玉郎傘多糖對(duì)S180 荷瘤小鼠氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)及血管生成的影響

覃 妮，陸世銀，羅文婷，陳家豪，龍嘉怡，黃仁彬*

[1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院（柳州市壯醫(yī)醫(yī)院）藥學(xué)部，廣西 柳州 545026；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021]

玉朗傘（Yulangsan, YLS）為蝶形花科植物疏葉崖豆[Millettia pulchra Kurz var－laxior (Dunn) Z. Wei]的塊根。 玉郎傘多糖(Yulangsan polysaccharides,YLSPS)是從塊根中提取的多糖組分，具有祛瘀止痛、消癰排膿、清熱解毒等功效[1-2]。 現(xiàn)代藥理研究表明，YLSPS 具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性[3-4]，其抗腫瘤潛力已得到證實(shí)[5-6]。 然而，YLSPS 對(duì)腫瘤血管生成的影響及作用機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道較少。腫瘤血管形成是腫瘤增殖、侵襲和遷移的基礎(chǔ)，結(jié)合YLSPS 具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能的前期研究結(jié)果[7-8]，本研究通過(guò)建立小鼠S180移植瘤模型，從腫瘤免疫、氧化應(yīng)激和血管生成的角度探討YLSPS 的抑瘤作用機(jī)制，為其抗腫瘤機(jī)制研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

ACB-4A1 型超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO 公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士梅托勒公司）；MULTISKAN MK3 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、CKX-41 型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)奧林巴斯公司）；Micro CL17R型高速低溫離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；TDL-5A 型臺(tái)式離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器公司）；TU-1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器公司）；4590 型包埋機(jī)（日本SAKURA精密技術(shù)公司）；RM223 型5 病理組織切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）；SIM-F140AY65-PC 型顆粒制冰機(jī)（日本松下電器）；HH-8 型電熱恒溫水浴鍋（上海汗諾儀器公司）；CD-UPH-II-20L 型超純水器（成都越純科技公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌雄各半昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0002。

1.3 細(xì)胞株

小鼠肉瘤S180細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室提供，并定期進(jìn)行腹腔接種傳代保株。

1.4 藥物與試劑

藥品YLSPS（批號(hào)：YLS20210312619），由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供；注射用環(huán)磷酰胺（批號(hào)：5J078A），購(gòu)自德國(guó)Baxter Oncology GmbH。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD，批號(hào)：20210401）、谷胱甘肽過(guò)氧化物（glutathione peroxidase, GSHPX，批號(hào)：20210328）活性，丙二醛（malondialdehyde,MDA，批號(hào)：20210401）及過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT，批號(hào)：20210330）的含量、考馬斯亮蘭（批號(hào)：20210219）檢測(cè)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；VEGF ELISA 試劑盒（批號(hào)：ab222510）購(gòu)自欣博盛公司；Anti-CD34 antibody（批號(hào)：ab81289），購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。

2 方法

2.1 YLSPS 的制備[9]

將干燥YLS 粉碎后，加8 倍量的純水煎煮，趁熱過(guò)濾取濾液，離心取上清液，加入95%乙醇適量與所得上清液混合，使乙醇終濃度為80%，再用無(wú)水乙醇、丙酮萃取洗滌5 次，Sevage 法去除蛋白，上清液經(jīng)透析后濃縮，加5 倍無(wú)水乙醇，水溶解后再醇析，重復(fù)3 次，直至280、260 nm 波長(zhǎng)處無(wú)雜蛋白和核酸吸收峰為止，過(guò)濾，收集沉淀物，真空干燥得多糖干粉（含生藥量26.64 g·g-1）。

2.2 S180 移植瘤模型的建立與給藥

將S180細(xì)胞在無(wú)菌條件下接種于健康小鼠腹腔，待腹水生長(zhǎng)旺盛時(shí)，抽出乳白色腹水，用生理鹽水按1∶10 稀釋后以臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)存活率＞90%，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107·mL-1。 取60只小鼠，每只于右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL 細(xì)胞懸液，隔日觀察瘤體生長(zhǎng)情況，當(dāng)皮下移植瘤長(zhǎng)至直徑約5 mm時(shí)為造模成功。 將造模成功的小鼠隨機(jī)分為5組（n=10）：模型組每天灌胃等體積的生理鹽水；CTX組為陽(yáng)性對(duì)照腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）20 mg·kg-1·d-1；YLSPS 低、中、高劑量組灌胃給藥依次為150、300、600 mg·kg-1·d-1。 連續(xù)給藥8 d。

2.3 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)及腫瘤生長(zhǎng)的影響

觀察每組小鼠給藥后的體質(zhì)量、活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、皮毛色澤等。 末次給藥24 h 后，稱量小鼠體質(zhì)量，摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出S180 肉瘤、胸腺、脾臟，用濾紙吸干殘血后，分別精確稱量并記錄，并分別計(jì)算抑瘤率與臟器指數(shù)（脾臟、胸腺）。 抑瘤率＝（腫瘤模型組的平均瘤重－給藥組的平均瘤重）／腫瘤模型組的平均瘤重×100%。 臟器指數(shù)＝臟器重量（mg）／體質(zhì)量（g）。

2.4 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠血清生化指標(biāo)水平的影響

將取得的小鼠血液，室溫靜置后離心（離心半徑10 cm，3500 r/min，15 min）取上清液并按試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)血清中SOD、GSH-PX、CAT、MDA 和VEGF 含量進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 HE 染色觀察YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠的病理學(xué)的改變

取適量腫瘤組織置于10%甲醛固定24 h，經(jīng)組織脫水、透明，石蠟包埋制片，3 μm 連續(xù)切片以二甲苯脫蠟，梯度乙醇浸泡水化后，浸泡于水中，然后進(jìn)行HE 染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察、比較腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化。

2.6 免疫組化法檢測(cè)YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠瘤組織內(nèi)微血管密度的影響

腫瘤組織切片經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)后，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書分別滴加CD34 鼠抗單克隆抗體和二抗，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片、鏡下觀察。 CD34 陽(yáng)性血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕色或棕黃色，相互分離的內(nèi)皮細(xì)胞且無(wú)顯著管腔或由內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔，當(dāng)管腔小于8個(gè)紅細(xì)胞面積者即為微血管，先低倍光鏡下（100×）選擇微血管密集的腫瘤區(qū)域，然后通過(guò)高倍鏡下（400×）隨機(jī)計(jì)數(shù)3 個(gè)視野內(nèi)所有染色的微血管數(shù)，平均值作為微血管密度（microvessel density, MVD）。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有資料均作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“±s”表示，用單因素方差分析結(jié)果。 多組間比較采用方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)與腫瘤抑制的影響

各組小鼠接種S180細(xì)胞后1 周腫瘤直徑約為5 mm，小鼠精神萎靡，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)干枯蓬松，腫瘤生長(zhǎng)迅速，各給藥組有不同程度的緩解。如表1 所示，CTX 組抑瘤率為73.83%，YLSPS 低、中、高劑量組的抑瘤率分別為34.75%、47.46%和58.78%。 與模型組比較，各給藥組均可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)（P＜0.001）。此外，CTX 組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯下降，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。YLSPS 各劑量組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與模型組比較均具有增高的趨勢(shì)，且高、中劑量組尤為顯著（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見(jiàn)表1。

表1 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤抑制、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠體質(zhì)量及腫瘤抑制、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量體質(zhì)量/g 27.78±0.78 27.09±1.11 26.28±1.03 26.77±0.89 28.52±0.93胸腺指數(shù)/（mg·g-1）2.92±0.32 0.97±0.25***2.99±0.55 3.21±0.78*3.63±0.45***脾臟指數(shù)/（mg·g-1）4.78±0.56 2.95±0.49***4.87±0.74 5.11±0.55*5.70±0.37***瘤重/g 1.51±0.45 0.39±0.09***0.98±0.16***0.79±0.22***0.67±0.16***抑瘤率/%—73.83 34.75 47.46 58.78

3.2 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠血清生化指標(biāo)水平的影響

與模型組比較，YLSPS 各劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.001），YLSPS 低劑量組有提高GSH-Px、CAT 活性的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而中、高劑量組GSH-Px、CAT 活性明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）。相較于模型組，YLSPS 中、高劑量組中MDA 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.001）。與模型組比較，CTX 組小鼠血清SOD 活性升高（P＜0.05），而GSH-Px、CAT 活性呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)，MDA 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見(jiàn)表2。

表2 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影響（±s，n=10）

表2 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠血清GSH-Px、CAT、SOD、MDA 水平的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05,***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量MDA/（nmol·mL-1）5.64±0.49 6.78±0.52***5.49±0.79 5.26±0.63*4.92±0.63***SOD/（U·mL-1）198.17±9.56 208.55±7.79*208.25±9.64*211.12±9.28***213.35±8.60***GSH-Px/（U·mL-1）721.01±11.24 633.85±12.26***734.88±13.03 746.97±21.78*791.54±16.01***CAT/（U·mg-1）369.69±22.81 341.28±14.08*378.34±16.61 424.77±16.46***517.39±13.15***

3.3 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)的影響

模型組中腫瘤細(xì)胞豐富且紊亂分布，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)完整且大小不一，瘤細(xì)胞異型性明顯，呈現(xiàn)病理性核分裂現(xiàn)象。 經(jīng)藥物干預(yù)后，各給藥組腫瘤細(xì)胞及細(xì)胞染色質(zhì)皺縮，異型性降低，病理性核分裂減少，可見(jiàn)散在的與融合成片狀的壞死灶。詳見(jiàn)圖1A。

3.4 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠移植瘤MVD 的影響

模型組腫瘤組織內(nèi)CD34 陽(yáng)性染色的微血管數(shù)量眾多，而經(jīng)藥物干預(yù)后，CTX 組、YLSPS 不同劑量組腫瘤組織內(nèi)CD34 陽(yáng)性染色的微血管數(shù)量較模型組均顯著減少（P＜0.001），提示YLSPS 可減少實(shí)體瘤組織MVD，且YLSPS 對(duì)MVD抑制作用強(qiáng)度呈劑量依賴性，高劑量組與CTX 組作用相當(dāng)。 如表3所示，與模型組相比，CTX 組對(duì)VEGF 表達(dá)具有顯著抑制作用（P＜0.001），而YLSPS 低劑量組有下調(diào)VEGF 表達(dá)的趨勢(shì)，但差異化未達(dá)到顯著水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），YLSPS中、高劑量組對(duì)VEGF 表達(dá)有明顯的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）。 詳見(jiàn)表3 和圖1B。

圖1 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠腫瘤組織病理學(xué)與微血管數(shù)量的影響

表3 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠VEGF 表達(dá)和MVD 的影響（±s，n=10）

表3 YLSPS 對(duì)S180 荷瘤小鼠VEGF 表達(dá)和MVD 的影響（±s，n=10）

注：與模型組比較，*P＜0.05,***P＜0.001。

組別模型組CTX 組YLSPS 低劑量YLSPS 中劑量YLSPS 高劑量MVD/（CD34）43.02±7.19 16.82±3.52***37.10±6.23***21.14±5.81***19.98±5.21***VEGF/(pg·mL-1)21.02±1.13 8.82±0.51***20.10±0.93 18.14±0.85*16.98±0.98***

4 討論

在復(fù)雜的循環(huán)與代謝中，多糖承擔(dān)著能量?jī)?chǔ)存與來(lái)源或結(jié)構(gòu)材料的角色，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和凋亡、免疫功能調(diào)節(jié)、抗氧化、細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸與信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程，發(fā)揮重要的生理功能作用[10]。當(dāng)多糖類與免疫細(xì)胞的表面多糖受體結(jié)合時(shí)，可激活細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)而誘導(dǎo)和調(diào)控免疫反應(yīng)、抑制腫瘤或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[11-12]。 YLSPS 可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。本研究利用小鼠S180移植瘤模型探討YLSPS對(duì)荷瘤小鼠的抑瘤作用，證實(shí)了YLSPS 具有較好的抑制S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。

機(jī)體免疫功能的下降會(huì)加劇腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，而腫瘤的出現(xiàn)也往往導(dǎo)致機(jī)體免疫器官的萎縮和免疫能力的衰弱[13]。其中，胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其指數(shù)可在一定程度上衡量機(jī)體的免疫水平[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)YLSPS 干預(yù)后S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均具有不同程度地回升，呈現(xiàn)劑量依賴性，表明YLSPS 具有改善荷瘤小鼠脾臟和胸腺損傷的作用，提示YLSPS 可能通過(guò)提升機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。

氧化應(yīng)激與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體微環(huán)境處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)自由基代謝紊亂，基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶和生物大分子活性及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理功能異常，最終導(dǎo)致腫瘤[15]。 植物多糖具有直接清除活性氧和提高抗氧化酶活性的作用，從而發(fā)揮抗氧化功效[16]。SOD 作為一種過(guò)氧化物分解酶，是機(jī)體關(guān)鍵的抗氧化防御物質(zhì)，體內(nèi)自由基清除速率隨著SOD 活性的升高而加快。GSH-Px 是體內(nèi)常見(jiàn)的重要催化氧化酶之一，通過(guò)其還原過(guò)氧化物的作用，從而阻斷了脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，部分脂肪酸會(huì)氧化分解為一系列復(fù)雜的化合物，其中就包括MDA，此時(shí)體內(nèi)的MDA 水平顯示了脂質(zhì)過(guò)氧化水平。 正常生理狀況下機(jī)體擁有由GSH-Px、CAT、SOD等抗氧化物酶構(gòu)成的一套完整的抗氧化防御體系，它們?cè)隗w內(nèi)保持動(dòng)態(tài)平衡[17]，而當(dāng)抗氧化防御體系失衡出現(xiàn)異常時(shí)，致使MDA 等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物大量生成并累積，隨后造成細(xì)胞的氧化損傷，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[18]。本研究表明，YLSPS 治療后能明顯上調(diào)S180荷瘤小鼠血清中GSH-Px、CAT 和SOD 水平，下調(diào)MDA 水平。說(shuō)明YLSPS 可通過(guò)提高S180荷瘤小鼠抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和清除自由基等方式抑制荷瘤小鼠機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。提示YLSPS 能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮其抗腫瘤作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)，YLSPS 可抗血管生成[5]，故推測(cè)YLSPS 可能通過(guò)抑制血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用。MVD 是當(dāng)前公認(rèn)評(píng)價(jià)腫瘤血管生成程度的重要指標(biāo)，可通過(guò)檢測(cè)MVD 探討藥物對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控作用[19]。 本實(shí)驗(yàn)以免疫組化法測(cè)定小鼠腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34 的陽(yáng)性水平，計(jì)算微血管密度，結(jié)果表明YLSPS 各劑量組均能顯著降低實(shí)體瘤組織的MVD，從而抑制S180荷瘤血管的生成。 此外，VEGF 為至今公認(rèn)作用最強(qiáng)、專屬性最好的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和促血管生成因子，其表達(dá)水平高低可衡量血管形成能力的大小，在實(shí)體瘤血管新生過(guò)程中具有舉足輕重的作用[20]。研究證實(shí)，體內(nèi)腫瘤由于微環(huán)境的變化與癌基因的激活表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞大量生成VEGF[21]。VEGF 對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF 受體具有高度選擇性，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂、遷移；其次可提高微小血管的通透性，致使血漿大分子外滲沉積在血管外的基質(zhì)中，加速了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生血管網(wǎng)的形成，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處侵襲提供通道[22]。 新生血管促進(jìn)腫瘤持續(xù)發(fā)展，而腫瘤發(fā)展又誘導(dǎo)VEGF 快速大量累積，使腫瘤發(fā)展形成一種惡性循環(huán)。因此，針對(duì)VEGF 及其受體的靶向干預(yù)手段可改善腫瘤內(nèi)新生血管生成，有助于抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和擴(kuò)散。 本研究通過(guò)ELISA 法檢測(cè)了S180荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明YLSPS 中、高劑量可顯著抑制VEGF 蛋白的表達(dá)。

綜上所述，YLSPS 具有調(diào)節(jié)小鼠免疫功能、抑制氧化應(yīng)激及抗S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的作用，并能降低腫瘤組織中VEGF 的表達(dá)及MVD，提示YLSPS抗腫瘤機(jī)制與改善免疫功能、抗氧化及抑制腫瘤血管的生成有關(guān)。