慢傳輸型便秘動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

許燕城，劉啟鴻，柯曉

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院脾胃病科，福州 350003)

慢傳輸型便秘(slow transit constipation，STC)屬于慢性功能性便秘，與腸動(dòng)力障礙、腸道分泌功能異常、腸道菌群失衡、精神心理因素等有關(guān)，主要表現(xiàn)為便次減少、糞質(zhì)干硬、排便費(fèi)力[1]。其患病率隨人們飲食、生活習(xí)慣變化以及社會(huì)、心理因素等影響而逐漸增加。但目前STC發(fā)病機(jī)制并不明確，現(xiàn)有的藥物治療大都有效性不足，因而通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深層次的機(jī)制研究以尋求更高效的治療方法至關(guān)重要?，F(xiàn)有STC造模方法主要分為藥物及非藥物誘導(dǎo)，評(píng)價(jià)方法則囊括了模型的各項(xiàng)生理、病理情況檢測(cè)。目前尚缺乏對(duì)模型的建造方法及其評(píng)價(jià)手段的全面整理總結(jié)。因此，有必要建立一種操作簡(jiǎn)便、復(fù)制性強(qiáng)，且符合STC病理、生理特點(diǎn)及臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型，并建立一套統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)通過(guò)文獻(xiàn)檢索，對(duì)國(guó)內(nèi)外STC動(dòng)物模型建造方法及評(píng)價(jià)手段進(jìn)行歸納總結(jié)，并提出可進(jìn)一步改進(jìn)意見(jiàn)，以期為今后的研究提供參考。

1 造模動(dòng)物的選擇

目前，國(guó)內(nèi)外常用的便秘模型動(dòng)物以大鼠和小鼠為主。作為常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，大鼠具有易獲得、經(jīng)濟(jì)、易飼養(yǎng)、性格溫順、耐受力好、抗病力強(qiáng)、繁殖力強(qiáng)、解剖學(xué)特性及生理特性與人類接近等優(yōu)點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外多選用6～8周清潔級(jí)或無(wú)特定病原體的SD大鼠或Wister大鼠，體重110～250 g，雌雄不限。與雌鼠相比，雄鼠對(duì)大黃的敏感性更好，因此在使用大黃誘導(dǎo)模型時(shí)可使用雄鼠[2]。

小鼠亦是實(shí)驗(yàn)室研究常用動(dòng)物，同樣具有易獲取、成本低、易飼養(yǎng)、性格溫順、繁殖力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但相較于大鼠，壽命短、耐受力差，不宜長(zhǎng)時(shí)間給藥，用于模型建立存在一定局限性。常用品系為昆明小鼠及ICR小鼠，體重20～25 g，雌雄均可。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠對(duì)嗎啡等阿片類藥物敏感，出現(xiàn)便秘癥狀顯著，而且造模周期短，因此嗎啡法誘導(dǎo)STC動(dòng)物模型時(shí)多選用小鼠[2]。

2 造模方法的選擇

目前已有的造模方法多種多樣，大致分為藥物及非藥物兩大類，每種造模方法的作用機(jī)制不同，同時(shí)也各具優(yōu)缺點(diǎn)。

2.1藥物造模法

2.1.1復(fù)方地芬諾酯 復(fù)方地芬諾酯的主要成分為地芬諾酯和阿托品，其作用機(jī)制類似于嗎啡：腸黏膜感受器受到抑制，局部黏膜蠕動(dòng)反射被消除，從而使腸道蠕動(dòng)減緩，腸內(nèi)容物與腸黏膜的接觸時(shí)間延長(zhǎng)，水分的吸收增多。

劉麗兵等[3]按10 mg/(kg·d)的復(fù)方地芬諾酯喂養(yǎng)大鼠，連續(xù)喂養(yǎng)14 d后，大鼠糞便數(shù)量和含水量降低，檢測(cè)結(jié)果顯示P物質(zhì)含量明顯下降，血清一氧化氮和一氧化氮合酶含量明顯增加；血管活性腸多肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)水平明顯升高、黏膜c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少、干細(xì)胞因子表達(dá)明顯降低，表明STC動(dòng)物模型建立成功。楊穎等[4]將復(fù)方地芬諾酯按10 mg/(kg·d)的劑量連續(xù)給藥20 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STC大鼠的首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng)，糞便干濕重百分比、大腸埃希菌含量顯著上升，VIP含量顯著上升，蛋白激酶A、水通道蛋白3及水通道蛋白4的基因、蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，雙歧桿菌、乳酸菌及P物質(zhì)含量顯著減少。

陸泰旭等[5]在飼料中添加復(fù)方地芬諾酯，劑量為8 mg/(kg·d)，連續(xù)飼養(yǎng)120 d，結(jié)果表明該模型大鼠首次排便時(shí)間延長(zhǎng)，P物質(zhì)、VIP含量明顯下降，符合STC患者臨床癥狀和病理、生理特點(diǎn)。包云光等[6]在3 d基線期后，以8 mg/(kg·d)的劑量給模型組大鼠連續(xù)飼喂復(fù)方地芬諾酯混懸液90 d，結(jié)果表明，相較正常大鼠，模型組大鼠排便粒數(shù)較少，每粒糞便重量更大，首粒黑便排出時(shí)間延長(zhǎng)；模型組c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著減少；但遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜的一氧化氮、P物質(zhì)含量及VIP陽(yáng)性細(xì)胞分布與正常大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

該模型與STC患者結(jié)腸的功能狀態(tài)、病理改變情況相近，且操作簡(jiǎn)單，成本較低，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，是國(guó)內(nèi)STC研究的經(jīng)典造模方法之一。但經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同研究之間一氧化氮、P物質(zhì)、VIP等指標(biāo)不同，造成這種差異可能與給藥劑型不同、飼養(yǎng)時(shí)間差異、是否設(shè)置基線期及基線期長(zhǎng)短、是否限水等因素相關(guān)，確切的原因還有待進(jìn)一步研究。此外，劑量為8 mg/(kg·d)模型與劑量為10 mg/(kg·d)模型僅相差2 mg/(kg·d)，造模周期卻相差100多天，相較周期長(zhǎng)的模型，周期明顯縮短的10 mg/(kg·d)復(fù)方地芬諾酯模型的穩(wěn)定性研究目前未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

2.1.2洛哌丁胺 洛哌丁胺為阿片受體激動(dòng)劑，可抑制腸道平滑肌的收縮，減少腸蠕動(dòng)；減少乙酰膽堿的釋放,憑借膽堿能與非膽堿能神經(jīng)元局部的相互作用,直接抑制蠕動(dòng)反射，從而增加腸壁與腸內(nèi)容物的接觸時(shí)間；抑制前列腺素、霍亂毒素及其他腸毒素導(dǎo)致的過(guò)度分泌，增加水分吸收[7]；增加腸黏膜細(xì)胞水通道蛋白8的表達(dá)，促進(jìn)跨膜水運(yùn)輸，減少糞便含水量[8]，這些機(jī)制共同作用，最終導(dǎo)致糞便干結(jié)、排便減少。

將洛哌丁胺與嗎啡進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以30 mg/kg劑量注射洛哌丁胺，每日2次，給藥2 d，其對(duì)胃腸傳輸?shù)囊种谱饔妹黠@降低，而嗎啡未出現(xiàn)上述情況，提示洛哌丁胺易產(chǎn)生耐受而降低其抑制胃腸傳輸?shù)淖饔肹9]。樂(lè)音子等[10]予以大鼠洛哌丁胺混懸液3.0 mg/(kg·d)灌胃，持續(xù)14 d，結(jié)果顯示，STC大鼠糞便干結(jié)，含水率顯著下降，小腸活性炭推進(jìn)率明顯降低，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)異常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，組織一氧化氮和一氧化氮合酶含量顯著增多，c-Kit和肌球蛋白輕鏈激酶蛋白表達(dá)顯著減少，符合STC的病理改變。黃亞娟等[11]設(shè)置了模型組和模型維持組，兩組均給予洛哌丁胺混懸液3.0 mg/(kg·d)劑量連續(xù)給藥6 d，第7天開(kāi)始，模型維持組繼續(xù)以上述劑量給藥6 d，模型組予以等量蒸餾水。結(jié)果表明，給藥6 d后，兩組大鼠糞便粒數(shù)、質(zhì)量、含水量均下降，與STC的臨床表現(xiàn)相似；給藥12 d后，模型維持組上述現(xiàn)象較模型組加重。提示洛哌丁胺混懸液造模以3.0 mg/(kg·d)給藥6 d的方案能夠成功建立STC模型，具有造模時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但停藥后有自愈的可能，而以“6+6”的維持方案能夠獲得一個(gè)較為穩(wěn)定且安全的動(dòng)物模型，是一種較為簡(jiǎn)便可靠的造模方法，與樂(lè)音子等[10]造模所用時(shí)間接近。但維持給藥6 d后癥狀是否會(huì)再次逐漸恢復(fù)，最佳維持給藥時(shí)間仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

2.1.3嗎啡 嗎啡為阿片受體激動(dòng)劑，主要用于鎮(zhèn)痛，患者在使用嗎啡后往往出現(xiàn)嚴(yán)重且持久的便秘癥狀，其作用機(jī)制為嗎啡對(duì)胃腸平滑肌有興奮作用，可提高其張力，甚至痙攣，胃腸平滑肌張力增加，蠕動(dòng)減弱，內(nèi)容物通過(guò)延遲；回盲瓣與肛門括約肌張力增加，阻礙了腸內(nèi)容物排空；嗎啡對(duì)消化液的分泌有抑制作用，延長(zhǎng)內(nèi)容物消化時(shí)間；嗎啡有中樞抑制作用，影響便意的產(chǎn)生，因而引起便秘[12]。王吉侯等[13]按2.5 mg/(kg·d)的劑量，連續(xù)45 d予模型組小鼠皮下注射嗎啡建立模型。結(jié)果顯示，STC小鼠糞便質(zhì)量降低，腸道蠕動(dòng)減緩，P物質(zhì)、結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)陽(yáng)性表達(dá)減少。該模型與STC的病理特征吻合，造模方法較為簡(jiǎn)單，但仍存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題：①ICCs 的減少與嗎啡有無(wú)關(guān)聯(lián)性仍有待進(jìn)一步研究;②小鼠耐受力較差，皮下注射的給藥方式存在感染風(fēng)險(xiǎn)，易發(fā)生小鼠死亡的情況；③嗎啡作為成癮性藥物，現(xiàn)有報(bào)道均缺乏對(duì)給藥后期小鼠精神狀況的評(píng)估；④作為管控嚴(yán)格的精神藥品，嗎啡的獲取困難；⑤相較于STC發(fā)病機(jī)制，嗎啡的作用機(jī)制是復(fù)合的，但其所誘導(dǎo)模型更接近于混合型便秘，這在很大程度上影響后續(xù)研究。

2.1.4鹽酸小檗堿 鹽酸小檗堿為中藥黃連中提取的一種生物堿，因其抗菌作用，常被用于腸道感染，其不良反應(yīng)之一為排便困難。吳迪等[14]設(shè)置低、中、高劑量模型組，分別給予25、50、100 mg/(kg·d)的鹽酸小檗堿，連續(xù)14 d灌胃，給藥過(guò)程中自由飲食，觀察發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，中劑量組大鼠首次排便時(shí)間延長(zhǎng)，糞便粒數(shù)及含水量下降，而低劑量組各指標(biāo)無(wú)顯著改變，高劑量組糞便粒數(shù)無(wú)顯著改變。關(guān)永俊[15]通過(guò)鹽酸小檗堿50 mg/(kg·d)灌胃14 d發(fā)現(xiàn)，STC大鼠胞內(nèi)游離Ca2+增加，從而導(dǎo)致腸道內(nèi)ICCs發(fā)生細(xì)胞自噬，形態(tài)萎縮，數(shù)目減少，進(jìn)一步導(dǎo)致STC的發(fā)生。鹽酸小檗堿模型與STC臨床表現(xiàn)一致，且成本低、操作簡(jiǎn)易、周期短，但該方法作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

2.1.5大黃 大黃為臨床常用中藥之一，國(guó)內(nèi)常用大黃建造“瀉劑結(jié)腸”的STC動(dòng)物模型。徐天舒等[16]予以大黃粉混懸液灌胃，初始量為 150 mg/(kg·d)，并以150 mg/(kg·d)逐日遞增，當(dāng)50%大鼠腹瀉時(shí)，持續(xù)給藥至80%大鼠無(wú)排稀便，此后繼續(xù)按150 mg/(kg·d)逐日增加，至又見(jiàn)50%大鼠腹瀉時(shí)，維持劑量不變，其后繼續(xù)逐日加量，這樣重復(fù)3次，當(dāng)?shù)?次出現(xiàn)80%大鼠無(wú)稀便，維持給藥1周后停藥，最后大鼠糞便含水量、排便量明顯少于正常大鼠，提示造模成功。孫宇和姚秋園[17]以300 mg/(kg·d)為初始量造模，并以300 mg/(kg·d)逐日遞增至1/2大鼠出現(xiàn)粥樣便，并以此劑量維持至4/5大鼠粥樣便消失，這樣重復(fù)3次，當(dāng)?shù)?次出現(xiàn)4/5大鼠無(wú)稀便，維持給藥1周后停藥；該造模方法給藥劑量高達(dá)5 700 mg/(kg·d)，造模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)87 d，遠(yuǎn)超大黃中毒劑量，且周期長(zhǎng)?！盀a劑結(jié)腸”動(dòng)物模型誘導(dǎo)過(guò)程與STC形成過(guò)程相似，是一種較為可靠、操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性高的造模方法。但仍存在以下問(wèn)題：①藥物劑量過(guò)大，甚至達(dá)到中毒劑量，周期較長(zhǎng)；②目前不同學(xué)者采用大黃造模的劑量差異較大，造模時(shí)間也各不相同，這可能與不同產(chǎn)地、不同廠家的大黃有效成分存在較大差異相關(guān)，目前缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；③大黃并非單一成分藥物，其中所含其他成分對(duì)大鼠的影響目前尚不明確[2]，這些因素均不利于STC模型的建立及進(jìn)一步用于實(shí)驗(yàn)。

2.1.6酚酞 類似于大黃造模方法，張連陽(yáng)等[18]將酚酞混入飼料喂養(yǎng)大鼠，整個(gè)造模過(guò)程分2期：第1期，初始量為100 mg/(kg·d)，此后以前日2倍劑量逐日遞增，當(dāng)50%大鼠排稀便后維持劑量至80%大鼠無(wú)稀便,之后繼續(xù)雙倍劑量遞增至50%大鼠糞便變稀，如此循環(huán)3次,當(dāng)末次80%大鼠無(wú)稀便1周后停藥,予以普通軟飼料喂養(yǎng)待處理,初次50%致瀉量為1 000 mg/(kg·d),末次調(diào)整量為4 000 mg/(kg·d)；第2期，初始量為200 mg/(kg·d),50%致瀉量為1 600 mg/(kg·d),末次調(diào)整量為3 600 mg/(kg·d)。與大黃模型相仿，該造模方法使得大鼠腸道傳輸延緩，肌間神經(jīng)叢嗜銀性顯著下降，這些改變均與STC患者相吻合。此外，本模型還具有成本低、易操作、可復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)。然而，酚酞造模同樣存在藥物劑量過(guò)大、造模時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，長(zhǎng)期腹瀉易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂，免疫力降低，甚至死亡。

2.2非藥物造模法

2.2.1冰水灌胃 長(zhǎng)期冷刺激使腸道交感神經(jīng)興奮，血管收縮，腸道平滑肌痙攣，正性腸道激素分泌降低，腸道感覺(jué)功能和動(dòng)力下降，進(jìn)一步使腸道蠕動(dòng)延緩，最終導(dǎo)致STC的形成[19]。林強(qiáng)等[20]每天以2 ml 0.9%氯化鈉溶液(0～4 ℃)灌胃大鼠，連續(xù)14 d，建立STC模型，結(jié)果顯示STC大鼠結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性的ICCs數(shù)目、超極化激活環(huán)核苷酸門控陽(yáng)離子通道1蛋白表達(dá)、結(jié)腸推進(jìn)速率、結(jié)腸離體肌條收縮幅度與頻率均降低，該模型能夠使模型動(dòng)物出現(xiàn)與STC相似的糞便質(zhì)量、含水量下降，且方法簡(jiǎn)便、成本低，但其作用機(jī)制更接近便秘型腸易激綜合征；模型穩(wěn)定性不明確，停止冰水刺激后，腸道表現(xiàn)是否會(huì)自愈尚有待評(píng)估。

2.2.2限水法 水分?jǐn)z入的減少將會(huì)導(dǎo)致糞便含水量下降，糞便干結(jié)，傳輸延緩。王朝暉等[21]在測(cè)得大鼠每日正常飲水量并估計(jì)其每日正常糞便量后，于前2 d給予大鼠正常飲水量的1/6，后4 d給予正常飲水量的1/3，最后模型大鼠糞便表現(xiàn)為豌豆樣、圓珠狀干燥糞便，排出緩慢。曾群和趙果毅[22]通過(guò)連續(xù)3 d喂食大米并禁水及一切含水分食物，使得大鼠變得干瘦、小便黃，糞便顆粒小，呈串珠樣或圓珠樣。限水法所得模型病理表現(xiàn)與STC相似，具有造模時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但恢復(fù)正常水分?jǐn)z入后模型的穩(wěn)定性情況及空氣濕度等生存環(huán)境對(duì)誘導(dǎo)模型的影響均有待進(jìn)一步探討。

2.2.3低纖維飲食法 膳食纖維攝入不足導(dǎo)致腸道蠕動(dòng)緩慢，從而出現(xiàn)排便困難。Kakino等[23]持續(xù)5周予以模型大鼠喂食低纖維飼料(41.5%的玉米淀粉、10.0%蔗糖、24.5%的牛奶酪蛋白、7.0%的礦物質(zhì)、10.0%糊精、6.0%的玉米油、1.0%維生素)，結(jié)果顯示，STC大鼠糞便重量、含水量較正常大鼠明顯下降。低纖維飲食誘導(dǎo)模型符合STC的發(fā)病過(guò)程，但Kakino等[23]僅通過(guò)檢測(cè)大鼠糞便性狀來(lái)判定模型成功與否，嚴(yán)謹(jǐn)性差，增加腸道傳輸檢測(cè)評(píng)估是否存在腸道蠕動(dòng)緩慢更為準(zhǔn)確；確切的誘導(dǎo)周期需要進(jìn)一步對(duì)比確定，以獲得一個(gè)準(zhǔn)確且穩(wěn)定的STC模型。

3 模型評(píng)價(jià)的方法

造模完成后，如何準(zhǔn)確評(píng)價(jià)模型是一個(gè)尤為關(guān)鍵的問(wèn)題，這關(guān)系到所建模型是否符合STC臨床及生理、病理特點(diǎn)，也影響后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3.1一般情況觀察 一般情況觀察指在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、進(jìn)食量、皮毛色澤、體重及糞便的粒數(shù)、重量、性狀等。造模成功后的大鼠多表現(xiàn)為喜靜、精神狀態(tài)差、食少、毛色枯黃、排便次數(shù)減少、顆粒變大且質(zhì)硬等情況，解剖見(jiàn)糞便集中在結(jié)腸段，呈串珠狀或球狀，質(zhì)干硬[24]。通過(guò)對(duì)動(dòng)物的一般情況觀察能夠直觀地發(fā)現(xiàn)其外在變化，是先于解剖檢測(cè)的整體判斷，但由于這種判斷一定程度基于操作者的主觀感受，存在一定主觀性，對(duì)操作者的經(jīng)驗(yàn)有一定要求，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

3.2排便情況觀察 評(píng)估糞便性狀，國(guó)內(nèi)通常參照Bristol糞便分型量表(Bristol stool form scale，BSFS)，共包含7類，其中BSFS1、BSFS2屬于便秘糞便性狀，BSFS4、BSFS5屬于正常糞便性狀[25]；記錄單位時(shí)間內(nèi)的糞便粒數(shù)、重量以量化排便情況，與正常大鼠相比，STC大鼠表現(xiàn)為糞便粒數(shù)、質(zhì)量下降；測(cè)定糞便含水率，通過(guò)測(cè)定動(dòng)物糞便干、濕重進(jìn)行推算，濕重即為新鮮糞便質(zhì)量，干重則是在適當(dāng)溫度下充分烘干后的糞便重量，糞便含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100%[26]。排便情況觀察能夠判斷模型是否出現(xiàn)便秘癥狀，但其他類型便秘亦有可能出現(xiàn)糞便干結(jié)現(xiàn)象，特異性差，無(wú)法將STC與其他類型便秘相區(qū)別，只能作為一個(gè)大體判斷的參考指標(biāo)。

3.3腸道傳輸功能測(cè)定 觀察首粒糞便排出時(shí)間，能夠直觀地了解大鼠排便是否延緩。為排除干擾，更為準(zhǔn)確記錄這一時(shí)間，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大都予模型動(dòng)物一些無(wú)法消化的有色介質(zhì)灌胃，常見(jiàn)介質(zhì)包括墨汁、活性炭、曙紅、酚紅、硫酸鋇等[25]。

結(jié)腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋訙?zhǔn)確、直觀地反映腸道的傳輸功能。陳霞等[27]造模結(jié)束后將STC動(dòng)物禁食24 h,灌入活性炭，經(jīng)一段時(shí)間等待后處死動(dòng)物，取出全部腸道，在無(wú)張力狀態(tài)下測(cè)量介質(zhì)在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度及腸道的全長(zhǎng),并計(jì)算推進(jìn)長(zhǎng)度占全腸道長(zhǎng)度的百分比，炭末推進(jìn)率(%)=炭末前端與幽門的距離(cm)/腸道總長(zhǎng)度(cm)×100%。國(guó)內(nèi)有學(xué)者提出，活性炭或墨汁在用于結(jié)腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中反映胃腸運(yùn)輸功能并不夠客觀，原因?yàn)檫@兩種介質(zhì)均能夠?qū)ξ改c道運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生一定影響，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[28]，對(duì)此，他們提出塑料球粒灌胃法，其結(jié)果與炭末灌胃法結(jié)果相吻合且具有操作簡(jiǎn)單、對(duì)腸道傳輸無(wú)影響、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但目前此方法尚未得到推廣，這可能與塑料球粒的制作工藝較為復(fù)雜有關(guān)。

3.4腸道張力測(cè)定 腸道張力異常提示腸道平滑肌功能障礙可能，為STC發(fā)病機(jī)制之一。張顏語(yǔ)[29]分別截取模型大鼠一段十二指腸及回腸，以BL>420 F(系統(tǒng)型號(hào))生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)量其腸道張力，結(jié)果顯示十二指腸無(wú)明顯改變，而回腸頻率下降。腸道張力能在一定程度反映腸道平滑肌狀態(tài)，是一個(gè)可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)，但目前有關(guān)腸道張力測(cè)定的報(bào)道主要截取腸段均為十二指腸及回腸，其結(jié)果并不能等同于結(jié)腸，因此結(jié)腸張力測(cè)定方法仍有待進(jìn)一步探索。

3.5腸道內(nèi)容物百分比測(cè)定 造模成功后，將取出的模型大鼠腸道稱重，縱切后用磷酸鹽緩沖液將腸壁充分沖洗干凈，濾紙吸干水分后，再次稱重，前后差值即為腸道內(nèi)容物總質(zhì)量，從而計(jì)算腸道內(nèi)容物百分比[30]。本方法操作簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，無(wú)介質(zhì)干擾腸道運(yùn)輸。但前后對(duì)比腸道內(nèi)容物百分比僅僅反映了糞便排出情況，并不能反映腸道傳輸過(guò)程存在的問(wèn)題；此外，腸壁沖洗及吸干水分不充分，腸壁糞便或水分殘留時(shí)可造成一定誤差。

3.6結(jié)腸肌電測(cè)定 結(jié)腸肌電動(dòng)作電位產(chǎn)生于慢波之上，同步于平滑肌收縮，作為主動(dòng)力作用于結(jié)腸產(chǎn)生推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)。慢波的異常會(huì)影響結(jié)腸收縮，進(jìn)而導(dǎo)致腸道傳輸延緩。通過(guò)結(jié)腸肌電測(cè)定，可對(duì)腸道運(yùn)輸功能進(jìn)行判斷，是一項(xiàng)重要的評(píng)估結(jié)腸動(dòng)力的手段。目前主要包括在體和離體兩種檢測(cè)方式。

3.6.1在體結(jié)腸肌電測(cè)定 吳本升等[26]將大鼠禁食、麻醉并消毒后，切開(kāi)腹部，在距盲腸2 cm處安放一對(duì)銀絲電極，固定于結(jié)腸腸壁，導(dǎo)線自切口引出連接系統(tǒng)，然后縫合，15 min后開(kāi)始記錄，連續(xù)記錄1 h，將每組5 min的記錄結(jié)果作為一個(gè)時(shí)間段，計(jì)算出每一組大鼠各個(gè)時(shí)間段的頻率和振幅的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)，慢波頻率變異系數(shù)(%)=慢波頻率標(biāo)準(zhǔn)差/慢波頻率均值×100%，慢波振幅變異系數(shù)(%)=慢波振幅標(biāo)準(zhǔn)差/慢波振幅均值×100%。他們發(fā)現(xiàn)，STC大鼠腸道振幅、頻率變異系數(shù)及振幅變異系數(shù)均顯著上升，提示STC大鼠結(jié)腸慢波節(jié)律顯著異常。通過(guò)在體結(jié)腸肌電測(cè)定，能夠較為準(zhǔn)確、客觀地反映模型大鼠腸道電生理情況，但在體開(kāi)腹檢測(cè)操作較為復(fù)雜，對(duì)操作者技術(shù)要求較高；易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染甚至死亡，對(duì)無(wú)菌操作要求較高。

3.6.2離體結(jié)腸肌電測(cè)定 乙酰膽堿對(duì)胃腸道具有正性作用，可刺激肌肉收縮。在一定張力負(fù)荷下，觀察藥物刺激前后腸道張力變化，以此判斷其動(dòng)力情況。徐天舒等[16]將STC大鼠結(jié)腸組織固定于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上，記錄經(jīng)乙酰膽堿刺激前后肌條變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STC大鼠結(jié)腸收縮幅度顯著低于正常大鼠。林強(qiáng)等[20]將制備好的STC大鼠環(huán)、縱行肌肌條放入恒溫肌槽(持續(xù)充入95%O2和5%CO2混合氣體并裝有37 ℃ Krebs緩沖液)，保持肌條活性，并在一定張力負(fù)荷下，測(cè)定肌條收縮振幅和頻率，結(jié)果顯示模型大鼠環(huán)、縱行肌肌條收縮振幅和頻率均明顯低于正常大鼠。

離體檢測(cè)不存在發(fā)生感染事件的情況，操作簡(jiǎn)便，能夠較為準(zhǔn)確地評(píng)估腸道動(dòng)力情況。但與在體檢測(cè)相比，不論是經(jīng)乙酰膽堿刺激后的離體檢測(cè)還是在恒溫肌槽中的離體檢測(cè)，均不能完全模擬動(dòng)物的活體情況，與活體的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果是否存在誤差仍有待確定；且離體檢測(cè)對(duì)肌條的制備及檢測(cè)的環(huán)境較高。

3.7結(jié)腸組織病理變化

3.7.1結(jié)腸組織大體形態(tài) 關(guān)于STC的研究，目前國(guó)內(nèi)外多使用蘇木精-伊紅染色法觀察腸道的大體形態(tài)改變，采用阿爾新藍(lán)或糖原染色觀察腸道黏液分泌情況[25]。Wallace和Keenan[31]使用蘇木精-伊紅染色對(duì)復(fù)方地芬諾酯誘導(dǎo)的大鼠近端結(jié)腸進(jìn)行觀察分析，并采用結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(結(jié)腸病理組織學(xué)指數(shù)=炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度評(píng)分+杯狀細(xì)胞損壞評(píng)分情況+病變深度評(píng)分)對(duì)結(jié)腸病理切片進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果提示，STC大鼠結(jié)腸隱窩深度較正常大鼠小，有大量的炎癥反應(yīng)，杯狀細(xì)胞丟失。Kim等[32]通過(guò)觀察洛哌丁胺建模發(fā)現(xiàn)，STC小鼠橫結(jié)腸黏膜、肌肉與扁平腔表面顯著變薄，黏蛋白分泌總量明顯變少。通過(guò)觀察結(jié)腸組織的大體形態(tài)，能夠一定程度判斷其病理變化是否與STC相吻合，但不同造模方法和部位結(jié)果有所差別，缺乏統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3.7.2腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS) ENS包括黏膜下神經(jīng)叢及肌間神經(jīng)叢，能夠相對(duì)獨(dú)立地調(diào)控腸道運(yùn)動(dòng)、分泌等多種生理功能。劉麗莎等[33]觀察發(fā)現(xiàn)，STC小鼠結(jié)腸黏膜下環(huán)肌層腸膠質(zhì)細(xì)胞、黏膜下神經(jīng)叢及肌間神經(jīng)叢的腸神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，電鏡下觀察腸膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)可見(jiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，部分核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。Cheng等[34]通過(guò)光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，STC患者結(jié)腸內(nèi)肌間神經(jīng)叢纖維在固有肌層間出現(xiàn)空泡變性，電鏡下盆腔副交感神經(jīng)有髓纖維有明顯空泡變性。Boschetti 等[35]發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重腸運(yùn)動(dòng)障礙患者的腸道推進(jìn)功能明顯受損，其腸神經(jīng)節(jié)間距離顯著增加，同時(shí)腸神經(jīng)和黏膜下神經(jīng)元數(shù)量減少。ENS的改變?yōu)镾TC重要發(fā)病機(jī)制之一，因此對(duì)于ENS的觀察是準(zhǔn)確評(píng)估模型不可或缺的一步。

3.7.3ICCs ICCs大多存在于肌間、黏膜下神經(jīng)叢，多為胃腸道起搏細(xì)胞，是胃腸道慢波的發(fā)起與傳播者，它在胃腸道平滑肌收縮節(jié)律、幅度、方向的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[35]。結(jié)腸ICCs減少以及分布、結(jié)構(gòu)、功能異常與STC發(fā)病密切相關(guān)。ICCs結(jié)構(gòu)的破壞或數(shù)量的減少可引發(fā)胃腸慢波改變，導(dǎo)致胃腸道蠕動(dòng)功能障礙[35]。酪氨酸激酶受體c-Kit為ICCs的特異性標(biāo)志物[36]，包云光等[6]通過(guò)蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，STC組結(jié)腸遠(yuǎn)端黏膜c-Kit陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較少。陳霞等[27]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，STC小鼠結(jié)腸c-Kit陽(yáng)性及ICCs數(shù)顯著減少。田宇和毛於安[37]使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),STC大鼠ICCs數(shù)顯著降低，ICCs交互網(wǎng)絡(luò)稀薄，細(xì)胞變窄變細(xì)；便秘大鼠ICCs自噬泡數(shù)量較正常大鼠增加，并表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞自噬性死亡，提示細(xì)胞自噬引發(fā)了STC大鼠腸道內(nèi)ICCs的數(shù)量降低。盡管ICCs與STC關(guān)系密切，但存在其他胃腸動(dòng)力障礙疾病與ICCs有關(guān)，因此ICCs的改變并不能作為STC的特異性病理改變，是否能以此作為STC模型評(píng)價(jià)方法目前仍存在爭(zhēng)議。

3.8腸道微生態(tài)測(cè)定 腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(丁酸為主)通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的釋放、改變腸道水鈉吸收、直接影響平滑肌收縮，從而改變結(jié)腸運(yùn)動(dòng)及排便情況[38]。楊穎等[4]通過(guò)對(duì)STC大鼠糞便培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，糞便中大腸埃希菌含量明顯上升，雙歧桿菌和乳酸菌含量明顯下降。其中，過(guò)量的大腸埃希菌可引起腸道微生態(tài)失衡，而雙歧桿菌及乳酸菌可通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸道pH值，對(duì)病原菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制作用，從而平衡腸道菌群[39-40]。然而，腸道菌群并非直接作用于腸道動(dòng)力，并不能直接反映STC的特點(diǎn)，故目前國(guó)內(nèi)外研究仍主要將該方法應(yīng)用于與腸道微生態(tài)相關(guān)研究中，尚未作為主要建模評(píng)價(jià)方法。

4 小 結(jié)

造模方法的不足：①同種造模方法缺乏統(tǒng)一實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)，不同報(bào)道之間基線期、給藥劑量、給藥劑型、造模周期等不盡相同；②各模型缺乏統(tǒng)一且準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)；③多數(shù)模型的穩(wěn)定性不明確，現(xiàn)有報(bào)道大多未考慮模型在停止給藥后是否會(huì)自行恢復(fù)問(wèn)題；④誘導(dǎo)方式單一，目前模型多為單一方法誘導(dǎo)的結(jié)果，有別于臨床發(fā)病原因復(fù)雜的特點(diǎn)。因此，在造模方法上，未來(lái)需要學(xué)者們努力的方向?yàn)椋孩偬剿魍N造模方法的最佳方案，為后來(lái)者提供一個(gè)統(tǒng)一的實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)；②重視對(duì)模型穩(wěn)定性的研究探索，推廣穩(wěn)定性強(qiáng)的方法，改進(jìn)或淘汰穩(wěn)定性差的方法；③探索更加符合臨床發(fā)病特點(diǎn)的復(fù)合模型。

造模評(píng)價(jià)方面，不同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道模型評(píng)價(jià)方法各異，涵蓋了一般情況、糞便情況、結(jié)腸動(dòng)力傳輸評(píng)估、結(jié)腸病理及電生理檢測(cè)、腸神經(jīng)測(cè)定、結(jié)腸ICCs檢測(cè)及腸道微生態(tài)等多種方法。但目前國(guó)內(nèi)外尚未形成一套統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，而評(píng)價(jià)的偏差也將深刻影響各項(xiàng)研究的結(jié)果。此外，羅馬Ⅳ提出“腦-腸互動(dòng)異?！边@一概念，精神心理因素與STC互為因果，但目前研究中，尚未看到關(guān)于模型動(dòng)物精神心理相關(guān)的描述及評(píng)價(jià)。一套完善的評(píng)價(jià)體系應(yīng)該以一般情況及糞便情況觀察為基礎(chǔ)，以判斷其是否符合便秘表現(xiàn)；以結(jié)腸傳輸測(cè)定為金標(biāo)準(zhǔn)，以明確模型是否符合STC表現(xiàn)。在此前提下，可根據(jù)不同研究目的增加腸道張力測(cè)定、結(jié)腸病理及電生理檢測(cè)、腸神經(jīng)測(cè)定、結(jié)腸ICC檢測(cè)及腸道微生態(tài)等方法，以明確模型是否符合STC病理生理改變。建立符合臨床疾病病理、生理特點(diǎn)的動(dòng)物模型是進(jìn)行一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的重要前提，也是需要全世界學(xué)者攻克的難點(diǎn)，未來(lái)還需要投入更多時(shí)間精力去探索完成。