靶向細(xì)胞凋亡的納米探針在MRI中的應(yīng)用

譚昕玥，鄭元元

(首都醫(yī)科大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2019級(jí)兒科學(xué)“5+3”一體化，b.藥學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100069)

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡過(guò)程，在個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、變異等方面起重要作用，若細(xì)胞凋亡過(guò)程出現(xiàn)異常，將會(huì)導(dǎo)致多種疾病，如腫瘤[1]、神經(jīng)退行性病變[2]、自身免疫性疾病[3]以及獲得性免疫缺陷綜合征[4]。利用靶向細(xì)胞凋亡的納米探針可直觀地進(jìn)行細(xì)胞凋亡的分子顯像。目前用于細(xì)胞凋亡分子成像的影像學(xué)技術(shù)主要集中于核醫(yī)學(xué)、光學(xué)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等。MRI作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像手段之一，在多種疾病診斷中有非常重要且廣泛的應(yīng)用。與MRI相比，核醫(yī)學(xué)的空間分辨力低，且具有電離輻射；MRI不受限于成像深度，且具有優(yōu)異的軟組織對(duì)比度等優(yōu)點(diǎn)[5]，但MRI的目標(biāo)靈敏度仍存在不足。因此，為了增強(qiáng)圖像對(duì)比度、縮短成像時(shí)間，MRI對(duì)比劑被廣泛應(yīng)用[6]。在大量涌現(xiàn)的新型MRI對(duì)比劑中，納米探針具有高信號(hào)、多模態(tài)、無(wú)毒的特點(diǎn)[7]，相關(guān)研究正在不斷深入發(fā)展。目前，應(yīng)用于MRI的細(xì)胞凋亡納米探針主要有靶向細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的探針和檢測(cè)胱天蛋白酶(caspase)活性的探針，現(xiàn)對(duì)上述兩類靶向細(xì)胞凋亡的納米探針在MRI中的應(yīng)用予以綜述。

1 細(xì)胞膜上外翻的PS

PS外翻是早期細(xì)胞凋亡檢測(cè)的生化基礎(chǔ)之一。正常情況下，細(xì)胞膜的固有磷脂成分PS只分布于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)層，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，PS由內(nèi)層遷移到外層[8]。

1.1膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)相關(guān)納米探針 Annexin V是一種人體內(nèi)源性蛋白，屬于鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，其分子量為36 000。Annexin V能特異性識(shí)別暴露在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層外層的PS，并以較高的親和力結(jié)合，是一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的常用試劑[9]。目前，Annexin V相關(guān)探針主要包括Annexin V-交聯(lián)氧化鐵(crosslinked iron oxide，CLIO)、Annexin V-超順磁性氧化鐵(small particle of iron oxide，SPIO)、Annexin V-非常小的氧化鐵顆粒(very small iron oxide particles，VSOP)、Annexin V-超小型超順磁性氧化鐵(ultrasmall particle of iron oxide，USPIO)。

1.1.1Annexin V-CLIO Annexin V與CLIO納米顆粒(nanoparticles，NPs)偶聯(lián)得到Annexin V-CLIO，其平均包含2.7個(gè)Annexin V，每個(gè)CLIO之間通過(guò)二硫鍵連接。Schellenberger等[10]通過(guò)喜樹(shù)堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，將Jurkat T細(xì)胞(健康的69%和凋亡的31%)的混合物與Annexin V-CLIO共同孵育，同時(shí)設(shè)置未經(jīng)處理的對(duì)照組。MRI實(shí)驗(yàn)表明，在最低測(cè)試濃度下，喜樹(shù)堿處理的凋亡細(xì)胞的磁共振信號(hào)較未處理細(xì)胞明顯減弱，而未經(jīng)CLIO修飾NPs則無(wú)法使凋亡細(xì)胞發(fā)生明顯的信號(hào)變化。Annexin V與CLIO的連接為檢測(cè)凋亡MRI探針的開(kāi)發(fā)提供了一種策略。

Annexin V-CLIO聯(lián)合近紅外熒光分子Cy5.5形成多模態(tài)靶向探針Annexin V-CLIO-Cy5.5，與Annexin V-CLIO相比，Annexin V-CLIO-Cy5.5具有磁性對(duì)比功能，且能產(chǎn)生熒光，可提供更多的信息。Sosnovik等[11]通過(guò)短暫性結(jié)扎小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制備心肌缺血性損傷動(dòng)物模型，對(duì)給予Annexin V-CLIO-Cy5.5(2 mg Fe/kg)的5只小鼠和給予相同劑量CLIO-Cy5.5(2 mg Fe/kg)的4只小鼠的心臟進(jìn)行MRI，結(jié)果顯示，Annexin V-CLIO-Cy5.5組小鼠心臟缺血部位的磁共振信號(hào)明顯減弱，表明存在Fe沉積，提示Annexin V-CLIO-Cy5.5與凋亡心肌細(xì)胞膜上的PS直接特異性結(jié)合；之后進(jìn)行的離體熒光成像也確認(rèn)了MRI檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡的準(zhǔn)確性。需要注意的是，Annexin V-CLIO-Cy5.5對(duì)PS具有高親和力，故可使用較低劑量的Fe納米探針，從而最大限度地降低探針的非特異性攝取能力，證實(shí)了使用Annexin V-CLIO-Cy5.5獲得體內(nèi)高分辨率心肌細(xì)胞凋亡MRI的可行性，提示Annexin V-CLIO-Cy5.5可能成為心血管成像及診斷相關(guān)疾病的重要工具，且有助于開(kāi)發(fā)常見(jiàn)心血管疾病的新的心臟保護(hù)策略。

1.1.2Annexin V-SPIO SPIO是一種新型靜脈MRI T2加權(quán)造影劑，常用于伴有網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)改變的肝臟病變的診斷。體外重組純化的Annexin V蛋白的胺基與SPIO羥基共價(jià)連接即可得到Annexin V-SPIO。

Annexin V-SPIO可與凋亡細(xì)胞膜特異性結(jié)合。Dash等[12]用吡柔比星分別誘導(dǎo)了新生大鼠心室肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞以及在體小鼠心臟的細(xì)胞凋亡，并使用T2加權(quán)3 T MRI進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，出現(xiàn)Annexin V-SPIO彌漫性心肌T2信號(hào)損耗，可反映鐵含量和capase酶活性，與細(xì)胞凋亡標(biāo)志物高度相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)，利用Annexin V-SPIO的MRI可檢測(cè)早期非缺血性心臟細(xì)胞凋亡，以早期識(shí)別患者可逆性受損心臟細(xì)胞，這對(duì)心臟疾病的治療有重要意義，但其能否臨床應(yīng)用尚待明確。目前，以70 kg的患者為例，通常Annexin V-SPIO的使用劑量約為SPIO 100 mg和Annexin V 200 mg，而人體血漿Annexin V蛋白水平為2～15 μg/L，因此目前Annexin V-SPIO的使用劑量似乎不大合理。Annexin V-SPIO是一種可用于檢測(cè)體內(nèi)早期細(xì)胞凋亡的MRI探針，可能為心血管疾病的基本機(jī)制及新的診斷和治療策略提供借鑒，未來(lái)還需要研究Annexin V-SPIO在其他損傷模型中檢測(cè)動(dòng)態(tài)細(xì)胞凋亡和治療的能力。

1.1.3Annexin V-VSOP Annexin V-SPIO可以反映細(xì)胞凋亡的情況，但其納米探針較大，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能在體內(nèi)達(dá)到合適的信噪比。Figge等[13]通過(guò)帶正電荷的魚精蛋白肽將Annexin V靜電耦合到VSOP表面合成了Annexin V-VSOP超小磁NPs，其直徑只有(14.4±2.3) nm，且具有較高的T2弛豫率。與現(xiàn)有MRI探針相比，Annexin V-VSOP為其在目標(biāo)組織中的良好生物相容性和生物利用度提供了先決條件。使用Jurkat T細(xì)胞在體外對(duì)Annexin V-VSOP探針的特異性結(jié)合進(jìn)行分析，在RPMI培養(yǎng)基中向Jurkat T細(xì)胞加入喜樹(shù)堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用Annexin V-異硫氰酸熒光素流式細(xì)胞術(shù)定量凋亡細(xì)胞百分比。將喜樹(shù)堿處理和未處理的Jurkat T細(xì)胞與Annexin V-VSOP和非結(jié)合Annexin V的M1234-VSOP共同孵育，結(jié)果顯示，與Annexin V-VSOP共同孵育的未經(jīng)喜樹(shù)堿處理的Jurkat細(xì)胞(6%凋亡)相比，與Annexin V-VSOP共同孵育的經(jīng)喜樹(shù)堿處理的Jurkat T細(xì)胞(14%凋亡)的T2加權(quán)MRI信號(hào)減少較明顯，表明Annexin V-VSOP與具有較高PS暴露量的細(xì)胞的結(jié)合率更高，即體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示其與凋亡細(xì)胞的結(jié)合有較好的特異性。

1.1.4Annexin V-USPIO 依據(jù)水合粒徑的不同，磁性氧化鐵NPs造影劑通常被粗略地分為SPIO和USPIO。一般認(rèn)為，SPIO的水合粒徑>40 nm，USPIO的水合粒徑<30～40 nm[14]。USPIO易逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取，故其血液循環(huán)時(shí)間較SPIO更長(zhǎng)，更適用于腫瘤的轉(zhuǎn)移成像和動(dòng)脈粥樣硬化檢測(cè)。

針對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化檢測(cè)，Burtea等[15]研究顯示，由USPIO與一種線狀六肽交聯(lián)形成的USPIO-R826可識(shí)別并結(jié)合PS。給予敲除載脂蛋白E基因小鼠注射0.1 mmol Fe/kg USPIO衍生物，通過(guò)4.7 T核磁共振光譜儀成像，在造影劑給藥24 h后，采集主動(dòng)脈樣本進(jìn)行組織化學(xué)檢查，結(jié)果顯示，在腹主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處USPIO-R826表現(xiàn)出高攝取，證實(shí)凋亡細(xì)胞靶向的USPIO衍生物是非常有前景的檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的工具，有助于檢測(cè)脆弱斑塊，具有成像時(shí)間短、劑量低的優(yōu)點(diǎn)。

Nishie等[16]對(duì)Annexin V-USPIO在體內(nèi)外檢測(cè)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的潛力進(jìn)行探討，在體外實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置與Annexin V-USPIO共同孵育組和對(duì)照組，當(dāng)喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞在體外濃度為0.089 mmol Fe/L時(shí)，用0.47 T核磁共振光譜儀測(cè)量?jī)山M細(xì)胞懸浮液的T2值，結(jié)果顯示，與Annexin V-USPIO共同孵育的含凋亡細(xì)胞懸液的T2弛緩時(shí)間為286 ms，而對(duì)照組的T2弛緩時(shí)間為620 ms；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)腹腔注射依托泊苷和環(huán)磷酰胺2 h帶瘤小鼠行1.5 T核磁共振掃描，并與靜脈注射Annexin V-USPIO(100 μmol Fe/kg)后的2、4、6和24 h的核磁共振掃描結(jié)果進(jìn)行比較，通過(guò)數(shù)據(jù)分析證實(shí)，新開(kāi)發(fā)的Annexin V-USPIO在體內(nèi)外均具有檢測(cè)藥物誘發(fā)的凋亡細(xì)胞的能力。

1.2突觸結(jié)合蛋白C2域 突觸結(jié)合蛋白C2域以鈣依賴的方式與PS結(jié)合，其分子量較小，約為1 470[17]。將大腸埃希菌中純化的突觸結(jié)合蛋白C2域與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)融合，并將其與異硫氰酸熒光素結(jié)合，然后通過(guò)流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)其能否識(shí)別由依托泊苷(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑)誘導(dǎo)的大鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞的早期凋亡，結(jié)果顯示一些C2陽(yáng)性細(xì)胞的大小和粒度尚未發(fā)生變化，表明突觸結(jié)合蛋白C2域能夠在細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化的早期檢測(cè)到凋亡現(xiàn)象[18]。

C2-SPIO是突觸蛋白Ⅰ的C2域與SPIO交聯(lián)后形成的復(fù)合分子。為了證明C2-SPIO與凋亡細(xì)胞可以在體內(nèi)結(jié)合，對(duì)經(jīng)過(guò)依托泊苷和環(huán)磷酰胺聯(lián)合化療48 h的C57BL/6荷瘤小鼠(已植入EL4細(xì)胞并形成腫瘤)靜脈注射C2-SPIO和牛血清蛋白-SPIO，Zhao等[18]以牛血清白蛋白-SPIO處理的荷瘤小鼠作為對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，僅依托泊苷和環(huán)磷酰胺聯(lián)合化療組小鼠腫瘤部位T2信號(hào)出現(xiàn)明顯變化，而牛血清白蛋白-SPIO組則沒(méi)有信號(hào)變化，表明C2-SPIO可特異性地識(shí)別體內(nèi)的凋亡細(xì)胞。C2-SPIO對(duì)MRI檢測(cè)非常敏感，但其仍存在局限性：①相對(duì)粒徑較大(約30 nm)，較難從血管外進(jìn)入腫瘤間質(zhì)，從而降低了組織對(duì)比度。②與突觸結(jié)合蛋白C2域結(jié)合后導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度降低，故在腫瘤中難以檢測(cè)到。

Krishnan等[19]將釓(Gadolinium,Gd3+)螯合物和熒光探針連接到GST-C2A融合蛋白的賴氨酸ε-氨基上，利用其表面等離子體共振表征與PS的結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀和MRI進(jìn)一步觀測(cè)其與體外腫瘤細(xì)胞的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，分子量相對(duì)較小(約為100 000)的Gd3+造影劑在MRI圖像上顯示出正對(duì)比度，故可用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

以往研究發(fā)現(xiàn)，MRI造影劑附著在突觸蛋白的C2A結(jié)構(gòu)域表面賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)上[20]。在C2A和C2A-GST融合蛋白中分別有14、35個(gè)賴氨酸殘基。因此，MRI造影劑與C2A-GST融合蛋白連接將產(chǎn)生多種物質(zhì)，可能會(huì)減少C2A-GST融合蛋白與PS結(jié)合的特異性。

由于C2A結(jié)構(gòu)域中沒(méi)有其他半胱氨酸殘基，Alam等[21]用單一的半胱氨酸殘基取代C2A結(jié)構(gòu)域第78位絲氨酸殘基，記為C2Am，這為用熒光、放射性核素或MRI檢測(cè)標(biāo)簽修飾蛋白提供了一個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn)。此外，比較C2Am-GST與Annexin V兩種探針的體外實(shí)驗(yàn)表明，與用相同熒光團(tuán)標(biāo)記的Annexin V商業(yè)制劑相比，C2Am對(duì)凋亡和壞死細(xì)胞的標(biāo)記更少，其與活細(xì)胞的結(jié)合也更弱，因此其與凋亡和壞死細(xì)胞的特異性結(jié)合提高了4倍[21]。C2Am為開(kāi)發(fā)臨床檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡的更具特異性的新一代成像探針提供了方向。

1.3多肽E3 利用噬菌體展示技術(shù)可以分離出對(duì)給定目標(biāo)具有親和力的肽。Laumonier等[22]使用與M13噬菌體的pⅢ次要衣殼蛋白融合的六肽隨機(jī)肽庫(kù)，在灌流小鼠肝臟的體外實(shí)驗(yàn)中，選擇了對(duì)凋亡結(jié)構(gòu)具有親和力的肽，對(duì)所選肽體外的PS結(jié)合能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果顯示E3噬菌體具有明顯的親和力，這是首次將體外噬菌體展示技術(shù)用于選擇凋亡特異性肽，豐富了分子成像造影劑的研發(fā)。

Segers等[23]將USPIO共價(jià)偶聯(lián)到噬菌體壁的蛋白質(zhì)上，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與PS孵育的E3磁噬菌體保留了非磁性標(biāo)記噬菌體的性質(zhì)，但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噬菌體的磁性會(huì)在血流中被迅速清除，并被肝臟的吞噬細(xì)胞內(nèi)化，為了避免上述情況發(fā)生，USPIO被聚乙二醇化后形成隱蔽的E3-聚乙二醇-噬菌體，且可成功靶向于凋亡的肝臟部位。

Chilla等[24]制備的DO2AGAPNBn是一種具有兩種不同臂的DOTA[DOTA類配體包裹在鑭系(Ⅲ)離子周圍，產(chǎn)生兩種配位幾何構(gòu)型，即方形反棱鏡和扭曲方形反棱鏡]，結(jié)果顯示，對(duì)硝基芐基膦酸和戊二酸臂可使扭曲方形反棱鏡配位水分子交換速率提高10～100倍。地塞米松誘導(dǎo)的胸腺皮質(zhì)凋亡小鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，E3六肽與Gd-DO2AGAPNBn結(jié)合可靶向胸腺細(xì)胞暴露的PS，且MRI顯示的信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生明顯變化[24]。

1.4Zn2+-二甲基吡啶胺(dipicolylamine,DPA) Zn2+-DPA復(fù)合物(又稱PSS-380)是由兩個(gè)二價(jià)金屬陽(yáng)離子通過(guò)PSS-380的有機(jī)支架同時(shí)配位形成的復(fù)合物，功能類似于Annexin V結(jié)構(gòu)域的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)(負(fù)責(zé)膜結(jié)合和PS識(shí)別)[25]。兩種Zn2+的空間分離使PSS-380能夠與PS官能團(tuán)中的羧酸鹽和磷酸鹽陰離子相互作用，通過(guò)PSS-380染色可有效識(shí)別凋亡細(xì)胞。

Zhao等[26]通過(guò)菌株促進(jìn)的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，成功開(kāi)發(fā)了ZnDPA結(jié)合的Fe@Fe3O4NPs，這是一種基于鋅(Ⅱ)二苯胺(ZnDPA)綴合的Fe@Fe3O4NPs(MNPs/ZnDPA)的凋亡歸巢納米平臺(tái)。為了評(píng)估MNPs/ZnDPA靶向凋亡的能力，陶誠(chéng)等[27]通過(guò)0.5 T磁共振(magnetic resonance,MR)系統(tǒng)測(cè)量由抗癌藥物多柔比星誘導(dǎo)的與MNPs/ZnDPA共同孵育2 h的正常和凋亡細(xì)胞的T2值，結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的ΔT2/T2值高于正常細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MNPs/ZnDPA凋亡靶向能力，在MNPs表面上標(biāo)記異硫氰酸熒光素，孵育后可見(jiàn)明顯的綠色熒光信號(hào)[27]。由此可見(jiàn)，MNPs/ZnDPA對(duì)凋亡細(xì)胞具有良好的靶向性質(zhì)，該納米平臺(tái)可能是提高NPs的靶向效率以及增強(qiáng)腫瘤靶向性的一種新策略。

2 caspase

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的caspase家族至少有16名成員，其在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和執(zhí)行中起關(guān)鍵作用[28]。但不是所有caspase都參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，其中caspase-3/7/8被認(rèn)為是各種因素導(dǎo)致凋亡的關(guān)鍵酶。capase-3和capase-7為凋亡執(zhí)行者，caspase-8為啟動(dòng)者[29]。caspase-3對(duì)底物蛋白切割識(shí)別序列為DEVD(Asp-Glu-Val-Asp，天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸)。caspase-3/7已成為評(píng)估促凋亡抗腫瘤治療的重要早期生物標(biāo)志物，因此體內(nèi)無(wú)創(chuàng)檢測(cè)caspase-3/7活性可為腫瘤治療的療效和抗腫瘤藥物的選擇提供寶貴的預(yù)測(cè)信息。雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多caspase-3/7靶向熒光和正電子發(fā)射斷層成像探針，但仍缺乏基于Gd的能夠在體內(nèi)以高空間分辨率檢測(cè)caspase-3/7活性的MRI探針。Ye等[30]采用自組裝的方法開(kāi)發(fā)了基于Gd的可激活caspase-3/7的MRI探針C-SNAM。C-SNAM由提高生物相容性的2-氰基-6-羥基喹啉和D-半胱氨酸殘基、可被活性capase-3/7識(shí)別的DEVD肽、可被細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原的二硫鍵以及Gd-DOTA構(gòu)建而成。在凋亡的腫瘤細(xì)胞中，C-SNAM觸發(fā)并自組裝成NPs，并通過(guò)納米聚集有效放大分子水平的變化，增強(qiáng)自旋晶格弛豫性，約使用目前1/10劑量的臨床造影劑即可準(zhǔn)確地測(cè)量腫瘤對(duì)化療或放療的反應(yīng)，并可延長(zhǎng)探針在腫瘤組織內(nèi)的滯留時(shí)間，提高信噪比。

C-SNAM還可用于關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)干細(xì)胞凋亡的成像?；|(zhì)相關(guān)干細(xì)胞移植物(matrix associated stem cell implants，MASI)是修復(fù)軟骨缺損的一種很有前途的材料[31]。然而，MASI的生存時(shí)間有限，限制了軟骨再生以及關(guān)節(jié)功能重建。Nejadnik等[32]報(bào)道，通過(guò)caspase-3水解，C-SNAM自組裝成NPs，可使1H-MR信號(hào)擴(kuò)增90%，且其體內(nèi)滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)。關(guān)節(jié)內(nèi)注射后，與正常MASI相比，凋亡MASI中的C-SNAM可引起明顯的MR信號(hào)增強(qiáng)。可見(jiàn)，C-SNAM可應(yīng)用于廣泛的細(xì)胞移植。

與傳統(tǒng)1H-MRI相比，19F-MRI的靈敏度是1H-MRI的82%，但19F的自然界豐度為100%，且由于體內(nèi)幾乎無(wú)氟元素存在，所以19F-MRI是一種無(wú)背景干擾、特異性極高的成像方法[33]。但由于19F-MRI的信號(hào)強(qiáng)度較低，很少將19F-MRI探針用于活體動(dòng)物酶活性的觀察。

Akazawa等[34]開(kāi)發(fā)了一種獨(dú)特的由全氟碳液態(tài)核心和堅(jiān)固的二氧化硅外殼組成的NPs，稱為“FLAMES”，且其在體內(nèi)具有較高的敏感性?；贔LAMES研制的納米探針FLAMES-DEVD 2，帶有一個(gè)19F-MRI開(kāi)關(guān)，用于檢測(cè)caspase-3/7活性。為了提高caspase-3對(duì)多肽的裂解效率，學(xué)者設(shè)計(jì)了一種新的Gd3+復(fù)合偶聯(lián)肽DEVD X (X=1,2)，這是一個(gè)連續(xù)重復(fù)X次的底物肽序列，且DEVD 2較DEVD 1具有更快的裂解動(dòng)力學(xué)。FLAME-DEVD 2對(duì)caspase-3活性的響應(yīng)表明其具有高19F-MRI信號(hào)增強(qiáng)率。在靜脈注射FLAME-DEVD 2和促凋亡試劑后，利用19F-MRI成功地對(duì)鼠脾臟caspase-3/7進(jìn)行了活體成像，該成像平臺(tái)顯示了巨大的潛力，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)酶活性的高靈敏度檢測(cè)。

Wang等[35]研制了一種雙功能化酶活化的19F-NMR/MRI探針Cys(StBu)-Asp-Glu-Val-Asp-Lys(FMBA)-CBT(Cy-CBT)，當(dāng)該探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，通過(guò)控制胞內(nèi)谷胱甘肽，CBT與Cys點(diǎn)擊縮合反應(yīng)而自組裝成NPs，在天冬酰胺內(nèi)肽酶的作用下，caspase-3/7裂解為DEVD，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)該凋亡部位的MRI。

此外，Li等[36]通過(guò)創(chuàng)建FL(fluorescence)-MR生物響應(yīng)探針CP1(caspase probe 1)進(jìn)行雙峰成像。CP1由DOTA-Gd(Ⅲ)螯合物、作為聚集誘導(dǎo)發(fā)光體(aggregation induced emission luminogens，AIEgen)的四苯乙烯、作為caspase-3/7底物的DEVD肽三部分組成。在不存在caspase-3/7的情況下，CP1保持水溶性和單體狀態(tài)，表現(xiàn)低FL-MR信號(hào)；在響應(yīng)caspase-3/7時(shí)，DEVD被裂解，剩余的Gd(Ⅲ)-AIEgen結(jié)合聚集導(dǎo)致FL-MR信號(hào)增加。在體外實(shí)驗(yàn)中，該探針表現(xiàn)出無(wú)毒性、動(dòng)力學(xué)更高等特點(diǎn)，而利用CP1的FL響應(yīng)還能夠量化非活性和活性藥物的確切濃度，并在體外準(zhǔn)確預(yù)測(cè)MR信號(hào)，使體內(nèi)MRI結(jié)果的體外驗(yàn)證成為可能。CP1可用于細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并為評(píng)估癌癥治療反應(yīng)和篩選臨床前抗癌藥物提供了寶貴信息。

3 小 結(jié)

細(xì)胞凋亡成像的關(guān)鍵是選擇合適的探針，即具有生物相容性高、毒性小、特異性高等特點(diǎn)的探針。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，個(gè)性化、精準(zhǔn)性成為MRI探針?lè)肿拥难芯糠较?。針?duì)不同的疾病、細(xì)胞、組織或器官，特異性探針具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，而綴合物在其中發(fā)揮了巨大作用，如通過(guò)改進(jìn)材料設(shè)計(jì)、加入金屬離子(基于MNPs/ZnDPA的凋亡歸巢納米平臺(tái))、引入熒光標(biāo)記(Annexin V CLIO-Cy5.5)等合成新型MRI納米探針；此外，新型造影劑也推動(dòng)了MRI納米探針的發(fā)展，如較傳統(tǒng)T1和T2對(duì)比劑具有更高敏感性和特異性的CEST(chemical exchange saturation transfer)對(duì)比劑的出現(xiàn)[37]。Chan等[38]利用具有CEST效應(yīng)的賴氨酸構(gòu)建的脂質(zhì)微囊通過(guò)檢測(cè)pH值判斷干細(xì)胞移植后的凋亡情況。目前，智能型MRI造影劑(如C-SNAM)已成為新的研究熱點(diǎn)，該類造影劑不僅提高了檢測(cè)靈敏度,還能夠針對(duì)病變信號(hào)分子進(jìn)行分子成像[39]。實(shí)際應(yīng)用中，除需要克服MRI低靈敏度的缺點(diǎn)外，MR信號(hào)量化成為亟待解決的主要問(wèn)題，使用雙峰劑(如FL-MR)生物響應(yīng)探針CP1即通過(guò)靈敏度更高的成像方式量化MRI造影劑的濃度，以很好地解決上述問(wèn)題。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制更深入的了解與研究、MRI技術(shù)的不斷完善，更多靶向細(xì)胞凋亡的納米探針將被開(kāi)發(fā)并在臨床診療中發(fā)揮巨大功效。