轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β在間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用研究進(jìn)展

陳正永，楊婧，曾曉玲

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴陽(yáng) 550004； 3.貴州省人民醫(yī)院產(chǎn)科，貴陽(yáng) 550002)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，在特定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，有助于組織分化和再生等功能[1]。在體內(nèi)，MSCs的分化作用與細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、特定的信號(hào)通路等有關(guān)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族成員可通過控制關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性調(diào)節(jié)MSCs分化為特定細(xì)胞的進(jìn)程[2]。而TGF-β家族成員配體則可在細(xì)胞表面與特定的四聚體跨膜受體復(fù)合物(由兩種Ⅱ型受體和兩種Ⅰ型受體組成)結(jié)合，與受體復(fù)合物結(jié)合的配體可通過誘導(dǎo)Ⅱ型受體對(duì)Ⅰ型受體中的Ⅰ激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)激活[3]。TGF-β家族配體包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、激活素以及生長(zhǎng)分化因子等。TGF-β與相應(yīng)的受體結(jié)合后導(dǎo)致該受體發(fā)生磷酸化，從而激活特定的Smad蛋白，這些蛋白易位至細(xì)胞核中形成激活或抑制性轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，從而控制靶基因轉(zhuǎn)錄[4-5]?，F(xiàn)就TGF-β在MSCs分化中的作用研究進(jìn)展予以綜述。

1 TGF-β概述

TGF-β在人體內(nèi)的所有細(xì)胞中均表達(dá)，對(duì)正常發(fā)育和體內(nèi)平衡起重要作用。TGF-β超家族包括TGF-β、激活素、抑制素、生長(zhǎng)分化因子和BMP等30多種結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)；TGF-β家族成員在許多細(xì)胞過程中均具有重要作用，包括免疫抑制、生長(zhǎng)抑制、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞遷移、侵襲以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等[4]。TGF-β有3個(gè)受體，即TGF-β受體(TGF-β receptor，TGFBR)1、TGFBR2和TGFBR3，當(dāng)3種配體之一與TGFBR2結(jié)合時(shí)，即會(huì)發(fā)生典型的TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGFBR2可募集并磷酸化TGFBR1，而磷酸化的TGFBR1又可磷酸化下游Smad2和Smad3 C端的絲氨酸殘基(pSmad2/3C)，然后募集Smad4并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在核中Smad4調(diào)節(jié)TGF-β靶基因轉(zhuǎn)錄；另一方面，Smad7被募集至激活的TGFBR或pSmad2/3C復(fù)合物中，并通過Smad特異性E3連接酶啟動(dòng)降解功能[3]。TGF-β還可與其受體結(jié)合通過刺激多種激酶[如促分裂原活化的蛋白激酶、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)等]激活非經(jīng)典TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；此外，Smad依賴性和Smad非依賴性信號(hào)均可通過與其他信號(hào)通路的互相作用調(diào)控細(xì)胞分化類型的特異性[4]。

2 TGF-β在MSCs分化中的作用

2.1TGF-β在成骨分化中的作用 成骨細(xì)胞發(fā)育主要分為增殖、基質(zhì)成熟和礦化3個(gè)階段，這種分化過程取決于Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)和Osterix，成骨細(xì)胞可分化為骨細(xì)胞，被包裹在礦化骨中，具有調(diào)節(jié)代謝、骨重塑等功能[6]。MSCs向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化主要由RUNX2誘導(dǎo)，RUNX2是成骨細(xì)胞分化的主要轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化的早期階段可促進(jìn)MSCs分化為前成骨細(xì)胞，同時(shí)抑制MSCs向脂肪細(xì)胞系轉(zhuǎn)化；而成骨細(xì)胞的分化和成熟則由轉(zhuǎn)錄因子Osterix驅(qū)動(dòng)，從而增強(qiáng)堿性磷酸酶活性、增加礦化，但RUNX2對(duì)于MSCs分化為成熟的成骨細(xì)胞并不重要，在分化后期其表達(dá)水平降低[7-8]。

TGF-β家族成員可調(diào)節(jié)早期骨髓基質(zhì)向成熟基質(zhì)分化過程中成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的分泌。TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3對(duì)成骨細(xì)胞的影響均具有時(shí)間和劑量依賴性，且在其分化的不同階段具有不同的作用。實(shí)驗(yàn)表明，TGF-β可促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖、早期分化和基質(zhì)產(chǎn)生，同時(shí)抑制后期分化和基質(zhì)礦化[9]。TGF-β配體可通過經(jīng)典的Smad2和Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及非經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。成骨細(xì)胞中的Smad2過表達(dá)，可抑制RUNX2的表達(dá)但不影響其轉(zhuǎn)錄活性；Smad3表達(dá)增加可在分化早期降低RUNX2的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性，在后期卻可增加其表達(dá)；激活Smad3可在早期促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程，并增加堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白以及參與基質(zhì)礦化蛋白的表達(dá)[10]。Smad2可通過ERK通路的非經(jīng)典TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制堿性磷酸酶表達(dá)、促進(jìn)膠原蛋白合成，而Smad3可通過ERK1/2和p38信號(hào)通路抑制骨鈣素表達(dá)；作為一種反饋機(jī)制，TGF-β可通過ERK和c-Jun氨基端激酶通路抑制Smad3的轉(zhuǎn)錄[11-12]。此外，TGF-β還可通過ERK通路阻止終末分化細(xì)胞的凋亡，從而控制成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞的分化進(jìn)程[13]。TGF-β信號(hào)與其他信號(hào)通路相互作用也可影響成骨細(xì)胞分化，特別是BMP對(duì)TGF-β通路具有至關(guān)重要的作用。BMP-2可通過抑制TGFBR2的表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)重定位，抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；此外，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均可通過激活編碼硬化蛋白的SOST(sclerostin)基因抑制骨中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；TGF-β還可通過激活Smad3和PI3K信號(hào)通路調(diào)控β聯(lián)蛋白的表達(dá)，當(dāng)β聯(lián)蛋白表達(dá)降低時(shí)，TGF-β則不再抑制骨髓MSCs(bone marrow MSCs，BMSCs)分化，表明TGF-β和Wnt信號(hào)協(xié)同可抑制成骨細(xì)胞分化[14]。

此外，TGF-β還可調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)。在BMSCs中，TGF-β可通過上調(diào)BMSCs中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2、胰島素樣生長(zhǎng)因子1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)膠原蛋白基質(zhì)的產(chǎn)生[14]。腫瘤壞死因子-α可通過核因子κB阻止TGF-β激活Smad2和Smad3，與其抑制Smad1、Smad5和Smad8激活的作用類似，表明腫瘤壞死因子-α具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的功能[10]。

2.2TGF-β在軟骨分化中的作用 MSCs分化為軟骨細(xì)胞需要軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白(sex-determining region Y-box，SOX)9的參與，而SOX9蛋白是高遷移率蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族成員；Nkx3.2(NK3 homeobox 2)可通過阻斷SOX9轉(zhuǎn)錄抑制劑的表達(dá)維持SOX9的表達(dá)，且兩者可以相互誘導(dǎo)表達(dá)；在分化后期，SOX5、SOX6與SOX9共同促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化，但晚期肥大軟骨細(xì)胞中的SOX9表達(dá)水平降低[15]。

TGF-β在細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)研究中均顯示出軟骨誘導(dǎo)能力。研究顯示，TGF-β可誘導(dǎo)胚胎大鼠肌肉MSCs向軟骨細(xì)胞分化[16]。TGF-β配體和受體在骨骼系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，并在間充質(zhì)凝聚過程中起關(guān)鍵作用。TGF-β不會(huì)促進(jìn)在塑料或Ⅰ型膠原上培養(yǎng)的BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，但可促進(jìn)在基質(zhì)膠中培養(yǎng)的BMSCs向軟骨細(xì)胞分化[17]。在基質(zhì)膠中培養(yǎng)BMSCs時(shí)，TGF-β可誘導(dǎo)BMSCs中的Wnt7a表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)鈣黏素表達(dá)，從而增加軟骨分化所需的細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸；在骨膜下注射TGF-β可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞增殖、分化以及軟骨形成增加[16-17]。在軟骨內(nèi)骨形成過程中，軟骨膜是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵部位，TGF-β1可通過調(diào)控膠原蛋白X的表達(dá)導(dǎo)致跖骨培養(yǎng)物中軟骨細(xì)胞增殖和軟骨形成分化部分減少；在培養(yǎng)前去除軟骨膜，則可降低TGF-β1的抑制作用[3]。軟骨膜可產(chǎn)生并分泌控制軟骨細(xì)胞分化的生長(zhǎng)因子，如印度刺猬因子、音猬因子以及甲狀旁腺素相關(guān)肽等。印度刺猬因子和音猬因子可誘導(dǎo)軟骨膜TGF-β2表達(dá)，從而誘導(dǎo)甲狀旁腺素相關(guān)肽表達(dá)并抑制肥大軟骨細(xì)胞的產(chǎn)生，但TGF-β1對(duì)縱向骨生長(zhǎng)的抑制作用與甲狀旁腺素相關(guān)肽無關(guān)[17]。在軟骨分化和生長(zhǎng)板發(fā)育過程中，TGF-β與BMP信號(hào)通路存在相互調(diào)節(jié)作用。在軟骨細(xì)胞中，BMP-2可抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad激活和BMP-Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在成肌細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中BMP-2也具有類似的調(diào)控作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成軟骨細(xì)胞中TGF-β與BMP信號(hào)存在相互作用，可通過形成類似于印度刺猬因子和甲狀旁腺素相關(guān)肽的反饋回路精確調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板的長(zhǎng)度[19]。

2.3TGF-β在成肌細(xì)胞分化中的作用 MSCs肌源性分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括生肌調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factor，MRF)5、MRF4、成肌分化抗原以及肌細(xì)胞生成素等，這些轉(zhuǎn)錄因子可與肌細(xì)胞增強(qiáng)因子協(xié)同作用。其中，生肌因子5(myogenic factor 5，MYF5)、MRF4和成肌分化抗原對(duì)MSCs肌源性分化作用至關(guān)重要，而肌細(xì)胞生成素與MRF4、成肌分化抗原和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2家族成員共同誘導(dǎo)晚期肌肉特異性基因的表達(dá)，驅(qū)動(dòng)肌源性分化的進(jìn)展[4]。TGF-β家族的多個(gè)成員均參與協(xié)調(diào)細(xì)胞分化過程，其對(duì)成肌細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用取決于細(xì)胞類型、分化狀態(tài)以及細(xì)胞因子和TGF-β家族配體。

在體外試驗(yàn)中，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3可抑制成肌細(xì)胞增殖、分化和肌管形成，但在胚胎研究中，TGF-β可促進(jìn)胚胎成肌細(xì)胞分化，研究結(jié)果不一致的原因可能與胚胎和胎兒成肌細(xì)胞表面分子、轉(zhuǎn)錄因子存在差異表達(dá)以及對(duì)TGF-β及其配體的敏感性不同有關(guān)[20]。使用干擾小RNA沉默Smad2和Smad3可增加大鼠成肌細(xì)胞中肌細(xì)胞生成素的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)后期分化標(biāo)志物肌球蛋白和肌管融合的表達(dá)，表明TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可部分抑制早期成肌細(xì)胞分化，且是正常晚期成肌細(xì)胞分化所必需，其可通過Smad依賴性機(jī)制發(fā)揮作用[21]。但TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3對(duì)體內(nèi)成肌細(xì)胞具有不同的影響。TGF-β1水平在肌管發(fā)育過程中保持恒定，TGF-β1-/-小鼠顯示正常的肌管形成和肌纖維發(fā)育；TGF-β2在發(fā)育和再生肌肉中由肌管表達(dá)，其表達(dá)水平隨著發(fā)育過程而增加，表明TGF-β2在晚期成肌細(xì)胞分化和體內(nèi)肌管形成過程中發(fā)揮作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞中過表達(dá)失活形式的TGFBR2，然后將過表達(dá)的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)，結(jié)果未顯示分化作用；肌肉組織受傷后，TGF-β1和TGF-β3從受損的肌肉組織和血小板中釋放出來，并刺激肌肉內(nèi)的生肌細(xì)胞合成TGF-β；TGF-β對(duì)炎癥細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)具有趨化作用，而炎癥細(xì)胞又可分泌促炎因子(包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-1)，從而誘導(dǎo)血管生成并促進(jìn)傷口愈合；此外，TGF-β1還可在損傷修復(fù)過程中誘導(dǎo)肌肉缺損周圍細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)肌纖維基膜再生[23]。

2.4TGF-β在脂肪細(xì)胞分化中的作用 根據(jù)功能不同，脂肪組織可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，白色脂肪組織主要用于儲(chǔ)存能量，棕色脂肪組織主要用于產(chǎn)熱。白色脂肪組織和棕色脂肪組織位于身體解剖學(xué)上不同的位置，其中，白色脂肪組織位于腹內(nèi)，也稱為內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪，而棕色脂肪組織最常位于頸部和鎖骨上區(qū)域。冷暴露或β-腎上腺素能刺激均可誘導(dǎo)白色脂肪組織中出現(xiàn)棕色脂肪樣組織，這種現(xiàn)象稱為白色脂肪組織褐變。白色脂肪組織中的棕色脂肪樣組織與棕色脂肪組織表達(dá)相同水平的解偶聯(lián)蛋白1，而解偶聯(lián)蛋白1對(duì)于產(chǎn)熱至關(guān)重要；雖然棕色脂肪組織中的棕色脂肪細(xì)胞屬于MYF5+譜系，但白色脂肪組織中的棕色脂肪細(xì)胞與白色脂肪組織中的其他細(xì)胞則均屬于MYF5-譜系，這些細(xì)胞構(gòu)成了第3種類型的脂肪細(xì)胞，即“米色”脂肪細(xì)胞或“白褐色”脂肪細(xì)胞[24]。未分化的MSCs最初可分化為前脂肪細(xì)胞并通過有絲分裂進(jìn)行增殖，CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白中的β和亞基是刺激前脂肪細(xì)胞進(jìn)一步分化的關(guān)鍵，可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ2和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α的表達(dá)，導(dǎo)致終末分化階段的細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯[25]。此外，TGF-β在脂肪生成過程中具有抑制作用。TGF-β處理可增加小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-F442A增殖，并有效抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[26]。TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠的白色脂肪組織和棕色脂肪組織細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，表明TGF-β可抑制脂肪生成[27]。在脂肪生成過程中，Smad2、Smad3和Smad4的表達(dá)水平在前脂肪細(xì)胞3T3-F442A中保持不變，而Smad6和Smad7的表達(dá)水平則顯著降低；Smad2或Smad3過表達(dá)可抑制3T3-F442A前脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，其中以Smad3的作用更顯著；同時(shí)，失活的Smad3可抑制TGF-β信號(hào)在脂肪生成中的抑制作用，Smad2則無此作用，表明Smad3可抑制TGF-β通路中的脂肪細(xì)胞分化[25]。

2.5TGF-β在肌腱細(xì)胞分化中的作用 肌腱是一種具有獨(dú)特功能的組織，其中Ⅰ型膠原排列成分層的縱向原纖維陣列，并由內(nèi)腱結(jié)合成束，而內(nèi)腱與血管系統(tǒng)、神經(jīng)支配和淋巴管穿過的表腱相連。作為肌腱祖細(xì)胞的標(biāo)志物，SCX(scleraxis)基因在肌腱間充質(zhì)分化中具有重要作用，且持續(xù)存在于成熟的肌腱細(xì)胞中[28]。雖然目前關(guān)于MSCs向肌腱細(xì)胞分化的研究仍不夠完善，但MSCs向肌腱細(xì)胞分化的過程與TGF-β、BMP及Smad通路有關(guān)。

TGF-β家族成員在肌腱細(xì)胞分化和肌腱細(xì)胞表型的維持中均發(fā)揮重要作用。其中，BMP-2、BMP-4和BMP-7是可抑制肌腱細(xì)胞分化作用的蛋白，而BMP-14、BMP-13和BMP-12可誘導(dǎo)動(dòng)物模型新肌腱形成[29]；TGF-β可促進(jìn)SCX表達(dá)并維持肌腱細(xì)胞表型；Smad在由拉伸和壓縮力產(chǎn)生的相關(guān)基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，由此可見，TGF-β家族成員對(duì)肌腱細(xì)胞的形成和再生均至關(guān)重要[30]。由于肌腱在肌肉骨骼系統(tǒng)中具有獨(dú)特的作用，在保持靈活性的同時(shí)還可維持壓縮和伸展的動(dòng)態(tài)范圍，因此物理力在肌腱細(xì)胞分化和功能中起重要作用。研究表明，TGF-β2可誘導(dǎo)MSCs向肌腱細(xì)胞譜系方向分化；在機(jī)械力作用下，TGF-β3可促進(jìn)SCX表達(dá)并誘導(dǎo)肌腱細(xì)胞分化[31]。Smad(特別是Smad2和Smad3)是調(diào)節(jié)肌腱基因表達(dá)所必需，且這種基因表達(dá)由作用于肌腱組織的物理力誘導(dǎo)，其中Smad8已被證明在MSCs的肌腱分化中發(fā)揮作用[32-33]。

3 小 結(jié)

TGF-β家族對(duì)間充質(zhì)譜系選擇和分化進(jìn)展的影響較復(fù)雜，且依賴于時(shí)間、劑量以及所處的環(huán)境。此外，某些TGF-β蛋白對(duì)于MSCs分化過程中的不同階段也有不同的影響，如TGF-β可促進(jìn)MSCs增殖以及早期分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞祖細(xì)胞等，但卻抑制后期分化為成熟的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞；此外，TGF-β還可抑制成肌細(xì)胞增殖、分化和肌管形成。因此，藥理學(xué)靶向TGF-β家族成員有益于某些疾病的治療，如骨骼及關(guān)節(jié)相關(guān)疾病。TGF-β信號(hào)通路在MSCs分化中具有重要作用，但將研究成果向臨床轉(zhuǎn)化還需更深入的研究以確定其有效性及安全性。