結腸慢傳輸型便秘動物模型研究進展

文靖，周宇，李勝杰，李沛東，薛源，張廣軍

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胃腸外二科，四川 南充 637000； 2.川北醫(yī)學院，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院肝膽胰腸病研究所，四川 南充 637000)

結腸慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)系以結腸功能失調、傳導異常導致的腸道運輸能力減弱為特征的頑固性便秘，主要臨床表現為排便次數減少、排便困難、糞便干結、腹脹，甚至可引起一系列嚴重并發(fā)癥，嚴重影響人們的生活質量[1]。當今社會，隨著人們生活節(jié)奏的加快、飲食結構及習慣的改變，加之社會及生理因素的影響，STC的發(fā)生率逐年增加[2]。STC是功能性便秘的常見類型，占功能性便秘的10.3%～45.5%[3]。近年來，對于STC的發(fā)病原因及機制研究逐漸增多，包括腦腸肽、腸道菌群、Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)、精神因素等異常。它是一個多病因機制參與的病理過程，故對于其治療方案尚未統(tǒng)一，臨床首選藥物保守治療及良好生活習慣的轉變；內科治療效果不佳時，需積極行腸段切除吻合、回腸造口等外科手術治療，但手術治療常會引起便秘復發(fā)、腹瀉、梗阻等嚴重并發(fā)癥[4]。當前，仍沒有理想的方法來有效治療難治性STC，迫切需要新的療法來加速結腸轉運及康復[5]。而進一步的科學實驗常以動物模型為研究基礎，故需要設計與構建合理的實驗動物模型，以期更好地復制動物STC模型?，F就STC動物模型的研究進展予以綜述。

1 實驗動物的選擇

目前，國內外便秘相關動物實驗仍主要以小鼠、大鼠作為實驗對象，也有越來越多的學者利用犬、兔、豬等大動物建立STC動物模型，以滿足相應的實驗需求。其中，大鼠作為制備便秘模型的常用實驗動物，具有很多優(yōu)點，如操作簡便、耐受及抵抗能力較小鼠強、易獲得、繁殖能力強，解剖結構和生理特點與人類相似等；小鼠亦有價格低廉、來源廣泛，品系純等優(yōu)點，但小鼠耐受及抵抗力較大鼠差，不適合長期灌胃給藥造模，因此小鼠在STC造模應用中受到一定程度的限制[6]。小鼠因體型較小，腸道較短，更適合觀察排便實驗；大鼠因腸道較長，產生的糞便相對更多，更利于腸道水吸收相關實驗，而小鼠、大鼠均可以用于胃腸運動實驗[7]。有研究表明，慢傳輸型便秘的發(fā)病機制可能與孕酮或雌激素有關[8-9]，為避免孕酮或雌激素的干擾，故在鼠類性別選擇上以雄性鼠類為宜。

近年來，隨著研究的深入出現多種STC治療手段，如胃結腸電刺激、神經刺激、針灸治療、外科手術等，由于這些操作復雜，需要使用STC大動物模型進行實驗研究[10]。有學者在研究結腸電刺激對STC動物模型排便及胃腸傳輸功能影響時，采取犬為研究對象，因其與人的消化系統(tǒng)性質類似且體積較大，故可以使用與人體基本相同的儀器設備進行研究，以利于電刺激在人體的應用、刺激器的升級開發(fā)及人體適宜的模式和參數的選擇[11]。王欣月[12]選用成年的普通級健康家兔(2.5～3.5 kg)，采用復方地芬諾酯混懸液經口灌胃的方法成功制作了便秘模型。Zhu等[13]通過制作豬STC模型對胃腸道電刺激系統(tǒng)進行了相關研究。

2 動物模型的構建

目前，STC動物模型的經典造模方法包括藥物(復方地芬諾酯、洛哌丁胺、阿片類藥物、大黃、酚酞等)造模法、物理刺激(活性炭冰水灌胃、限水限食等)造模法、藥物聯合低纖維飲食等[14]。隨著研究者對STC研究的不斷深入及經典造模方法的不斷改進，逐漸出現了一系列新的造模方法，如通過誘導腸道菌群紊亂建立便秘模型、牛奶造模、通過化學消融法建立STC大鼠模型等。現對不同造模方法介紹如下。

2.1復方地芬諾酯造模法 復方地芬諾酯片是臨床常見的一種止瀉藥物，含鹽酸地芬諾酯及硫酸阿托品兩種組分。其中地芬諾酯屬于哌替啶類藥物，能作用于結腸平滑肌，可通過抑制結腸黏膜感受器消除結腸黏膜局部的蠕動反射，從而減弱結腸運動功能，同時還可增加結腸的節(jié)段性收縮，明顯延長結腸內容物通過時間,增加結腸內水分的吸收，使大便干結[15]。阿托品是腸道M型受體阻斷劑，其與腸道M型受體結合后可抑制腸道平滑肌收縮，導致腸蠕動減慢及糞便干燥。顧志堅等[16]用復方地芬諾酯片[15 mg/(kg·d)]給大鼠灌胃2周，最終大鼠出現了24 h糞便數量減少、糞便重量減輕，成功建立了大鼠STC模型，該模型具有良好的操作性及可重復性，可在一定程度上避免停用建模藥物后便秘恢復情況，造模周期較短，是一種相對簡便的STC模型。

2.2洛哌丁胺造模法 STC動物模型多依賴化學藥物影響胃腸傳輸，洛哌丁胺與復方地芬諾酯藥理作用類似，也是國內外STC研究中常用的一種建模藥物。洛哌丁胺可抑制腸道平滑肌的收縮，減少腸蠕動，延長腸內容物排出時間，促進水的重吸收，無中樞抑制作用且藥物基本上不進入血液循環(huán)，安全性較高，故較為常用[17]。Deng等[18]采用5.0 mg/kg鹽酸洛哌丁胺每日2次連續(xù)腹腔內注射5 d，制造了相對穩(wěn)定的STC大鼠模型。Chen等[19]于每天9:00給小鼠喂食洛哌丁胺(10 mg/kg)，持續(xù)4周，成功誘導小鼠便秘。

2.3阿片類藥物造模法 目前阿片類藥物誘導便秘的具體機制尚不清楚，可能為μ阿片受體在整個胃腸道中均普遍表達，阿片類藥物與之結合后會減少腸神經系統(tǒng)神經遞質的釋放，從而減弱腸道的動力、減少腸液的分泌，并增加腸液的重吸收，從而誘導STC形成[20]。許海塵等[21]給予小鼠每天皮下注射鹽酸嗎啡(2.5 mg/kg)，共持續(xù)45 d，結果顯示小鼠 24 h糞便重量減輕減少、腸道蠕動減弱、c-kit陽性細胞數量減少，并推測其誘導STC的機制與內源性阿片肽增多或腸道ICC異常改變有關。由于嗎啡類屬于管制性藥物且造模周期較長，這種造模方法并不常用。

2.4低纖維飲食聯合藥物造模法 誘發(fā)慢性功能性便秘的原因很多，飲食中缺乏膳食纖維、水分不足是產生便秘的重要影響因素[22]。其中膳食纖維可以充當腸道內的保水固體，缺乏膳食纖維可導致糞便排泄不暢，并儲存在結腸，誘發(fā)便秘[23]。李雪等[24]單純利用玉米、奶酪、蔗糖、糊精、植物油等低纖維飲食以不同比例混合飼養(yǎng)大鼠2個多月，建立了STC大鼠模型。低纖維飲食造模的優(yōu)點為低纖維便秘動物模型可以很好地模擬非病理性因素及不良飲食習慣引起的便秘，不僅可避免化學藥物便秘模型中藥物所產生的不良反應，而且對高膳食纖維配方產品的通便療效評價更為合理恰當[23]。但單純低纖維飲食造模存在時間長、腸道功能易恢復等缺點，有學者推薦低纖維飲食聯合藥物造模。朱丹等[10]給予犬喂食罐頭肉以及苯乙氧基化物和鹽酸阿洛司瓊，持續(xù)5周，成功建立了符合臨床癥狀和病理變化的STC犬模型，可用于觀察和評價電刺激和手術等治療效果。

2.5誘導腸道菌群紊亂造模法 既往有研究表明，STC的發(fā)生與腸道菌群失調有密切關系[25]。在此基礎上，胡琴[26]利用濃度為 62.5 mg/ml的克拉霉素、阿莫西林等抗生素混合液持續(xù)小鼠灌胃4 d，后予以125 mg/ml的抗生素混合液繼續(xù)灌胃3 d的方法來誘導小鼠腸道菌群紊亂，從而成功建立了腸道菌群紊亂型便秘小鼠模型。黃璐[27]選用C57BL/6小鼠作為造模對象，首先用廣譜抗生素清除小鼠體內的原有腸道微生物，構建“偽無菌鼠”模型，再將STC患者的糞便菌群移植到“偽無菌鼠”模型中，最后觀察發(fā)現菌群移植后小鼠的癥狀與STC的臨床癥狀相似。通過誘導腸道菌群紊亂建立的STC動物模型常用于腸道菌群對STC影響的研究及相關藥物藥效評價等；此種造模方法雖然較簡單且造模周期較短，但模型易受環(huán)境、食物等影響，易恢復、不穩(wěn)定。

2.6牛奶造模法 牛奶中的蛋白質及脂肪等主要組成成分可促進促胰液素、抑胃肽等的分泌，同時抑制胃腸運動，所以過多飲用牛奶易導致便秘[28]。蔡云清等[29]進行多因素分析發(fā)現，牛奶可能會增加老年人慢性便秘的發(fā)生風險。同時，張文仁[7]提出了利用70%的牛奶連續(xù)飼養(yǎng)小鼠7 d的牛奶造模法，其造模原理可能為小鼠過量攝入蛋白，造成腸道負荷過重或蛋白質代謝后產生大量堿性物質，從而打破腸道酸堿平衡，引起便秘。該造模方法雖然具有操作簡單、造模周期短等優(yōu)點，但目前應用較少，非常規(guī)造模方法，需要進一步的探究與驗證。

2.7化學消融造模法 STC的病理機制與腸神經系統(tǒng)的關系成為當前的研究熱點。馬春星等[30]選用SD雌性大鼠在麻醉下進行腹腔手術，分別用不同濃度的苯扎氯銨溶液處理全結腸30 min，術后2周觀察大鼠相關結腸動力學指標；結果發(fā)現實驗組結腸運輸時間明顯延長，且與苯扎氯銨濃度呈正相關。相關機制可能為化學藥物苯扎氯銨對結腸神經細胞進行破壞、消融，從而影響多種腸神經遞質的合成與分泌，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、P物質、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，最終導致結腸傳輸功能減弱及便秘。此種造模方法雖然操作過程較復雜，但模型效果較穩(wěn)定，有利于STC與腸神經系統(tǒng)關系的深入研究。

3 STC動物模型評價

3.1一般情況觀察 一般情況觀察是指對動物的活動量、精神情況、毛色、大便數量及質地等情況進行觀察記錄。有研究發(fā)現，STC模型組動物最初有腹脹狀態(tài)，后逐漸出現倦怠，活動量顯著減少，毛發(fā)蓬松無光澤，好蜷縮于飼養(yǎng)籠一端，反應緩慢，抓取時抵抗減弱，食欲減弱，大便黑、短小且干燥，排便次數減少，體重明顯減輕，造模后期STC模型組動物明顯瘦弱，觸之覺皮毛松弛，無肉；造?；謴秃?，STC模型組動物各項表現逐漸恢復正常[31]。

3.2胃腸道傳輸功能檢測 胃腸道傳輸功能檢測通常包括首粒大便排出時間、24 h糞便數量及糞水含量、腸道推進率。受到動物腸道內糞便量及胃內食物殘留量的影響，首粒大便排出時間并不一定能精確地反映胃腸道的傳輸情況；這時可利用酚紅、活性炭等有色且不易被消化的物質灌胃，評估胃腸的運動[14]。首粒大便排出時間明顯延遲是造模成功的重要評價指標之一。首粒大便排出時間受到個體差異、內外環(huán)境的影響而出現誤差，所以通常會收集STC動物模型24 h甚至更長時間的大便來進行統(tǒng)計分析。STC伴糞便干結，故糞水含量也成為造模成功與否的常規(guī)評價指標之一。采集大鼠新鮮糞便，先稱糞便的濕重，將其烘干后稱糞便的干重，糞便含水率=(濕重-干重)/濕重×100%[32]。造模成功后，模型組會出現24 h糞便數量減少及糞水含量降低。將小鼠解剖后，在無張力狀態(tài)下測量腸道全長(L1)和有色物質在腸道的推進距離(L2)，則腸道推進率(D)=L2/L1×100%[33]。腸道推進率反映了腸道傳輸能力，STC模型組的推進率低于正常組時，說明造模有效。

3.3ICC及c-kit的檢測 腸道中ICC數量減少和結構異常會影響結腸蠕動功能，從而引起便秘的發(fā)生[34]。c-kit蛋白分子是ICC最重要的識別標記，它會影響ICC的功能[35]。通過蛋白免疫組織化學分析發(fā)現，STC模型組小鼠的結腸ICC基膜在結腸壁上溶解，ICC與其周圍細胞之間的連接結構被破壞，ICC細胞核呈不同程度固縮，且ICC數量和c-kit陽性細胞較正常對照組顯著減少[36]。通過免疫熒光技術及透射電鏡檢測分析發(fā)現，STC模型大鼠腸道內ICC數量可能由于鈣離子介導的自噬而顯著減少，雖形成網絡狀，但能觀察到ICC密度變得稀薄，細胞形狀窄而細[37]。

3.4在體結腸肌電測定 結腸平滑肌動作電位(亦稱快波)是促進結腸運動前進的主要動力，而動作電位產生于慢波之上，慢波控制結腸平滑肌收縮節(jié)律、方向等，因此可以借助電生理技術分析檢測STC動物模型的結腸慢波頻率及振幅，從而評估結腸的運動傳輸功能[14]。有研究表明，正常大鼠結腸慢波表現為近似正弦波樣曲線，振幅較整齊，而STC大鼠結腸慢波頻率較正常大鼠明顯減慢，頻率變異系數增大，振幅明顯增加，振幅變異系數增大[38]。劉海峰等[39]通過對STC大鼠模型進行在體結腸肌電檢測分析發(fā)現，慢波頻率及振幅異常可能導致腸道推進率發(fā)生改變或收縮不協調，慢波振幅的改變可能導致峰電位發(fā)放減少，而峰電位異?？赡軐Y腸收縮產生影響，如表現為結腸運動能力減弱，腸道傳輸功能下降。故在體結腸肌電檢測對STC模型的評價起重要作用。

3.5離體結腸肌力檢測 STC系指結腸收縮運動障礙，表現為結腸內容物推進速度減慢或結腸收縮乏力[40]。與在體結腸肌肌電測定一樣，離體結腸肌力檢測亦是評估STC模型效果的一種指標，但離體結腸肌力檢測在體外進行，避免了體內環(huán)境的影響，特別是一些胃腸肽的干擾。麻醉成功后取模型動物一段結腸組織制備成結腸肌條，將其放在37 ℃含克雷布斯-林格緩沖液的器官浴中待測定；施予結腸肌條一定的初始張力，用卡巴膽堿或氯化鉀刺激其收縮，最后用生物信號記錄分析系統(tǒng)記錄及分析離體腸道肌力信號強度，從而評估STC動物模型腸道收縮運動能力[41]。STC動物模型常表現為離體結腸肌力減弱的特性。

3.6NO、VIP和P物質的測定 NO及VIP均是一種腸道抑制性神經遞質，可通過擴散的方式進入腸道平滑肌細胞，誘導平滑肌舒張，從而抑制腸蠕動，減弱腸動力[42-43]。Zhu等[44]研究發(fā)現，STC組的血清NO和VIP水平升高，利用有效藥物白芍總苷治療后血清NO和VIP水平降低；推測其機制可能為白芍總苷通過減少抑制性神經遞質(NO和VIP)促進腸蠕動。有研究證實，P物質是一種由腸神經元分泌的興奮性神經遞質，通過與腸神經元上的速激肽NK1受體偶聯來調節(jié)ICC的起搏器電流，從而正向調節(jié)腸蠕動[45]?？梢?，這些腦腸肽物質與腸道運動密切相關，可通過對NO、VIP及P物質等進行直接檢測來間接反映腸道功能情況，操作簡單方便；但由于STC的影響因素眾多且病因機制不明確，不能僅依靠這些腦腸肽物質來評價STC模型成功與否，而常作為一種次要性的評價指標。

4 小 結

STC動物模型的設計與構建理念應遵循臨床STC的發(fā)病機制。在動物選擇上，目前仍主張選用鼠、犬、兔等與人類消化系統(tǒng)相似的動物，但動物的生活習性及STC動物模型的發(fā)病機制仍與人類STC有顯著差異；在造模方法上，除上述常見的造模方法外，還出現了一些特殊的造模方法，如ICC缺失型STC動物模型[46]及利用基因敲除技術建立神經菌毛蛋白1缺失型STC動物模型[41]等。隨著社會的發(fā)展，“生理-心理-社會模式”在便秘發(fā)生發(fā)展中起重要作用，這也對STC動物模型的構建方法提出了更高要求，而不再單純依靠化學藥物。在STC動物模型評價指標上，隨著“腦-腸軸”在便秘研究中的不斷深入，腦腸肽分子可能成為今后評價STC的熱點。目前關于STC的病理機制研究愈來愈廣泛，因研究目的及方法不同，構建的動物模型也不盡相同，力求構建簡單、重復性好、經濟及科學的動物模型，使人類的STC能在動物模型上更好的復制。