NLRP3炎癥小體與心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展

張 熙，黃 兵，王貴鵬

1新疆醫(yī)科大學(xué)，烏魯木齊 830000 2武漢大學(xué)，武漢 430000 3新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830000

《中國心血管病報(bào)告2018》顯示，中國居民最主要的死亡原因?yàn)樾难芗膊?，其中急性心肌梗?acute myocardial infarction, AMI)起病急、病情變化快、致死率高，已成為威脅中老年人群生命健康的主要疾病之一[1]。及時(shí)開通阻塞的冠狀動(dòng)脈血管、盡早給予抗凝/抗血小板藥物是AMI治療的關(guān)鍵，對(duì)降低患者死亡率至關(guān)重要。伴隨冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)的同時(shí)，心臟功能和結(jié)構(gòu)可能再次出現(xiàn)損傷，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[2]，其發(fā)生機(jī)制主要包括炎癥反應(yīng)、氧自由基增多、Ca2+超載、pH快速恢復(fù)及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放等。目前MIRI的治療仍未取得令人滿意的療效，亟需探尋新的治療靶點(diǎn)。近年，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleo-tide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體因確切的促炎作用而被廣泛研究，其在MIRI發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸獲得臨床關(guān)注。本文將圍繞NLRP3炎癥小體的形成與功能及其與MIRI關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NLRP3炎癥小體的概念

NLRP3炎癥小體是多蛋白質(zhì)復(fù)合物，在內(nèi)外源性因素刺激下(如細(xì)菌、游離脂肪酸、強(qiáng)紫外線等)，其通過損傷相關(guān)分子模式或病原體相關(guān)分子模式感知細(xì)胞外危險(xiǎn)信號(hào)，并促進(jìn)半胱天冬酶1(caspase- 1)、誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(interleukin, IL)- 1β、IL- 18等炎癥因子成熟和釋放，啟動(dòng)天然防御和炎癥反應(yīng)[3]，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[4]。NLRP3炎癥小體主要包括三部分[5]：第一部分為受體蛋白,即NLRP3，其C-端和N-端結(jié)構(gòu)通過結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域的核苷酸(nucleoside triphosphatase domain, NACTH/NOD)銜接，該結(jié)構(gòu)前段擁有大量的亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeat domain, LRR)，能感知內(nèi)外威脅，中間區(qū)域通過介導(dǎo)蛋白寡聚化，參與炎癥小體的形成，末段包含兩個(gè)功能域即熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain, PYD)和胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(caspase recruitment domain,CARD)，參與信號(hào)分子傳導(dǎo);第二部分為凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a card domain, ASC)，包含C-端的CARD和N-端的PYD，其主要介導(dǎo)銜接功能，是炎癥小體的接頭蛋白;第三部分為前體半胱天冬酶- 1(procaspase- 1)，包含CARD、P20和P10結(jié)構(gòu)域，是炎癥小體的效應(yīng)蛋白。

2 NLRP3炎癥小體的形成與功能

NLRP3炎癥小體的形成包括激活、組裝與調(diào)節(jié)，介導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡等步驟，在整個(gè)過程中NLRP3為“感受器”，ASC為“神經(jīng)纖維”，procaspase- 1為“效應(yīng)器”。首先，LRR識(shí)別各種內(nèi)外源性危險(xiǎn)信號(hào)后，通過不同的信號(hào)通路激活次級(jí)防御機(jī)制，引起NOD構(gòu)象變化并發(fā)生寡聚化；在同型蛋白相互作用下，ASC的N端與NLRP3的PYD相連，C端與procaspase- 1的CARD相連，在NLRP3初始寡聚的環(huán)狀構(gòu)象上聚合形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且復(fù)雜的細(xì)絲[6]，完成炎癥小體裝配。之后procaspase- 1二聚體發(fā)生自我剪切，產(chǎn)生4個(gè)亞基(2個(gè)CARD亞基，1個(gè)P20亞基，1個(gè)P10亞基)并聚合為四聚體，形成caspase- 1[7]。大量caspase- 1的細(xì)絲以聚合的ASC為核心從中分支，形成更利于接觸基質(zhì)的星狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)激活的caspase- 1可裂解前體IL- 1β、IL- 18為活化的IL- 1β、IL- 18，從而發(fā)揮免疫應(yīng)答和級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)[8]。caspase- 1還可裂解為參與Krebs循環(huán)的幾種蛋白，使細(xì)胞能量產(chǎn)生急劇減少，導(dǎo)致細(xì)胞水腫[9]。此外，caspase- 1在細(xì)胞焦亡中亦發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其裂解消皮素D形成N端和C端片段寡聚物后，與膜磷脂結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞膜孔(直徑約10～20 nm)形成[10]，導(dǎo)致質(zhì)膜溶解，多種大分子和促炎介質(zhì)由此向細(xì)胞外釋放。在NLRP3炎癥小體調(diào)控過程中涉及多個(gè)信號(hào)通路，如TlR4/MyD88/NF-κB通路、RISK/線粒體通路、miR- 346- 3p/CaMKIId通路，以發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。

3 NLRP3炎癥小體與MIRI

3.1 NLRP3炎癥小體促進(jìn)心肌細(xì)胞焦亡

在MIRI過程中，保留正常功能的心肌細(xì)胞數(shù)量直接影響心臟功能和遠(yuǎn)期臨床預(yù)后，除再灌注后冠狀動(dòng)脈無復(fù)流會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡外[11]，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞焦亡也直接影響心臟收縮能力。相對(duì)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞焦亡不發(fā)生染色體裂解、核碎裂和核固縮，是另一種形式的細(xì)胞死亡，其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其與缺血再灌注后的心肌組織損傷有關(guān)[12]。研究顯示，抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路可減少心肌細(xì)胞焦亡，縮小心肌梗死面積，保護(hù)心功能[13]。在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞再灌注實(shí)驗(yàn)中，腺苷酸環(huán)化酶活性降低，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平較低，產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)一方面可直接損傷心肌，另一方面通過活化NLRP3炎癥小體而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)MIRI發(fā)生[14]。

3.2 NLRP3炎癥小體的級(jí)聯(lián)放大促炎作用

NLRP3炎癥小體在心肌再灌注期間具有級(jí)聯(lián)放大的促炎作用。再灌注期間，隨著血液和氧的回流，心臟產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，由于過度的保護(hù)和防御機(jī)制，激活的免疫系統(tǒng)和無菌性炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷[15]。類似于病原體介導(dǎo)的有菌性炎癥，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的無菌性炎癥貫穿于MIRI整個(gè)過程，其引起大量炎癥介質(zhì)釋放至細(xì)胞外，在黏附分子的作用下，過量白細(xì)胞聚集并緊密黏附于狹窄的毛細(xì)血管，各種促炎刺激信號(hào)引起中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他類型白細(xì)胞持續(xù)向炎癥部位募集[16]，加重MIRI。另一方面，大量三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)被釋放后可刺激嘌呤能受體(P2X7)介導(dǎo)的炎癥小體形成以及IL- 1β、IL- 18等促炎介質(zhì)產(chǎn)生，并激活周圍的成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)、加重心肌損傷、加速心臟纖維化[17]。

3.3 NLRP3炎癥小體破壞心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞

除在內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中高表達(dá)外，NLRP3炎癥小體在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)中也有明確表達(dá)，CMECs是心臟非心肌細(xì)胞的重要組成成分之一，廣泛參與和調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程，而NLRP3炎癥小體不僅參與各種因素引起的細(xì)胞損傷，亦具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮前體細(xì)胞功能的作用[18]。在血管內(nèi)皮和平滑肌層中表達(dá)的P2X7是非特異性陽離子通道，具有激活NLRP3炎癥小體的效應(yīng)，可致血管內(nèi)皮功能障礙[19]，進(jìn)一步加重MIRI。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予轉(zhuǎn)基因小鼠過表達(dá)Beclin- 1后，小鼠心臟炎癥細(xì)胞CD68和CDB220表達(dá)減少[20]，在另一項(xiàng)MIRI小鼠模型中證實(shí)，miR- 495可通過抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路改善CMECs損傷[21]，側(cè)面驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體可破壞微血管內(nèi)皮屏障。因此，阻遏NLRP3炎癥小體的激活，或可減輕微血管內(nèi)皮損傷，減少再灌注后心肌組織壞死。

4 NLRP3炎癥小體的靶向治療

4.1 NLRP3炎癥小體自身

4.1.1 NLRP3抑制劑

研究證實(shí)NLRP3抑制劑小分子mcc950可選擇性抑制NLRP3與ASC的結(jié)合且不依賴ATP酶活性，顯示出減輕MIRI的潛力[22]。但在急性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，mcc950被發(fā)現(xiàn)具有肝毒性從而限制了其臨床應(yīng)用。最近的基礎(chǔ)研究中[23]，對(duì)缺血心肌使用NLRP3選擇性抑制劑INF預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體形成顯著減少，炎癥反應(yīng)顯著減弱，可能與RISK通路激活及氧化還原防御上調(diào)有關(guān)；與此同時(shí)，該項(xiàng)研究使用抗血小板藥物替格瑞洛預(yù)處理也得到了一致的結(jié)論，但在離體心臟研究中卻得到了不同的結(jié)果，認(rèn)為替格瑞洛的直接靶點(diǎn)并非心肌，而是通過抗血小板作用調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)。目前NLRP3選擇性抑制劑對(duì)MIRI的研究尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，可為后期臨床研究提供新的思路。

4.1.2 秋水仙堿

秋水仙堿的抗炎作用很大程度上與其抑制NLRP3炎癥小體相關(guān)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。作為NLRP3炎癥小體的非特異性抑制劑[24]，秋水仙堿傳統(tǒng)用于治療痛風(fēng)。近期多個(gè)大型臨床試驗(yàn)均肯定了秋水仙堿對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化事件的二級(jí)預(yù)防作用[25- 26]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了其作用機(jī)制，對(duì)MIRI小鼠模型進(jìn)行短期秋水仙堿預(yù)處理后，NLRP3炎癥小體和lL- 18的表達(dá)均得到抑制[27]。秋水仙堿可在兩個(gè)方面下調(diào)NLRP3炎癥小體的活性：一方面抑制P2X7受體的激活，另一方面阻礙ASC的聚合[28]。由于秋水仙堿毒性較強(qiáng)，嚴(yán)重腎病或肝病患者應(yīng)謹(jǐn)慎使用。

4.1.3 caspase- 1

研究發(fā)現(xiàn)，再灌注前給予選擇性caspase- 1抑制劑VX- 765，可通過抑制IL- 1β/p38MAPK通路上調(diào)CX43表達(dá)、降低心肌組織IL- 1β水平，減輕MIRI[29]。此外，在缺血或再灌注前應(yīng)用caspase- 1抑制劑可增強(qiáng)其對(duì)P2Y12拮抗劑的保護(hù)作用[30]，通過激活RISK通路減小大鼠心肌梗死面積[31]。但目前的研究結(jié)果均來源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或體外實(shí)驗(yàn)，尚需相關(guān)臨床研究加以證實(shí)。

4.1.4 IL- 1β

Koumine是秀麗隱桿菌的主要成分之一，常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病。臨床前研究顯示，NLRP3炎癥小體激活后，應(yīng)用Koumine可有效減輕中性粒細(xì)胞浸潤，依賴性抑制巨噬細(xì)胞分泌IL- 1β，減輕炎癥損傷[32]，還可阻斷ASC形成，阻礙NLRP3-ASC相互作用，此種抑制作用歸因于其通過ROS/NF-κB/NLRP3信號(hào)軸影響NLRP3炎癥小體激活。Nazir等[33]研究顯示，心肌再灌注前后進(jìn)行凝血蛋白酶活化蛋白C處理，可通過mTORC1抑制與MIRI相關(guān)細(xì)胞中IL- 1β的成熟和釋放，抑制NLRP3激活和caspase- 1表達(dá)，從而減輕缺血再灌注損傷，但仍缺乏臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

4.2 NLRP3炎癥小體調(diào)節(jié)因子

4.2.1 ROS

丙酮酸乙酯是一種抗氧化劑，可調(diào)控ROS相關(guān)NLRP3炎癥小體活性，對(duì)缺血再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用[34]。紅花黃素是一種黃酮類化合物[35]，具有活血化瘀、止痛等多種藥理作用，其可通過減少ROS釋放和下調(diào)炎癥反應(yīng)保護(hù)心肌免受MIRI。利拉魯肽預(yù)處理可調(diào)節(jié)SIRT1/NOX4/ROS通路活性，抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[36]，從而減輕MIRI。目前，ROS相關(guān)藥物靶點(diǎn)的研究仍較少，且缺乏系統(tǒng)研究。

4.2.2 線粒體

線粒體自噬可促進(jìn)caspase- 1激活和IL- 1β分泌，線粒體裂變/融合可調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)、激活NLRP3炎癥小體[37]。心脂素是一種線粒體脂質(zhì)，可與NLRP3炎癥小體結(jié)合，并促進(jìn)炎癥小體活化[38]，抑制心磷脂產(chǎn)生可減弱NLRP3炎癥小體活性，為以線粒體為靶點(diǎn)減輕或預(yù)防NLRP3炎癥小體相關(guān)MIRI提供了可能性。

4.2.3 信號(hào)通路

黃芪苷具有抑制NF-κB信號(hào)通路的作用，通過調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2軸抑制氧化應(yīng)激和NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[39]。胡椒堿可下調(diào)miR- 383/RP105/Akt信號(hào)通路活性，減弱MIRI和心肌細(xì)胞焦亡[40]。損傷標(biāo)志物miR- 330- 5p已被證實(shí)參與腦損傷和腎臟缺血再灌注損傷，其在心肌中亦呈特異性表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[41]，抑制miR- 330- 5p表達(dá)可顯著增加caspase- 1、IL- 1β、IL- 18和TNF-α等NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致心肌梗死體積增加，加劇心功能障礙程度；T細(xì)胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白- 3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule- 3, TIM- 3)被確認(rèn)為是miR- 330- 5p的潛在靶點(diǎn)，通過小干擾RNA抑制TIM- 3表達(dá)可達(dá)到減輕MIRI的目的，提示miR- 330- 5p/TIM-3軸參與了NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的心肌炎癥的調(diào)節(jié)。

4.3 中醫(yī)藥

毛冬青在中醫(yī)領(lǐng)域內(nèi)被廣泛用于治療心血管疾病[42]，其活性成分PBA可抑制巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞中NLRP3炎癥小體活性，減小心肌梗死面積[43]。楓香是一種具有抗炎作用的傳統(tǒng)中草藥，在感染性疾病和炎癥性疾病中作為抗氧化劑和抗炎劑被廣泛應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)其可減輕MIRI的嚴(yán)重程度[44]。此外，人參皂苷和黃芩苷等中藥活性成分通過抗氧化和抗炎作用亦對(duì)MIRI具有保護(hù)作用。這些中醫(yī)藥在我國應(yīng)用廣泛，具有臨床推廣意義，為中醫(yī)防治MIRI提供了理論依據(jù)。

5 小結(jié)

NLRP3炎癥小體存在于多種心血管疾病的缺血組織，其介導(dǎo)的無菌性炎癥貫穿于MIRI整個(gè)過程，通過多種炎癥因子和信號(hào)通路，參與MIRI的發(fā)生發(fā)展。通過抑制其組成成分及信號(hào)通路可改善MIRI，為臨床防治MIRI提供了新的思路。但目前諸多研究成果僅在動(dòng)物模型中取得，尚缺乏相應(yīng)的臨床證據(jù)。未來仍需開展更多的動(dòng)物研究和臨床試驗(yàn)，探究更多針對(duì)NLRP3炎癥小體的藥物靶點(diǎn)，并促進(jìn)其臨床轉(zhuǎn)化，以預(yù)防和減輕MIRI，改善AMI患者臨床預(yù)后。

作者貢獻(xiàn)：張熙負(fù)責(zé)查閱文獻(xiàn)、撰寫論文；黃兵負(fù)責(zé)形成論文框架、修訂論文；王貴鵬負(fù)責(zé)對(duì)論文進(jìn)行審校。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突