扶正口服液通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑改善癌癥惡病質(zhì)肌肉萎縮的機(jī)制研究

王理槐，竇 嫻，陳 晟，彭慧婷，何 曉，李涵予，楊 曉，劉 華，孫銀輝*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤目前已是危害我國人民健康的最主要影響因素之一[1-2]。在惡性腫瘤進(jìn)展過程中，癌癥惡病質(zhì)（cancer cachexia, CC）成為惡性腫瘤中晚期的常見并發(fā)癥，發(fā)病率為60%～80%，死亡率則高達(dá)80%，已成為晚期癌癥患者的直接死因之一[3-4]。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)營養(yǎng)支持只能在一定程度上緩解CC，總體療效欠佳。目前，有研究認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）與CC 骨骼肌萎縮密切相關(guān)[5]。適度的ERS 時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性降解（endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD）通路被激活，有利于細(xì)胞恢復(fù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持存活，但持續(xù)或高強(qiáng)度的ERS 將激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡（endoplasmic reticulum stress induced apoptosis, ERSIA）途徑導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。 越來越多的實(shí)驗(yàn)證明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解蛋白1（Derlin-1）的表達(dá)與ERS 關(guān)系密切，是調(diào)控細(xì)胞ERSIA 的關(guān)鍵點(diǎn)[7-11]。CC 屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇，久病導(dǎo)致氣血陰陽俱虛，以脾腎不足為主，本著“虛則補(bǔ)之、損則益之”的治則，CC 的治療當(dāng)著重脾腎雙補(bǔ)、氣血同調(diào)[12-13]。 本課題組運(yùn)用湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑扶正口服液治療CC，療效滿意并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探索。 本研究以Derlin-1 介導(dǎo)的ERAD-ERSIA通路為研究切入點(diǎn)，通過體外培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞（C2C12）并使用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT26）代謝液制備C2C12萎縮模型，給予扶正口服液含藥血清干預(yù)，從細(xì)胞、分子水平，初步探究扶正口服液改善CC 的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物

C2C12（品系：C3H，批號：CL-0044）細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CT26（品系：BALB/c；批號：CL-0071）細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；BALB/C 小鼠40 只購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，雄性，許可證號SCXK（湘）1019-0014，體質(zhì)量25～30 g，鼠齡8 周。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 總RNA 提取試劑盒（批號：R1200）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020）、30%制膠液（批號：A1010）均來自索萊寶生物技術(shù)有限公司；通用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：11141ES60）、RT-PCR熒光定量試劑盒（批號：11201ES08）均來自翊圣生物科技有限公司；TEMED（批號：Amresc00761）來自卡邁舒（上海）生物科技公司；蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號：P1045）來自碧云天生物技術(shù)研究所；SYVN1（批號：DF12235）、IRE1（批號：DF7709）、XBP1（批號：AF5110）、DDIT3（批號：DF6025）、p-JNK（批號：AF3318）均來自江蘇親科生物研究中心有限公司；Derlin-1（批號：Ab176732）來自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；羊抗兔-HRP（批號：bs-0295G-HRP）來自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；扶正口服液（批號：20210518）來自湖南中醫(yī)醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科。

1.2.2 主要儀器 電泳儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司，型號：1645070]；電轉(zhuǎn)儀[安諾倫(北京)生物科技有限公司，型號：BE6085]；pH 計[梅特勒托利多科技（上海）有限公司，型號：LP115]；酶標(biāo)儀（美國博騰儀器有限公司，型號：800TS）；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海醫(yī)療器械，型號：5200）；臺式低速離心機(jī)（上海醫(yī)療器械，型號：80-2）；RT-PCR 儀（蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司，型號：MA-6000）；核酸檢測儀（杭州遂真生物技術(shù)有限公司，型號：F-1100）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按照細(xì)胞培養(yǎng)方法（84%DMEM培養(yǎng)基、15%胎牛血清及1%青-鏈霉素）進(jìn)行培養(yǎng)傳代，并于37 ℃、5%CO2、95%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)C2C12 細(xì)胞、CT26 細(xì)胞，完全培養(yǎng)基成分配比為89%RPMI-1640 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%PB 雙抗，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、95%濕度）中培養(yǎng)，隔1 天換液1 次。 細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底約90%時，PBS 沖洗后胰酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.2 肌細(xì)胞萎縮模型建立 利用CT26 誘導(dǎo)C2C12 細(xì)胞萎縮[1]，用源CT26 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理C2C12 細(xì)胞，收集CT26 細(xì)胞的代謝液備用。 棄C2C12 細(xì)胞上清液，用PBS 清洗1 次，加入70%CT26 細(xì)胞濾后代謝液+30%C2C12 完全培養(yǎng)基，48 h后于倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)，可觀察到肌管細(xì)胞萎縮現(xiàn)象，提示模型制備成功。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用于敲除Derlin-1 的靶序列（表1），針對Derlin-1 和陰性對照干擾RNA（siRNA）委托吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。 轉(zhuǎn)染前1 天，將C2C12細(xì)胞傳入24 孔板，5×104個/孔，加入完全培養(yǎng)基，50 μL/孔，待轉(zhuǎn)染時細(xì)胞融合達(dá)到30%～50%時進(jìn)行慢病毒感染。稀釋病毒，稀釋濃度為1×108個/mL。病毒懸液加完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，稀釋病毒懸液、完全培養(yǎng)基、感染A 液配制成完全液感染病毒，按照每孔20 μL加入24 孔板中，按同樣的方法同時進(jìn)行陰性對照組的感染，感染24 h 后更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后行Western blot 和RT-PCR 檢測Derlin-1蛋白及其mRNA 表達(dá)。

1.3.4 制備含藥血清 將40 只BALB/C 小鼠，隨機(jī)分成空白血清組和含藥血清組，每組20 只。 含藥血清組以扶正口服液灌胃，60 kg 給藥量為30 mL/d，根據(jù)人和小鼠的等效計量比[小鼠作用用藥劑量=30×9.1×（30 mL/60 kg）]，小鼠給藥量為136.5 mL/（kg·d）；空白血清組以同等劑量生理鹽水灌胃。灌胃1 次/d，持續(xù)7 d，第7 天灌胃1 h 后，眼眶靜脈叢采血，采集的各組血液保存于4 ℃冰箱，24 h 內(nèi)以4 ℃、3000 r/min、半徑8 cm 離心15 min，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，無菌試管分裝并標(biāo)記組別及日期，放置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.5 分組干預(yù) 將含有Derlin-1 慢病毒穩(wěn)定感染的C2C12 傳代細(xì)胞和空載細(xì)胞以5×104個/cm2的密度接種在6 孔板，分為空載組（A 組）、沉默組（B組）、惡病質(zhì)+空載體+對照血清組（C 組）、惡病質(zhì)+空載體+含藥血清組（D 組）、惡病質(zhì)+沉默+含藥血清組（E 組）。 24 h 后PBS 洗滌3 次后，A、B 組加入普通培養(yǎng)基，在C、D、E 組分加入含有CT26 細(xì)胞條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h 即可構(gòu)建惡病質(zhì)細(xì)胞萎縮模型。96 h 換液后在A、B、C 組加入8%空白血清培養(yǎng)基，D、E 組加入8%含藥血清培養(yǎng)基，每組3 個復(fù)孔，在加藥后36 h 收取細(xì)胞，用于指標(biāo)測定。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 RT-PCR 檢測mRNA 表達(dá) 用TRIzol 試劑提取組織或細(xì)胞中的RNA，用Bio-Rad 的ScriptcDNAsynthesis 試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。

mRNA 定量使用Qiagen 公司的QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒，循環(huán)條件為：95 ℃15 min 進(jìn)行45 個循環(huán)，每個再進(jìn)行94 ℃15 s、57.5 ℃20 s、72 ℃20 s。測定結(jié)果分析使用Phafl 方法，計算基因表達(dá)的相對拷貝數(shù)。 引物設(shè)計見表1。

表1 引物列表

1.4.2 Western blot 檢測蛋白相對表達(dá) 在RIPA裂解緩沖液中提取來自細(xì)胞的總蛋白，并使用Bradford方法進(jìn)行定量。 通過SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，并在4 ℃下與用1% BSA 封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育過夜。稀釋倍數(shù)如下：GAPDH 1∶10 000 稀釋、Derlin-1 1∶2000 稀釋、p-JNK 1∶2000 稀釋、CHOP 1∶500 稀釋、XBP1 1∶1000 稀釋、SYVN1 1∶2000 稀釋，用封閉液稀釋HRP 標(biāo)記二抗1∶5000 稀釋與過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在37 ℃溫育2 h。使用ECL 試劑盒顯現(xiàn)PVDF 膜上的靶蛋白，曝光結(jié)果使用Image J軟件分析灰度值。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞長至70%融合后分別加入空載siRNA 和Derlin-1 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 轉(zhuǎn)染后48 h，C、D、E 組加入70% CT26 細(xì)胞濾后代謝液+30% C2C12 完全培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h 后，C 組加入對照血清，D、E 組加入含藥血清，24 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 離心洗滌2 次，用400 μL Binding Buffer 懸浮，加5 μL Annexin VFITC，混勻，加5 μL 碘化丙啶混勻，室溫避光10 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料數(shù)據(jù)用“±s”表示。 若符合參數(shù)檢驗(yàn)條件，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q 檢驗(yàn);若不符合參數(shù)檢驗(yàn)條件，兩獨(dú)立樣本采用近似t 檢驗(yàn)，兩兩比較用秩和檢驗(yàn)法。 均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C2C12 細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)染后Derlin-1 表達(dá)

與A 組比較，B 組熒光表達(dá)減弱（P＜0.05）（圖1A）；與A 組比較，B 組Derlin-1 蛋白及其mRNA表達(dá)亦降低（P＜0.05）（圖1B、1C）。

圖1 熒光顯微鏡下C2C12 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、Derlin-1 蛋白及其mRNA 表達(dá)比較

2.2 各組Derlin-1 表達(dá)及C2C12 細(xì)胞凋亡比較

與A 組比較，B、C、D 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與B 組比較，C 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與D 組比較，E 組Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。 詳見圖2。

圖2 C2C12 細(xì)胞各組中Derlin-1 mRNA 及其蛋白表達(dá)比較

與A 組比較，B、C、D、E 組凋亡率明顯上升（P＜0.05）；與B 組比較，C、D、E 組凋亡率下降（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組凋亡率下降（P＜0.05）；與D 組比較，E 組凋亡率下降（P＜0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組C2C12 細(xì)胞凋亡率比較

2.3 各組細(xì)胞中CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)比較

與A 組比較，B、C、D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與B 組比較，C組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組CHOP mRNA 及其蛋白、p-JNK 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與D組比較，E 組p-JNK 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組C2C12 細(xì)胞中CHOP、p-JNK mRNA 及其蛋白表達(dá)比較

2.4 各組細(xì)胞中SYVN1、XBP1 mRNA 及其蛋白表達(dá)比較

與A 組比較，B 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），C、D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與B 組比較，C、D、E組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與C 組比較，D、E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與D 組比較，E 組XBP1、SYVN1 mRNA 及其蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組c2c12 細(xì)胞中SYVN1、XBPB1 mRNA 及其蛋白表達(dá)比較

3 討論

CC 是一種破壞性、多因素且通常不可逆的綜合征，根據(jù)腫瘤類型的不同，它會影響50%～80%的癌癥患者，導(dǎo)致大量患者的體質(zhì)量減輕，影響后續(xù)抗癌治療的依從性。 迄今為止，尚無有效的干預(yù)措施完全逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)。 因此，探索CC 潛在的分子機(jī)制尋求有效的干預(yù)策略有重要意義[14]。 骨骼肌萎縮被認(rèn)為是CC 發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，因此，探索改善癌性肌肉萎縮的線粒體機(jī)制，尋求干預(yù)肌肉萎縮作用靶點(diǎn)的有效藥物得以引起研究者們的重視。目前的研究提示，中醫(yī)藥可通過促進(jìn)線粒體生成和改善線粒體氧化磷酸化功能改善癌因性肌肉萎縮[15]。

《素問·至真要大論》中有“諸濕腫滿，皆屬于脾”，在癌癥后期，臟腑功能受損，水谷精微生成運(yùn)化功能失常，對肌肉供養(yǎng)不足，痰、飲、濕、瘀等病理產(chǎn)物停聚，再作為病理因素作用于機(jī)體，形成惡性循環(huán)，正所謂“百病皆由脾胃衰而生”。夏孟蛟等[16]認(rèn)為CC 的關(guān)鍵病機(jī)是“寒濕入營”，大病后期，脾腎陽氣均虛，陰寒內(nèi)生，濕阻經(jīng)絡(luò)，深入探究了陽氣在CC發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵地位，強(qiáng)調(diào)化氣溫陽是治療的重要治則。張媛等[17]認(rèn)為癌癥后期正虛邪實(shí)并存，不忘陰虛合并血瘀這一特殊證型，強(qiáng)調(diào)以養(yǎng)陰填精、活血化瘀為主的治法，破除陰虛與血瘀互為因果的惡性循環(huán)，改善患者生活質(zhì)量。因此，中醫(yī)治療CC的關(guān)鍵在于固護(hù)正氣、健脾補(bǔ)腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血。 在此指導(dǎo)下，本科室運(yùn)用院內(nèi)制劑扶正口服液在臨床上干預(yù)CC 獲得了一定療效，本次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在CT26 細(xì)胞誘導(dǎo)的C2C12 肌細(xì)胞萎縮模型中，經(jīng)扶正口服液的干預(yù)，能夠明顯減緩C2C12 細(xì)胞的萎縮。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Derlin-1 的表達(dá)異常與腫瘤等多種疾病相關(guān)，肺癌中的研究也提示Derlin-1 可在61.86%的非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)，并與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤的TNM 分期有關(guān)，Derlin-1 的高度表達(dá)與癌癥患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[18]。 DONG 等[19]注意到Derlin-1 在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)，免疫沉淀證實(shí)Derlin-1 通過EGFR-ERK 介導(dǎo)的MMP-2 和MMP-9上調(diào)促進(jìn)侵襲，進(jìn)一步的分析提示Derlin-1 過表達(dá)誘導(dǎo)EGFR 磷酸化。目前，研究已表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)與Derlin-1 的確存在一定的聯(lián)系，又有研究發(fā)現(xiàn)，Derlin-1 在過表達(dá)后，UPR 激活的程度降低，Bip 表達(dá)降低，XBP1 拼接形式（XBP1s）減少和XBP1 非拼接形式（XBP1u）表達(dá)增加[20]。

本研究結(jié)果顯示，沉默C2C12 中Derlin-1 基因后，肌細(xì)胞萎縮明顯，且細(xì)胞中CHOP、p-JNK 表達(dá)升高，XBP1、SYVN1 表達(dá)降低，而采用扶正口服液含藥血清干預(yù)后，C2C12 細(xì)胞中CHOP、p-JNK 蛋白表達(dá)降低，XBP1、SYVN1 表達(dá)升高。 以上結(jié)果提示Derlin-1 可通過下調(diào)肌細(xì)胞中CHOP、p-JNK，上調(diào)XBP1、SYVN1 而減輕CT26 誘導(dǎo)的C2C12 肌細(xì)胞萎縮凋亡，這可能與Derlin-1 參與調(diào)控ERS 信號通路有關(guān)。 扶正口服液可能是通過上調(diào)ERAD 核心蛋白Derlin-1 的表達(dá)而發(fā)揮干預(yù)CC 的作用，為“固護(hù)正氣、健脾補(bǔ)腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血”的扶正口服液治療CC的功效提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，為臨床上治療CC 提供新的思路。