EMT相關(guān)信號通路在膠質(zhì)母細胞瘤中的研究進展

李欣，丁漣沭

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 淮安 223300)

在成人原發(fā)性腦腫瘤中，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率最高，其中膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)惡性程度最高、侵襲性最強[1]。目前針對GBM的一線治療仍以手術(shù)切除為主[2]。對于失去手術(shù)機會或已經(jīng)行腫瘤切除的患者常采用二線治療，即采用放療同時輔以替莫唑胺化療的綜合治療[3]。然而，GBM細胞具有極強的增殖、遷移和侵襲能力，同時又具有高度異質(zhì)性，且由于存在血腦屏障，患者預(yù)后往往不佳，生存期僅為12～15個月，5年生存率只有3%～5%[4]。目前，GBM的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明。因此，探索GBM的發(fā)病機制、尋找安全有效的治療方法具有重要意義。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)指上皮來源的細胞失去極性而獲得間充質(zhì)表型的轉(zhuǎn)化過程，它是上皮細胞獲得遷移能力的有效途徑[5]。近年來，EMT在乳腺癌[6]、肝癌[7]、膀胱癌[8]等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。EMT的過程包含多條信號通路，信號通路之間可以相互協(xié)同、相互轉(zhuǎn)化。EMT與GBM發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，微RNA(microRNA，miRNA/miR)可通過相關(guān)信號通路誘導(dǎo)GBM發(fā)生EMT?，F(xiàn)對EMT相關(guān)信號通路及相關(guān)miRNA在GBM中的研究進展予以綜述，以期為GBM的研究提供理論依據(jù)。

1 EMT的概述、分類及其特征

在人體各類正常組織中，上皮細胞依靠各種連接及細胞極性維持完整性。上皮細胞的連接包括緊密連接、縫隙連接、黏附連接以及橋粒。而細胞極性主要來源于不同極性的蛋白復(fù)合物。這些蛋白復(fù)合物通常定位于細胞頂端和細胞基底外側(cè)區(qū)域，以此形成細胞頂端-基底端極性基礎(chǔ)。當(dāng)細胞失去上皮特性，即失去細胞間黏附和極性時就會發(fā)生EMT[9]。根據(jù)EMT發(fā)生的生物學(xué)背景，其可分為3種類型： Ⅰ 型EMT與胚胎發(fā)育有關(guān)，通過EMT實現(xiàn)胚胎發(fā)育過程中細胞多樣性；Ⅱ型EMT與傷口愈合和組織再生有關(guān)，通過EMT產(chǎn)生纖維細胞進行創(chuàng)傷修復(fù)及組織再生； Ⅲ 型EMT與癌癥進展有關(guān)，通過EMT而具有遷移及侵襲能力[9]。當(dāng)上皮細胞激活EMT后，其中的上皮鈣黏素(E-cadherin)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)，而N-cadherin則是間質(zhì)細胞標(biāo)志物。這一變化導(dǎo)致上皮細胞由典型的多邊形和鵝卵石形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧忓N樣的間質(zhì)細胞形態(tài)，因此失去了細胞頂端-基底端極性以及細胞完整性，從而誘導(dǎo)腫瘤細胞的遷移與侵襲[10]。

2 GBM中EMT相關(guān)信號通路

2.1轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad信號通路 TGF-β/Smad信號通路在正常細胞和早期癌中具有生長抑制作用，參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的EMT過程。在腫瘤進展過程中，癌細胞可以選擇性地避開TGF-β的抑制信號，同時保留功能正常的TGF-β受體和Smad系統(tǒng)，從而導(dǎo)致癌細胞黏附能力下降，遷移能力增強[11]。Lamouille等[12]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β通過與TGF-β受體1、TGF-β受體2結(jié)合，磷酸化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2、Smad3，隨后Smad2和Smad3在細胞質(zhì)中與Smad4結(jié)合形成三聚體復(fù)合物并進入細胞核，最終激活EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如Snail家族、ZEB家族和Twist，這些轉(zhuǎn)錄因子被激活后促進E-cadherin降解和N-cadherin表達，從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。TGF-β在GBM間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。miR-193b在GBM中高表達，可通過靶向抑制GBM中的Smad3調(diào)節(jié)TGF-β通路，從而促進腫瘤細胞的增殖[14]。余杰等[15]研究表明，敲低雙腎上腺皮質(zhì)激素樣激酶1對膠質(zhì)瘤細胞增殖遷移和侵襲的抑制作用與其抑制TGF-β/Smad信號相關(guān)。另有研究顯示，在GBM中高表達的Musashi-2可通過激活轉(zhuǎn)錄因子Snail和TGF-β/Smad通路正反饋激活EMT，促進GBM的惡性進展[16]。同樣，作為EMT蛋白的Slug可以被TGF-β激活，從而參與GBM中腫瘤血管的形成和血腦屏障的破壞[17]。由此可見，TGF-β/Smad信號通路可通過miRNA和一系列轉(zhuǎn)錄因子等誘導(dǎo)EMT，從而增強GBM增殖、遷移和侵襲能力。盡管TGF-β/Smad信號通路可以和其他信號通路協(xié)同作用維持細胞間質(zhì)表型，但該協(xié)同作用在GBM中尚未研究透徹，因此需要進一步探究TGF-β/Smad通路在GBM中誘導(dǎo)EMT的過程是否有其他通路參與。

2.2Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)信號通路 Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、組織器官形成過程中均具有重要作用。在正常上皮細胞中，Wnt/β-catenin信號通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin可以直接與E-cadherin結(jié)合，α聯(lián)蛋白可以與肌動蛋白連接，三者可形成復(fù)合物，以維持上皮細胞黏附和穩(wěn)定。在腫瘤細胞中，Wnt/β-catenin通路參與調(diào)控其EMT。作為Wnt/β-catenin信號通路的核心組成成分，激活后的β-catenin可以在細胞核內(nèi)聚集，從而增強GBM細胞的增殖和侵襲能力并誘導(dǎo)凋亡細胞死亡，而阻斷β-catenin可拮抗其致癌作用[18]。有研究表明，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1可結(jié)合β-catenin，以增強β-catenin的核移位以及轉(zhuǎn)錄活性，而叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1與β-catenin的相互作用是膠質(zhì)瘤形成的重要因素[19]。此外，盧雅麗等[20]研究表明，過表達β-catenin抑制基因2 可抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)移，使細胞中總β-catenin和活化β-catenin的表達水平明顯降低，而使磷酸化β-catenin的表達水平明顯升高，最終抑制膠質(zhì)瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活。同樣，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1在GBM細胞增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用，并通過Wnt/β-catenin信號通路參與EMT，故下調(diào)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1可抑制EMT，從而減弱GBM細胞的侵襲性[21]。有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路之間存在串?dāng)_及相互作用。PI3K拮抗劑可以與miR-125b抑制劑協(xié)同通過抑制Wnt/β-catenin信號通路增強替莫唑胺誘導(dǎo)的GBM的耐藥性[22]。由此可見，GBM的惡性進展往往伴隨著Wnt/β-catenin信號通路的激活。小分子Wnt調(diào)節(jié)劑已被用于刺激或抑制Wnt/β-catenin信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，如高遷移率族盒轉(zhuǎn)錄因子1[23]。然而，現(xiàn)有的許多針對Wnt/β-catenin信號通路化合物的研究仍基于體外細胞實驗，缺乏必要的動物實驗及臨床試驗證據(jù)。因此，未來研制阻斷該通路的抑制劑和特異性藥物可能是治療GBM的方向之一。

2.3促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路 MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，通常有3個信號通路：胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)/MAPK、p38 MAPK、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)。Yang等[24]研究表明，血管生成素樣蛋白2在膠質(zhì)瘤組織中高表達，當(dāng)敲除該基因后，腫瘤細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2水平顯著降低，ERK/MAPK信號通路的活性被阻斷，而使用U0126(ERK/MAPK抑制劑)后，基因敲減組腫瘤細胞增殖和侵襲能力明顯增強。而p38 MAPK通路的激活可以將細胞外刺激與細胞反應(yīng)聯(lián)系起來，從而增強腫瘤的侵襲性。過表達TGF-β激活的長非編碼RNA-ATB可以提高TGF-β誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞中磷酸化p38蛋白的表達水平，而磷酸化ERK和JNK的蛋白表達量未見明顯差異，使用p38 MAPK特異性抑制劑SB203580可以逆轉(zhuǎn)長鏈非編碼RNA-ATB介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞侵襲[25]?？梢姡L鏈非編碼RNA-ATB可通過p38 MAPK通路加速EMT進程，從而促進膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。有文獻表明，RND2基因是p38 MAPK通路的內(nèi)源性阻遏因子，它可以降低p38磷酸化，從而抑制p38 MAPK信號通路，使得GBM細胞自噬和凋亡顯著減少[26]。此外，Zhou等[27]研究認為，JNK信號通路在誘導(dǎo)自噬細胞死亡中起著重要作用，活化JNK可以促進GBM細胞的EMT，誘導(dǎo)自噬細胞死亡，增強GBM細胞的增殖和侵襲能力。綜上所述，ERK/MAPK、p38 MAPK、JNK 3個信號通路均可通過EMT促進GBM的惡性進展，但三者之間是否存在協(xié)同作用尚不清楚，因此MAPK信號通路在GBM中的機制還需進一步研究。

2.4Notch信號通路 Notch信號通路通常由4個受體(Notch1～4)和5個配體(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4)構(gòu)成。受體和配體通過相互作用，使整合素金屬蛋白酶和γ-分泌酶復(fù)合體對受體進行兩次蛋白水解，從而激活信號通路。激活后的Notch通路在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)EMT中起著關(guān)鍵作用[28]。Notch可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Snail、Twist等EMT相關(guān)信號分子來激活EMT，從而抑制E-cadherin的表達，促進N-cadherin和波形蛋白的表達，以增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[29]。通常Notch配體以自分泌的方式作用于其產(chǎn)生的細胞，TGF-β可以誘導(dǎo)Jagged1等Notch配體高表達，沉默Notch通路的成分可阻止TGF-β誘導(dǎo)EMT[30]。Sarkar等[31]研究表明，Jagged1的高表達與膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后有關(guān)，通過RNA干擾敲除Jagged1可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的存活和生長。

Notch通路在膠質(zhì)瘤中既可以作為癌基因發(fā)揮作用，也可以作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。一方面，膠質(zhì)瘤細胞亞群中Notch通路可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細胞與瘤內(nèi)不同位置細胞間的相互作用，增強其干細胞特性和侵襲能力，并通過激活致癌途徑(如PI3K/Akt)促進腫瘤的發(fā)展[32]，如Notch通過調(diào)節(jié)?；撬嵘险{(diào)基因1等長鏈非編碼RNA增強膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力[33]。另一方面，在不同亞型膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)了Notch失活突變和低表達Notch相關(guān)靶基因的個體。在敲除Notch基因的膠質(zhì)瘤小鼠模型中，Notch的缺失加速了膠質(zhì)瘤的形成與惡化，表明Notch在膠質(zhì)瘤中具有腫瘤抑制作用[34]。然而也有研究表明，敲除Notch基因可以增強GBM細胞的侵襲能力[35]。此外，Notch信號通路還可以通過與其他信號通路互相作用對GBM的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。在神經(jīng)母細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子1高表達的GBM干細胞中，Notch可與Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生協(xié)同作用，以抑制細胞分化并刺激增殖，從而促進腫瘤的惡性進展[36]。由此可見，Notch所有受體和配體是否均可通過EMT程序促進GBM細胞的惡性進展尚不清楚，Notch通路在GBM中的多重作用仍需進一步探究。

2.5PI3K/Akt/糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路與多種生物學(xué)進展有關(guān)，包括細胞增殖、干細胞維持和腫瘤持續(xù)生長[37]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它只有轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)膜并磷酸化后才能被激活。而PI3K的活性是Akt轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)膜過程中必不可少的。GSK-3β是Akt的靶標(biāo)。Gürsel等[38]研究表明，GSK-3β的活性在膠質(zhì)瘤干細胞的存活和凋亡調(diào)控中起重要作用。Akt的高水平磷酸化可以誘導(dǎo)GSK-3β發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致其失活。隨著GSK-3β的失活，β-catenin逐漸移位并積聚于細胞核，進而誘發(fā)EMT，導(dǎo)致細胞增殖和侵襲能力增強[39]。

PI3K/Akt通路是調(diào)控膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要信號通路。真核翻譯延長因子1D在GBM中高表達，敲除該基因后，E-cadherin表達升高，而N-cadherin、Snail、β-catenin等一系列間質(zhì)標(biāo)志物表達顯著下降，同時PI3K、磷酸化PI3K、Akt和磷酸化Akt的表達也明顯降低[40]。由此可見，敲除真核翻譯延長因子1D抑制了EMT和PI3K/Akt通路，進而影響GBM細胞的增殖和侵襲能力。Zhong等[41]使用PI3K和Akt抑制劑阻斷PI3K/Akt信號通路后發(fā)現(xiàn)，促癌基因LIM和SH3蛋白1 (LIM and SH3 protein 1，LASP1)誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞侵襲性顯著降低，而本應(yīng)在過表達LASP1膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)的波形蛋白和表達下調(diào)的E-cadherin也因PI3K/Akt信號通路的阻斷出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)，表明LASP1可通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)EMT，以發(fā)揮促癌作用。轉(zhuǎn)錄因子Snail可通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)EMT。在過表達LASP1的膠質(zhì)瘤細胞中，Snail表達上調(diào)，當(dāng)抑制PI3K/Akt通路后，Snail表達下調(diào)[41]。Gao等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，易位相關(guān)膜蛋白2在GBM中高表達，沉默易位相關(guān)膜蛋白2既可以顯著抑制GBM細胞的增殖、遷移和侵襲，也可明顯減少EMT的發(fā)生。而PI3K激活劑可逆轉(zhuǎn)易位相關(guān)膜蛋白2沉默對GBM生物學(xué)行為及EMT的影響，證實PI3K/Akt信號通路可誘導(dǎo)GBM發(fā)生EMT。PI3K/Akt/GSK-3β信號通路極其復(fù)雜，目前的研究尚未完全闡明，未來可能是GBM發(fā)生發(fā)展機制的研究方向之一。

3 GBM中EMT相關(guān)信號通路與miRNA

miRNA是真核生物中一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，由20～25個核苷酸組成，miRNA 可通過自身表達水平的改變調(diào)控相關(guān)目的基因的表達，從而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用。miRNA通過參與調(diào)控EMT影響GBM細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-504是GBM的腫瘤抑制因子，過表達miR-504可以直接抑制其靶基因FZD7，以阻斷Wnt/β-catenin信號通路，使β-catenin和磷酸化GSK-3β明顯減少，降低β-catenin 的核積聚，從而抑制EMT，減弱GBM細胞的遷移和侵襲[43]。另有文獻認為，當(dāng)Notch1過表達時，由miR-139-5p誘導(dǎo)的GBM的EMT及侵襲性行為均得到逆轉(zhuǎn)[44]。同樣作為腫瘤抑制因子的miR-451通過靶向CAB39抑制PI3K/Akt信號通路降低間充質(zhì)標(biāo)志物(如N-cadherin、Twist、Snail及波形蛋白)的表達，增加E-cadherin的表達，進而抑制GBM從上皮形態(tài)向間充質(zhì)形態(tài)的轉(zhuǎn)變[45]。另外，miRNA也可起到誘導(dǎo)促進EMT的作用。Ma等[46]研究表明，miR-10b可以協(xié)同TGF-β/Smad信號通路，使GBM中E-cadherin表達受到明顯抑制，波形蛋白表達明顯增加，從而誘導(dǎo)GBM細胞增殖、遷移和EMT。綜上，miRNA發(fā)揮促癌和抑癌作用均離不開EMT及其相關(guān)信號通路和信號分子。miRNA可作為治療GBM的潛在靶點和新方向，但目前缺乏miRNA通過MAPK信號通路誘導(dǎo)GBM發(fā)生EMT的文獻報道。

4 小 結(jié)

EMT是近年的研究熱點之一，其在人體多種病理生理過程中起重要作用。TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin、MAPK、Notch、PI3K/Akt/GSK-3β 5種信號通路通過一系列復(fù)雜信號分子調(diào)控GBM細胞的增殖、遷移和侵襲。不同信號通路之間也存在著相互作用和相互轉(zhuǎn)化，而這些過程往往離不開miRNA的參與。然而，目前關(guān)于EMT在GBM中的研究多停留于體外細胞實驗階段，缺乏可靠的動物實驗及臨床試驗的佐證。因此，未來還需進一步探究EMT在GBM中的作用機制，這不僅有助于闡明GBM的發(fā)病機制，還能為研制出針對GBM的安全有效的靶向藥物提供可靠的理論依據(jù)。