基于PKA 依賴cAMP 信號介導(dǎo)肺胃SP 表達(dá)探討中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的機(jī)制研究

晏露寧 汝觸會 陳愛鳳 陳 曄 韓佳穎 何 飛

臟腑同治是中醫(yī)臟腑相關(guān)理論在長期實(shí)踐中形成的臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)臟腑之間有無經(jīng)絡(luò)屬絡(luò)的關(guān)系分為有表里關(guān)系的臟腑同治和非表里關(guān)系的臟腑同治。仲景有云：“陽明病，脈浮……宜麻黃湯?！痹谶@里，雖是陽明經(jīng)表受邪，但仍會導(dǎo)致肺氣不利，肺氣不宣，故宣肺解表以麻黃湯治之，這是肺胃相關(guān)及肺胃同治理論在臨床上的典型應(yīng)用。本課題組前期研究已證明，通過食管內(nèi)灌注鹽酸可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生氣道神經(jīng)源性炎癥改變，支氣管-食管反射通路可以導(dǎo)致P 物質(zhì)（substance P，SP）的表達(dá)發(fā)生改變，提示SP 可能是中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的基礎(chǔ)之一，但SP 表達(dá)調(diào)控的機(jī)制仍不明確[1]。本研究旨在從蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）依賴環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號介導(dǎo)肺胃SP表達(dá)進(jìn)一步探討胃食管反流模型大鼠肺、胃組織中SP 的相關(guān)性及其可能的機(jī)制，為中醫(yī)“肺胃相關(guān)”及“肺胃同治”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級雄性6～8 周齡SD 大鼠12 只，體質(zhì)量200～230 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證編號：20170005028404，許可證編號：SCXK（滬）2017-0005。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照12 h 明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20 次/h。本研究經(jīng)過浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理與倫理委員會審核通過（審批號：ZSLL-2020-205），實(shí)驗(yàn)動物的處置嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心的倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑 二甲苯（國藥有限公司，批號MD911521）；PBS 磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）（MDL 公司，批號MD911705）；蘇木素染液（MDL 公司，批號MD911467）；DAB kit（MDL 公司，批號MD912068）；Anti-PKA beta（catalytic subunit）抗體（美國Abcam 公司，批號ab187515）；Anti-cAMP 蛋白Kinase Catalytic subunit抗體（美國Abcam 公司，批號ab26322）；Anti-SP 抗體（美國Abcam 公司，批號ab14184）。

1.3 儀器 全自動脫水機(jī)（德國徠卡公司，型號：ASP200S）；石蠟切片機(jī)（德國徠卡公司，型號：RM2235）；低溫高速離心機(jī)（美國Thermo 公司，型號：Micro17R）；電泳儀（中國天能公司，型號：EPS300）；電泳槽（中國天能公司，型號：VE180C）；轉(zhuǎn)膜儀（中國天能公司，型號：VE186）；石蠟加熱包埋系統(tǒng)（德國Leica 公司，型號：G1150H）；加熱磁力攪拌器（KyLin-Bell Lab Instruments 公司，型號：GL-5250A）；正置熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號：DM3000）；成像系統(tǒng)（日本尼康公司，型號：Nikon DS-U3）。

1.4 分組及造模 將12 只大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，即正常對照組、模型組，每組6 只。將腹腔麻醉后的大鼠取仰臥位固定，經(jīng)口插入胃管至大鼠食管的中下段，模型組以8 滴/min 的速率緩慢灌注0.1 mmol/L 鹽酸溶液，每次20 min，1 次/d，連續(xù)14 d。正常對照組用PBS 代替鹽酸，方法與模型組相同。

1.5 標(biāo)本采集 腹腔注射麻醉大鼠后心臟穿刺放血處死大鼠，經(jīng)左心室插入導(dǎo)管至主動脈，含1%肝素的生理鹽水快速沖洗后用4%多聚甲醛200 mL 灌流固定。立即在冰塊上取出食管、肺及胃組織，包埋，恒冷箱冰凍切片，HE 染色。

1.5 觀察指標(biāo)及測定

1.5.1 光鏡下觀察肺胃組織學(xué)變化 對HE 切片進(jìn)行圖像的采集和分析：通過顯微鏡拍照（100 倍和200 倍鏡下觀察），采集分析樣本相關(guān)部位，并進(jìn)行HE 半定量分析：食管炎病理分級采用中華醫(yī)學(xué)會消化內(nèi)鏡學(xué)會頒布的反流性食管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，氣道炎癥病理分級采取半定量方法評估細(xì)支氣管氣道炎癥[3]，胃黏膜炎癥程度是根據(jù)黏膜中慢性炎癥細(xì)胞的多少進(jìn)行評分[4]。

1.5.2 免疫組織化學(xué)測定豚鼠肺及胃組織PKA、cAMP、SP 表達(dá) 大鼠肺、食管與胃組織分別置入10%中性甲醛中固定，取材包埋，石蠟包埋切片。石蠟切片脫蠟后行抗原修復(fù)，然后行免疫雜交。免疫雜交：3% H2O2孵育，PBS 沖洗，滴封閉液，室溫30 min（濕盒中）。用濾紙擦去，不要洗。滴加適宜濃度的PKA、cAMP 與SP 一抗（均1∶50），孵育過夜，PBS 洗去，擦去PBS。滴加生物素化二抗，室溫孵育，PBS 洗去二抗，擦去PBS。滴加工作液，室溫孵育，PBS 洗去，擦去PBS。顯色劑顯色，自來水沖洗。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片后顯微鏡下觀察并測定平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；組間兩兩比較，方差齊性者采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，將“胃組織的PKA、SP 含量”與“肺組織的PKA、SP 含量”進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺、食管、胃組織病理形態(tài)學(xué)變化以及各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析 與正常對照組比較，模型組肺、胃及食管組織半定量評分顯著升高（P＜0.01）（見表1）；正常對照組大鼠肺組織肺泡大小正常，未見炎性細(xì)胞浸潤，模型組大鼠肺組織可見大量的炎細(xì)胞浸潤。正常對照組大鼠胃組織胃黏膜上皮光滑，未見炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠胃組織胃黏膜上皮出現(xiàn)胃黏膜下間質(zhì)水腫、黏膜下可見炎細(xì)胞浸潤。正常對照組大鼠食管組織各層結(jié)構(gòu)完整，黏膜厚薄適中，黏膜基底膜清楚，各層細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠食管組織黏膜層增厚，基底細(xì)胞層及棘細(xì)胞層細(xì)胞數(shù)目增多，角化層增厚，局部黏膜基底細(xì)胞層明顯增生，部分黏膜組織向外呈乳頭樣突起。見圖1。

圖1 各組大鼠肺、食管、胃組織形態(tài)學(xué)變化（HE 染色，200倍）

表1 各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析（分，）

表1 各組大鼠肺、食管、胃組織HE 半定量分析（分，）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；與正常對照組比較，aP＜0.01

2.2 各組大鼠肺、食管、胃組織PKA、cAMP 與SP 的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果表明，與正常對照組比較，模型組大鼠肺、食管與胃組織中PKA、cAMP 與SP的蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01）。見表2-4。

表2 各組大鼠肺、胃、食管組織PKA 蛋白表達(dá)量比較（）

表2 各組大鼠肺、胃、食管組織PKA 蛋白表達(dá)量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；PKA 為蛋白激酶A；與正常對照組比較，aP＜0.01

表3 各組大鼠肺、胃、食管組織cAMP 蛋白表達(dá)量比較（）

表3 各組大鼠肺、胃、食管組織cAMP 蛋白表達(dá)量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；cAMP 為環(huán)磷酸腺苷；與正常對照組比較，aP＜0.01

表4 各組大鼠肺、胃、食管組織SP 蛋白表達(dá)量比較（）

表4 各組大鼠肺、胃、食管組織SP 蛋白表達(dá)量比較（）

注：模型組予鹽酸溶液灌注建立胃食管反流模型；正常對照組用PBS代替鹽酸灌注；SP 為P 物質(zhì)；與正常對照組比較，aP＜0.01

圖2 各組大鼠肺、食管、胃組織中PKA、CAMP、SP 表達(dá)情況（蘇木素染色，×400）

2.3 模型組大鼠肺、食管、胃組織PKA、SP 的相關(guān)性分析 以胃組織PKA 含量為自變量X，以肺組織PKA 含量為因變量Y，P＜0.05，說明因果關(guān)系成立，根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)尋找最能反映XY 關(guān)系的方程為：Y=0.073+0.639X（見表5）?；貧w分析結(jié)果表明：肺組織中PKA 的含量隨胃組織PKA 含量的增加而增加。

以胃組織SP 含量為自變量X，以肺組織SP 含量為因變量Y，P＜0.05，說明因果關(guān)系成立，根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)尋找最能反映XY 關(guān)系的方程為：Y=0.107+0.321X（見表5）?；貧w分析結(jié)果表明：肺組織中SP 的含量隨胃組織SP 含量的增加而增加。

表5 肺、胃組織PKA 與SP 含量線性回歸分析

圖3 肺胃組織SP 關(guān)系散點(diǎn)圖

圖4 肺胃組織PKA 關(guān)系散點(diǎn)圖

3 討論

胃食管反流引起的咳嗽是呼吸科常見病，屬于胃食管反流病的范疇[5]?？蓺w于中醫(yī)的“胃咳”“內(nèi)傷咳嗽”等范疇，病位在肺、胃。中醫(yī)從肅肺和胃、疏肝和胃等角度入手治療取得了良好的效果[6]。

SP 是速激肽家族的成員之一，SP 通過與受體相結(jié)合的方式在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等多種組織器官發(fā)揮作用。既往研究表明，SP 是一種誘導(dǎo)迷走神經(jīng)相關(guān)的支氣管-食管反射通路的神經(jīng)肽[7]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在胃食管反流大鼠模型的肺胃組織中SP 的表達(dá)含量高于正常組大鼠，可能是臟腑同治學(xué)說中肺胃相關(guān)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)，而P 物質(zhì)參與調(diào)控的機(jī)制則需要進(jìn)一步研究[1]。

在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)提出之后，越來越多的疾病被發(fā)現(xiàn)可能通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制調(diào)控，如胃腸道疾病[7]、糖尿病[8]等。肺組織的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞被研究證實(shí)會促進(jìn)肺部組織釋放神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)和促進(jìn)哮喘對過敏原的反應(yīng)。在發(fā)育性和慢性肺部疾病中起作用，也是小細(xì)胞肺癌的起源細(xì)胞[9]。PKA、cAMP、SP 在這一網(wǎng)絡(luò)的信號傳遞中可能起到了重要的作用。cAMP 主要是由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP 反應(yīng)生成，而cAMP 對細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能主要是通過激活PKA 來實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，激活后的PKA/cAMP信號通路，能夠促進(jìn)下游靶蛋白磷酸化，促使TRPV1通道開放，Na+、Ca2+等陽離子內(nèi)流增加，從而促進(jìn)SP的釋放[10]。我們猜測這一通路在促進(jìn)胃腸道組織釋放SP 的同時，可能在氣管、肺等組織中也發(fā)生了某些改變。因此本課題通過構(gòu)建胃食管反流模型的大鼠，用免疫組化法測定肺、胃組織PKA、cAMP、SP 表達(dá)，并將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肺、食管與胃組織PKA、cAMP 與SP 蛋白表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，直線回歸方程能夠較好地反映PKA 和SP 在肺胃表達(dá)中存在相關(guān)性，肺組織SP 的含量隨著胃組織SP 的含量的增加而增加，肺組織PKA 的含量隨胃組織PKA 的含量增加而增加。由此我們推斷，在胃食管反流模型大鼠體內(nèi)，PKA/cAMP 信號通路開放，從而使肺胃組織釋放神經(jīng)肽類SP，這或許能夠從實(shí)驗(yàn)層面為中醫(yī)肺胃相關(guān)及肺胃同治理論提供基礎(chǔ)。本課題擬下一步從治療干預(yù)角度設(shè)計(jì)研究，進(jìn)一步證實(shí)PKA 依賴cAMP 信號介導(dǎo)肺胃SP 表達(dá)的相關(guān)情況。