鍵在于固護(hù)正氣、健脾補(bǔ)腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血。 在此指導(dǎo)下,本科室運(yùn)用院內(nèi)制劑扶正口服液在臨床上干預(yù)CC 獲得了一定療效,本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,在CT26 細(xì)胞誘導(dǎo)的C2C12 肌細(xì)胞萎縮模型中,經(jīng)扶正口服液的干預(yù),能夠明顯減緩C2C12 細(xì)胞的萎縮。
近年來研究發(fā)現(xiàn),Derlin-1 的表達(dá)異常與腫瘤等多種疾病相關(guān),肺癌中的研究也提示Derlin-1 可在61.86%的非小細(xì)胞肺癌中表達(dá),并與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤的TNM 分期有關(guān),Derlin-1 的高度表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]。 DONG 等[19]注意到Derlin-1 在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá),免疫沉淀證實(shí)Derlin-1 通過EGFR-ERK 介導(dǎo)的MMP-2 和MMP-9上調(diào)促進(jìn)侵襲,進(jìn)一步的分析提示Derlin-1 過表達(dá)誘導(dǎo)EGFR 磷酸化。目前,研究已表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與Derlin-1 的確存在一定的聯(lián)系,又有研究發(fā)現(xiàn),Derlin-1 在過表達(dá)后,UPR 激活的程度降低,Bip 表達(dá)降低,XBP1 拼接形式(XBP1s)減少和XBP1 非拼接形式(XBP1u)表達(dá)增加[20]。
本研究結(jié)果顯示,沉默C2C12 中Derlin-1 基因后,肌細(xì)胞萎縮明顯,且細(xì)胞中CHOP、p-JNK 表達(dá)升高,XBP1、SYVN1 表達(dá)降低,而采用扶正口服液含藥血清干預(yù)后,C2C12 細(xì)胞中CHOP、p-JNK 蛋白表達(dá)降低,XBP1、SYVN1 表達(dá)升高。 以上結(jié)果提示Derlin-1 可通過下調(diào)肌細(xì)胞中CHOP、p-JNK,上調(diào)XBP1、SYVN1 而減輕CT26 誘導(dǎo)的C2C12 肌細(xì)胞萎縮凋亡,這可能與Derlin-1 參與調(diào)控ERS 信號通路有關(guān)。 扶正口服液可能是通過上調(diào)ERAD 核心蛋白Derlin-1 的表達(dá)而發(fā)揮干預(yù)CC 的作用,為“固護(hù)正氣、健脾補(bǔ)腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血”的扶正口服液治療CC的功效提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù),為臨床上治療CC 提供新的思路。