慢性疲勞綜合征動(dòng)物模型研究概況

李諾,楊添淞,馮楚文,屈媛媛,王慶勇,王德龍,李超然,楊燕,孫忠人，4

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院教務(wù)科，哈爾濱 150040； 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院針灸科，杭州 310005； 4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院針灸科，哈爾濱 150001)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)又稱肌痛性腦脊髓炎/慢性疲勞綜合征，是一種嚴(yán)重、慢性、復(fù)雜的多系統(tǒng)異質(zhì)性疾病[1-3]，目前應(yīng)用最廣泛的CFS診斷標(biāo)準(zhǔn)為CDC-1994診斷標(biāo)準(zhǔn)。CFS的主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的中樞性疲勞及勞力后不適，并伴隨記憶力減退、抑郁、軀體疼痛等癥狀[4-5]。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球CFS患者占總?cè)丝诘?.1%～1%[5-6]。據(jù)報(bào)道，25%～29%的CFS患者只能居家或臥床，且超過半數(shù)患者失業(yè)，只有19%的CFS患者全職工作，與癌癥、多發(fā)性硬化癥和腦卒中患者相比，CFS患者的生活質(zhì)量更差[7-9]。CFS的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及氧化硝化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)、下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活動(dòng)減退、腦神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、線粒體功能障礙、能量代謝障礙及遺傳易感性等[5,10-12]。動(dòng)物模型是研究CFS的有力工具，但由于CFS的異質(zhì)性及多重發(fā)病機(jī)制，目前國內(nèi)外尚無全面模擬人類CFS臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。現(xiàn)就國內(nèi)外常用CFS動(dòng)物模型的造模原理和建立方案予以綜述，以期為CFS模型的研究提供參考。

1 單因素造模

1.1強(qiáng)制游泳法(forced swimming test，F(xiàn)ST) 目前，國外最常用的CFS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷７椒镕ST，該造模方法模擬人類遭受的軀體和精神應(yīng)激，將動(dòng)物長期暴露于不可逃脫的環(huán)境中，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)出身心疲勞、焦慮、抑郁等行為學(xué)改變，刺激導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加、線粒體功能障礙、HPA軸功能減退、促炎性細(xì)胞因子水平及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)生改變。

Thakur等[13]將雄性白化小鼠置于室溫(22±3) ℃水容器內(nèi)游泳至力竭，每日10 min，連續(xù)21 d后，雄性白化小鼠出現(xiàn)CFS樣癥狀，表現(xiàn)為疲勞和焦慮樣行為，并伴有氧化應(yīng)激增加、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ減少以及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平下降。上述CFS模型小鼠的臨床、病理表現(xiàn)與人類CFS相似，可用于氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等方面的CFS研究，但CFS模型小鼠的5-HT水平下降，與研究報(bào)道的人類CFS患者5-HT水平升高相反[14]，這可能與檢測(cè)時(shí)間和部位不同有關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。Surapaneni等[15]將Charles Foster白化大鼠置于室溫(24～28) ℃環(huán)境中游泳至力竭，每日15 min，連續(xù)21 d，大鼠出現(xiàn)疲勞、抑郁和焦慮樣行為，同時(shí)氧化應(yīng)激增加，前額皮質(zhì)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ活性、線粒體膜電位及腎上腺重量和血漿皮質(zhì)酮水平均下降，符合CFS線粒體損傷、氧化應(yīng)激增強(qiáng)及HPA軸功能減退的病理機(jī)制。另有研究顯示，F(xiàn)ST可引起雄性白化小鼠促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平升高，提示炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]。

使用FST造模時(shí)，造模時(shí)間尤為關(guān)鍵。目前大多數(shù)采用FST建模的研究建模耗時(shí)在2周以上[13,15]。造模時(shí)需確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中水深足夠且恒定，以防止實(shí)驗(yàn)鼠逃脫或鼠尾接觸容器底部，且每次使用均重新更換用水。此法操作性強(qiáng)、重復(fù)性及穩(wěn)定性好，可模擬CFS的疲勞、焦慮、抑郁等臨床特征，符合CFS線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激增加及HPA軸功能減退的發(fā)病機(jī)制。但FST對(duì)CFS特征癥狀勞力后不適的影響尚不清楚。另外，F(xiàn)ST力竭游泳時(shí)間的界定尚不統(tǒng)一，相關(guān)文獻(xiàn)多將鼠頭沒于水面10 s作為力竭標(biāo)準(zhǔn)[17]，由于操作過程中環(huán)境干擾因素較多，無法準(zhǔn)確測(cè)量FST的不動(dòng)時(shí)間。

另有學(xué)者利用負(fù)重力竭游泳法建立身心疲勞的CFS模型，通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)CFS[18]。Sachdeva等[19]將負(fù)重其自身體重(10±2)%的雄性Wistar大鼠置于(22±3) ℃水中游泳至力竭，連續(xù)28 d后發(fā)現(xiàn)，大鼠出現(xiàn)疲勞、痛覺過敏、記憶障礙，并伴有氧化硝化應(yīng)激和血清TNF-α水平升高，提示氧化硝化應(yīng)激、促炎性細(xì)胞因子參與CFS的負(fù)荷模型。Zhang等[20]報(bào)道，負(fù)重力竭游泳法不僅可模擬類似疲勞的CFS癥狀，還可導(dǎo)致前額皮質(zhì)中成熟白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和血清丙二醛水平顯著升高，并伴有前額皮質(zhì)中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體表達(dá)增加，而核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體形成以及成熟IL-1β產(chǎn)生增加均符合人類CFS病理機(jī)制。采用負(fù)重力竭游泳法建立的CFS動(dòng)物模型的表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制與人類CFS接近，但其在模擬臨床癥狀(如勞力后不適)及病理機(jī)制(如線粒體功能障礙)等方面有一定的局限性，且動(dòng)物負(fù)重物體不統(tǒng)一，易在實(shí)驗(yàn)過程中滑脫。

1.2免疫誘導(dǎo)法 感染是觸發(fā)CFS的致病因素之一，可誘發(fā)免疫功能紊亂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[21-23]，最終發(fā)展為CFS。目前常被用于構(gòu)建CFS模型的病原體有純化的脂多糖、流產(chǎn)布魯氏菌和聚肌胞苷酸。

1.2.1細(xì)菌誘導(dǎo)法 細(xì)菌誘導(dǎo)法造模的機(jī)制是利用脂多糖或流產(chǎn)布魯氏菌等抗原與細(xì)胞系統(tǒng)相互作用，刺激活性氧產(chǎn)生、過氧亞硝酸鹽形成以及促炎性細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體發(fā)生氧化硝化應(yīng)激、免疫紊亂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，進(jìn)而誘發(fā)CFS[24-28]。Gupta等[28]予白化Laca小鼠腹腔注射脂多糖(1 mg/kg，每日1次)，連續(xù)19 d后小鼠不動(dòng)時(shí)間、痛覺過敏增加，且氧化應(yīng)激增加、TNF-α水平升高，成功建立CFS模型。Lee等[29]予雄性ICR小鼠單次腹腔注射脂多糖(3 mg/kg)后發(fā)現(xiàn)，其運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、肌肉力量或疼痛敏感性均未受影響，且被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)中無記憶喪失，前額皮質(zhì)和海馬中5-HT1A受體顯著激活，以上情況均與人類CFS相反[14]。此外,模型小鼠血清皮質(zhì)酮水平升高，而多數(shù)研究表明，CFS患者皮質(zhì)酮水平下降，這可能與應(yīng)激誘導(dǎo)的HPA軸功能亢進(jìn)在長時(shí)間應(yīng)激后轉(zhuǎn)換為HPA軸功能減退有關(guān)[30-31]。因此，該模型不適合CFS動(dòng)物模型。

持續(xù)19 d腹腔注射流產(chǎn)布魯氏菌(0.2 ml/只)Laca小鼠的不動(dòng)時(shí)間、痛覺過敏、氧化應(yīng)激增加，且TNF-α水平明顯升高[28]，提示小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激及免疫激活。Chen等[32]給予雌性BALB/c小鼠尾靜脈注射流產(chǎn)布魯氏菌(0.2 ml/只)6次后，小鼠出現(xiàn)日?；顒?dòng)減少、腦重/體重降低，并伴有海馬中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)水平降低。此模型制作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，模型癥狀和病理改變與人類CFS相似，但模型動(dòng)物死亡率較高，且缺少對(duì)海馬重量的觀察。另外，此模型在模擬臨床特征(如睡眠障礙和認(rèn)知異常)方面有一定的局限性。

1.2.2病毒誘導(dǎo)法 病毒誘導(dǎo)法是使用聚肌胞苷酸感染的雙鏈RNA進(jìn)行造模。Lee等[29]予雄性ICR小鼠單次腹腔注射聚肌胞苷酸(20 mg/kg)后，小鼠出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，且5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體和5-HT1A受體明顯激活，腦內(nèi)5-HT和色氨酸羥化酶2水平降低，這與人類CFS的發(fā)生機(jī)制不符。此外，CFS模型小鼠血清皮質(zhì)酮水平升高，而CFS患者皮質(zhì)酮水平下降[30-31]。因此，聚肌胞苷酸注射誘導(dǎo)不適用于CFS動(dòng)物模型的建立。

1.3慢性束縛應(yīng)激法 慢性心理應(yīng)激能夠直接單獨(dú)誘發(fā)CFS癥候群[33-34]。慢性束縛應(yīng)激是最常用的心理應(yīng)激源，屬于非損傷刺激。慢性束縛應(yīng)激用于CFS模型制作的原理是模擬發(fā)達(dá)地區(qū)狹小生活環(huán)境空間對(duì)人類心理的影響，使模型動(dòng)物再現(xiàn)人類CFS的疲勞、記憶力下降、抑郁等癥狀。王天芳等[34]將雄性Wistar大鼠放入特制束縛筒內(nèi)，以大鼠無強(qiáng)烈反抗為度，每天3 h，造模時(shí)間段隨機(jī)，連續(xù)14 d，使大鼠出現(xiàn)記憶力下降、抑郁傾向及活動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)能力下降等疲勞癥狀。孟昭琴等[35]在改進(jìn)慢性束縛應(yīng)激模型中發(fā)現(xiàn)，連續(xù)4周慢性束縛應(yīng)激循序加量1次，刺激時(shí)間分別為2、2.5、3、3.5 h，每日1次，每周5 d，模型動(dòng)物更易出現(xiàn)CFS癥狀，同時(shí)無特定病原體級(jí)雄性Wister大鼠體重、血清睪酮水平、胸腺重量顯著降低，IL-4水平下降、皮質(zhì)酮水平升高，與人類CFS中IL-4水平升高、皮質(zhì)酮水平降低相悖；且該模型大鼠γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)水平明顯降低，與CFS早期階段的患者IFN-γ水平升高相反[30-31,36-37]。慢性束縛應(yīng)激可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，與人類CFS相似程度高，可用于研究CFS的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，但其模擬氧化應(yīng)激增加、線粒體功能障礙等CFS病理機(jī)制的能力有限。此外，慢性束縛應(yīng)激還存在建模方案各異、造模工具不統(tǒng)一的問題。

2 多因素復(fù)合CFS模型

2.1慢性束縛應(yīng)激+強(qiáng)制冷水游泳法 人類CFS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，故目前多采用復(fù)合因素刺激建立CFS模型，以使其具有與人類CFS更好的關(guān)聯(lián)性，其中慢性束縛應(yīng)激+強(qiáng)制冷水游泳法造模最具代表性，也是目前國內(nèi)最常用的CFS造模方法，其造模原理是將慢性束縛模型與強(qiáng)制冷水游泳模型結(jié)合，使心理和軀體應(yīng)激共存，可達(dá)到與人類CFS較為接近的身心疲勞癥狀，且符合氧化應(yīng)激增加、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)功能紊亂的病理機(jī)制，但該方法操作步驟和類型多樣，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。He等[38]給予無特定病原體級(jí)雄性Wistar大鼠冷水游泳刺激，每日8:00將大鼠置于水溫(15±2) ℃的容器內(nèi)進(jìn)行力竭游泳，并于每日15:00進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激造模，每日1次，每次1 h，連續(xù)21 d后發(fā)現(xiàn)，模型大鼠出現(xiàn)疲勞樣改變，并伴有血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、IFN-β、IFN-γ、乙酰膽堿酯酶水平、CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比以及總抗氧化能力的明顯降低，而IFN-α水平、丙二醛活性及CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均顯著升高，此模型的癥狀和病理機(jī)制與人類CFS接近，但血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白M以及IFN-γ水平下降，與人類CFS不符[37,39]。錢桂鳳等[40]發(fā)現(xiàn)，除食欲不振、精神萎靡及活動(dòng)減少外，雄性SD大鼠還伴有氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛水平升高以及抗氧化劑超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性降低。成詞松等[41]研究顯示，雌雄兼用SD大鼠體內(nèi)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素及皮質(zhì)酮水平降低，提示存在HPA軸功能減退。王向義等[42]采用慢性束縛應(yīng)激+強(qiáng)制冷水游泳法造模，結(jié)果顯示，雄性SD大鼠體重下降，血清IFN-γ水平降低，IFN-γ/IL-4比值下降，提示輔助性T細(xì)胞2處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)。

2.2束縛+擁擠+噪音+跑臺(tái)法 束縛+擁擠+噪音+跑臺(tái)法模擬現(xiàn)代人生存環(huán)境(活動(dòng)時(shí)間范圍受限、生活空間擁擠、環(huán)境嘈雜、軀體處于疲勞狀態(tài))所導(dǎo)致CFS的發(fā)病途徑，使模型動(dòng)物再現(xiàn)人類CFS的焦躁、抑郁、疲勞等癥狀。Chi等[43]采用束縛、跑臺(tái)、擁擠、噪音的方法建立CFS模型，束縛：將雌性SD大鼠置于內(nèi)徑5.0 cm、長度20 cm的PVC管中，每次4 h；跑臺(tái)：強(qiáng)迫大鼠進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)(20 m/min，每日1 h)；擁擠：每組10只大鼠生活在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠中；噪音：播放搖滾樂刺激大鼠，每日4 h，應(yīng)用以上方式連續(xù)造模28 d后，大鼠出現(xiàn)焦慮、記憶力下降、身心疲勞癥狀。Shao等[44]基于以上分析結(jié)果，將SD大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)速度增加至25 m/min，暴露于搖滾樂的時(shí)間增加到12 h，結(jié)果表明與疲勞相關(guān)的血液生化指標(biāo)血尿素氮水平升高，皮質(zhì)酮水平下降，符合人體CFS的病理機(jī)制，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜分析表明，SD大鼠尿液中三羧酸循環(huán)、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝、鞘脂代謝和類固醇激素生物合成均有一定紊亂。束縛+擁擠+噪音+跑臺(tái)法建立的CFS模型的癥狀與人類CFS吻合度較高，但其與人類氧化應(yīng)激、免疫炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙及腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)改變等發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相似性仍需深入研究。

2.3負(fù)重力竭游泳+慢性不可預(yù)知應(yīng)激法 已知CFS的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的過程，負(fù)重力竭游泳+慢性不可預(yù)知應(yīng)激法應(yīng)用多因素聯(lián)合刺激建立CFS模型，模擬現(xiàn)代人體力超負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)、本能受挫、處于嘈雜環(huán)境等致病因素，以最大限度地復(fù)制人類各方面不定期的負(fù)性因素，進(jìn)而誘導(dǎo)多重應(yīng)激疲勞癥狀。楊燕等[45]將負(fù)重自身體重5%鉛塊的無特定病原體級(jí)雄性SD大鼠置于(25±2) ℃水中游泳至力竭，每日1次，并于每次負(fù)重力竭游泳后隨機(jī)進(jìn)行以下任意兩種不可預(yù)知的應(yīng)激刺激：禁食12 h、禁水 12 h、夾尾1 min、通宵照明、110分貝噪聲刺激1 h，采用以上方式連續(xù)刺激28 d后，大鼠出現(xiàn)記憶力下降、血清TNF-α和IL-10水平明顯升高、IFN-γ水平顯著下降，通過上述方法可建立炎癥反應(yīng)相關(guān)模型，但制備過程煩瑣、實(shí)驗(yàn)周期長，且IFN-γ水平變化與CFS患者不一致，故該模型與人類CFS氧化應(yīng)激增加、線粒體功能障礙、腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)改變及HPA軸活性降低等發(fā)生發(fā)展機(jī)制的相似性仍需深入研究。

3 小 結(jié)

目前，各類CFS動(dòng)物模型均存在一定的缺陷。首先，尚無能夠完全模擬人類CFS多重發(fā)病機(jī)制公認(rèn)、統(tǒng)一的CFS模型制備方案，且不同造模方法建立的動(dòng)物模型的病理發(fā)展過程不同。其次，CFS的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚不明確，現(xiàn)有CFS模型無法模擬CFS的所有臨床特征。在中醫(yī)藥研究中，目前CFS病證結(jié)合動(dòng)物模型尚不足，且尚未形成科學(xué)的評(píng)價(jià)體系。未來，需要運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)結(jié)合多學(xué)科交叉合作及不同檢測(cè)指標(biāo)聯(lián)合制備重復(fù)性更高、與人類CFS臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制更接近的公認(rèn)、合理的CFS動(dòng)物模型，以期推動(dòng)基礎(chǔ)科學(xué)研究向臨床實(shí)際應(yīng)用的成果轉(zhuǎn)化。