內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的機(jī)制研究進(jìn)展

徐利娟，馬麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，烏魯木齊 830000)

隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們物質(zhì)消費(fèi)觀念的變化，糖尿病的患病率不斷升高，患病群體逐漸低齡化。目前我國2型糖尿病患病率較高，糖尿病患者約1.5億，18歲以上人群糖尿病患病率為11.2%[1-2]，糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥，約50%的糖尿病患者并發(fā)DPN[3]，主要是感覺神經(jīng)病變，伴自主神經(jīng)病變，隨著疾病的進(jìn)展，常有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病變的特征[4]，表現(xiàn)為痛覺過敏、感覺異常等[5]。DPN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，相關(guān)研究主要集中在醛糖還原酶活性增加、晚期糖基化/糖氧化、氧化硝化應(yīng)激、蛋白激酶C、12/15脂氧合酶和受損的神經(jīng)營養(yǎng)支持等方面[6]。

DPN機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效的DPN治療方法。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為細(xì)胞蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制系統(tǒng)，參與蛋白質(zhì)的合成、折疊和運(yùn)輸，并且作為細(xì)胞內(nèi)鈣儲(chǔ)存和細(xì)胞應(yīng)激的傳感器，在慢性炎癥、應(yīng)激、高糖等狀態(tài)下，ERS反應(yīng)和未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)激活，通過降低細(xì)胞內(nèi)分泌蛋白的負(fù)荷增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊能力或啟動(dòng)不能恢復(fù)的細(xì)胞凋亡，以維持細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定，目前認(rèn)為ERS是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵。DPN的發(fā)病機(jī)制眾多，其中高血糖是DPN發(fā)生發(fā)展的主要原因[7]。近年發(fā)現(xiàn)，ERS在DPN發(fā)病過程中起重要作用[6]?，F(xiàn)對(duì)ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在DPN發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

DPN的發(fā)生發(fā)展與ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[8]。細(xì)胞內(nèi)1/3的蛋白質(zhì)合成、折疊和結(jié)構(gòu)成熟均發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，幾乎所有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和溶酶體中的蛋白質(zhì)都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合的核糖體上翻譯并注入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由一層單位膜形成的囊狀、泡狀和管狀結(jié)構(gòu)，分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)側(cè)，不僅能保證細(xì)胞內(nèi)鈣和脂質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，還具有胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，其中包括分泌蛋白的折疊。靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)有一個(gè)N端信號(hào)序列，該蛋白質(zhì)首先在核糖體上合成，進(jìn)而N端信號(hào)序列將其導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。這些蛋白質(zhì)通過轉(zhuǎn)座子復(fù)合體進(jìn)行共翻譯，當(dāng)翻譯完成時(shí)，蛋白質(zhì)上的信號(hào)序列被蛋白酶去除進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，并且折疊成獨(dú)特的三維形狀，并經(jīng)歷各種翻譯后修飾，包括糖基化和二硫鍵的形成[9]，上述過程都需要不同酶的催化，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)也有賴于其內(nèi)部富含的多種酶，包括伴侶酶、糖基化酶等。正確折疊的蛋白質(zhì)通過分泌途徑輸出，而不正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解過程中被特定的蛋白酶體降解。影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的生理、化學(xué)和病理因素均可導(dǎo)致其正常穩(wěn)態(tài)被打破，引發(fā)ERS，為了應(yīng)對(duì)這種情況，細(xì)胞激活適應(yīng)性信號(hào)通路——UPR通過翻譯后、翻譯、轉(zhuǎn)錄后和轉(zhuǎn)錄機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]，并通過促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、減少蛋白質(zhì)翻譯和促進(jìn)蛋白質(zhì)降解恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，這是細(xì)胞在壓力條件下所產(chǎn)生的自我保護(hù)與生存的功能，在輕度ERS下，蛋白質(zhì)折疊能力和細(xì)胞存活恢復(fù)，但持續(xù)的不可溶解的UPR激活可通過觸發(fā)凋亡程序消除應(yīng)激細(xì)胞[11]。

每個(gè)胰島β細(xì)胞每分鐘能合成和分泌100萬個(gè)胰島素分子，在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，這種蛋白質(zhì)合成負(fù)荷更大。發(fā)生糖尿病時(shí)，機(jī)體細(xì)胞處于高糖狀態(tài)，這種高糖狀態(tài)將會(huì)對(duì)細(xì)胞的代謝途徑產(chǎn)生影響，出于自我保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞會(huì)自行啟動(dòng)UPR，然而持續(xù)的高糖狀態(tài)可導(dǎo)致UPR觸發(fā)細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)指出，在機(jī)體自身生理?xiàng)l件下，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP)78與蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子(activating transcription factor，ATF)6以及肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE1)[12]的調(diào)節(jié)管腔結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其處于非活性狀態(tài)。發(fā)生UPR時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)競(jìng)爭與GRP78結(jié)合，導(dǎo)致GRP78分別與PERK、ATF6、IRE1分離，其下游通路分別被激活[13]。通過PERK-真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)2α-ATF4、IRE1-c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/胱天蛋白酶(caspase)12 和ATF6信號(hào)途徑的激活導(dǎo)致C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)增多，使促凋亡和抗凋亡蛋白的表達(dá)分別形成正負(fù)調(diào)節(jié)趨勢(shì)，caspase家族蛋白表達(dá)增多，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究表明，注射ERS誘導(dǎo)劑衣霉素健康大鼠后肢出現(xiàn)明顯疼痛、持續(xù)熱反應(yīng)喪失，且觸覺刺激異常敏感，類似于嚙齒動(dòng)物DPN的行為特征；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，服用ERS抑制劑4-苯基丁酸數(shù)分鐘內(nèi)糖尿病大鼠的縮足時(shí)間即改善，抗傷害作用呈劑量和時(shí)間依賴性，與局部給藥相比，全身給藥的效果改善更確切，表明高血糖介導(dǎo)的ERS發(fā)生在外周神經(jīng)中，對(duì)DPN的發(fā)生起促進(jìn)作用[14]。在高血糖狀態(tài)下，抑制ERS能夠明顯改善運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度，減輕小的感覺神經(jīng)纖維功能障礙和變性?？诜滊遄艟卣T導(dǎo)的糖尿病大鼠模型的坐骨神經(jīng)中GRP78表達(dá)降低，神經(jīng)傳導(dǎo)速度及其對(duì)機(jī)械和熱刺激的行為反應(yīng)改善，與野生型小鼠相比，注射鏈脲佐菌素C57B6 CHOP-/-小鼠的神經(jīng)功能改善更明顯，GRP78表達(dá)增加，進(jìn)一步說明ERS在DPN發(fā)生、發(fā)展中具有不可忽視的作用[15]。

2 ERS信號(hào)通路在DPN中介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

2.1PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路 PERK是一種Ⅰ型跨膜蛋白，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，PERK與GRP78解離后形成二聚體并發(fā)生自身磷酸化，自身磷酸化的PERK可使eIF2α發(fā)生磷酸化，進(jìn)而阻斷eIF2α循環(huán)，同時(shí)抑制蛋白質(zhì)合成所需的eIF2β鳥嘌呤核苷酸的交換活性，磷酸化的eIF2α可選擇性地誘導(dǎo)ATF4信使PNA(messenger RNA，mRNA)轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核上的ATF4可減弱整體翻譯并減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白負(fù)荷，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)所需的蛋白質(zhì)和伴侶的表達(dá)[16]，當(dāng)細(xì)胞持續(xù)處于高糖狀態(tài)時(shí)，其ERS持續(xù)被激活，ATF4持續(xù)過表達(dá)則會(huì)激活CHOP等基因的表達(dá)，CHOP是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最重要的標(biāo)志蛋白，在正常細(xì)胞穩(wěn)態(tài)過程中普遍低表達(dá)，而持續(xù)的ERS導(dǎo)致CHOP高表達(dá)。PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路是CHOP蛋白表達(dá)所必需的信號(hào)通路[17]；長期應(yīng)激使細(xì)胞核內(nèi)CHOP過量表達(dá)聚集，不僅能降低抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2的表達(dá)，加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18-19]，而且能增加凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，從而激活caspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。

PERK在糖代謝中有重要作用，研究表明，攜帶肝細(xì)胞特異性PERK缺失基因小鼠在其他代謝異常中表現(xiàn)出糖異生缺陷[21]。此外，Wolcott-Rallison綜合征是一種罕見的常染色體隱性疾病，被稱為人類糖尿病綜合征，以PERK基因編碼突變?yōu)樘卣?，臨床表現(xiàn)為2型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等，患者可出現(xiàn)多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、生長遲緩等癥狀[22]。高糖狀態(tài)下，高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型的PERK磷酸化水平顯著升高，葡萄糖刺激的胰島素分泌以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)均受到抑制，給予PERK抑制劑后，PERK磷酸化水平降低40%，葡萄糖刺激的胰島素分泌和胞質(zhì)鈣水平明顯恢復(fù)，血糖降低，其血糖降低程度與每日服用10 mg格列美脲的效果相似，說明PERK通路對(duì)2型糖尿病所致高血糖有一定作用[23]。

蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A6與PERK相互作用可抑制其蛋白反應(yīng)，而在正?；蚋咛谴碳は拢聊鞍踪|(zhì)二硫化物異構(gòu)酶A6表達(dá)小鼠的胰島素表達(dá)降低，表明PERK通路對(duì)糖尿病及DPN進(jìn)程均有影響[24]。早期的報(bào)道表明，PERK抑制劑可防止神經(jīng)退行性變，與正常大鼠相比，DPN大鼠模型坐骨神經(jīng)及脊髓中的PERK水平分別增加32%和37%，磷酸化的eIF2α增加27%，CHOP水平增加18%，同時(shí)DPN大鼠出現(xiàn)一系列周圍神經(jīng)系統(tǒng)癥狀與體征[15]。研究表明，在DPN大鼠鞘內(nèi)注射CHOP干擾小RNA后，DPN大鼠L4～5腰椎脊髓中PERK-ATF4-CHOP通路相關(guān)促細(xì)胞凋亡因子mRNA水平較前顯著降低，大鼠周圍神經(jīng)脫髓鞘現(xiàn)象相應(yīng)改善[25]。在高糖暴露下，DPN大鼠坐骨神經(jīng)和施萬細(xì)胞中CHOP、caspase-3和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白/B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2水平均顯著升高，表明ERS參與高糖狀態(tài)下DPN的發(fā)生發(fā)展[26]。

2.2IRE1信號(hào)通路 IRE1是一種Ⅰ型跨膜蛋白，由一個(gè)N端管腔感受器結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C端胞質(zhì)效應(yīng)區(qū)組成[27]，其管腔結(jié)構(gòu)域可感知錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，ERS持續(xù)的時(shí)間與程度決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在持續(xù)的ERS作用下，游離IRE1α通過寡聚和反式磷酸化的方式被激活，進(jìn)而激活X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)mRNA，并通過轉(zhuǎn)錄因子XBP1 mRNA的切割誘導(dǎo)XBP1的下游表達(dá)，最終激活下游凋亡蛋白CHOP[28]；除剪接XBP1 mRNA外，IRE1α活化后關(guān)聯(lián)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1觸發(fā)細(xì)胞死亡。IRE1α寡聚化能誘導(dǎo)許多促炎和促死亡蛋白的激活或上調(diào)，在ERS過程中，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2、caspase-12和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1被招募到IRE1α的激酶結(jié)構(gòu)域，JNK表達(dá)增加進(jìn)而激活caspase-3表達(dá)，同時(shí)IRE1α與多種促凋亡蛋白形成大分子信號(hào)復(fù)合物[29]，促進(jìn)促凋亡環(huán)境的建立，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在持續(xù)高糖作用下，IRE1α通路的作用甚至強(qiáng)于PERK信號(hào)通路，IRE1被持續(xù)高血糖或化學(xué)ERS源(如三酰甘油)激活，通過調(diào)節(jié)IRE1依賴性衰減活性降解胰島素mRNA，從而導(dǎo)致胰島素原減少，缺乏IRE1α-XBP1小鼠表現(xiàn)出多種代謝異常，代謝異常的類型取決于所涉及的細(xì)胞類型。肝細(xì)胞特異性缺失XBP1小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗，胰島β細(xì)胞IRE1α-XBP1途徑的缺失導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞功能障礙，包括胰島素分泌減少，導(dǎo)致細(xì)胞胰島素及胰島素原水平降低，胰島素原的氧化折疊減少[30]。IRE1α對(duì)高血糖的高敏感性提示其在DPN誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[31]。研究表明，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠后爪及坐骨神經(jīng)中IRE1α的磷酸化水平升高，導(dǎo)致XBP1的總蛋白和mRNA水平以及GRP78水平顯著升高。同樣，p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和JNK1/2的磷酸化水平顯著增加[14]。而敲除IRE1α基因或其抑制劑已用于干預(yù)糖尿病及其他代謝紊亂。實(shí)驗(yàn)研究表明，鞘內(nèi)注射IRE1α干擾小RNA可使DPN大鼠和離體施萬細(xì)胞的凋亡分別減少77%和65%，在體實(shí)驗(yàn)表明，抑制IRE1α可有效改善坐骨神經(jīng)脫髓鞘病變，增加表皮神經(jīng)纖維密度，提高運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度。體外實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染IRE1α干擾小RNA可抑制施萬細(xì)胞凋亡，這可能與DPN過程中IRE1通路中的相關(guān)凋亡蛋白CHOP和磷酸化JNK的下調(diào)有關(guān)[18]。用于治療DPN的中藥復(fù)方制劑糖絡(luò)寧的含藥血清已被證實(shí)可降低磷酸化的IRE1α/IRE1α和XBP1的表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，高糖環(huán)境下，糖絡(luò)寧干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完整性較好，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少[11]。

2.3ATF6信號(hào)通路 在ERS狀態(tài)下，GRP78的解離導(dǎo)致PERK和IRE1發(fā)生寡聚和自磷酸化，而ATF6的激活則與其不同，當(dāng)ATF6與GRP78分離后，ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體，進(jìn)而被兩種絲氨酸蛋白酶(S1P和S2P)切割，切割后的片段轉(zhuǎn)運(yùn)入胞核，誘導(dǎo)GRP78、GRP94和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57等伴侶蛋白的轉(zhuǎn)錄[32]，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白折疊能力；此外，ATF6還可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的降解[33]。ATF6 信號(hào)通路對(duì)預(yù)防糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞的丟失至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)維持DPN神經(jīng)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。高脂飲食以及過度或不足的運(yùn)動(dòng)可以激活骨骼肌中的ERS，而反復(fù)適度的耐力運(yùn)動(dòng)可減弱與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的各種伴侶分子激活，從而保護(hù)骨骼肌細(xì)胞。研究表明，糖尿病小鼠骨骼肌中ATF6的表達(dá)顯著增加，游泳可以減少ATF6的表達(dá)，表明糖尿病激活了ERS，而游泳通過減少骨骼肌中ATF6的表達(dá)減弱ERS[34]。實(shí)驗(yàn)研究表明，在胰島素抵抗以及糖尿病發(fā)生發(fā)展過程，ERS也作為主要機(jī)制參與其中，在慢性高血糖狀態(tài)下，ERS是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的主要因素，進(jìn)而降低胰島素?cái)z糖及耗糖能力。二甲雙胍是經(jīng)典的降糖藥物，可提高糖尿病大鼠的胰島素?cái)z糖及耗糖能力，其作用機(jī)制為下調(diào)ATF6，改善大鼠ERS[35]，說明ATF6信號(hào)通路在糖尿病進(jìn)展過程中起重要作用。在小鼠DPN模型中，XBP1的核易位受損可加重DPN，并與轉(zhuǎn)錄因子ATF6和CHOP水平增加有關(guān)[36]。

3 小 結(jié)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞的所有關(guān)鍵部分均存在密切的物理和功能聯(lián)系，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是協(xié)調(diào)體內(nèi)代謝平衡和內(nèi)外應(yīng)激反應(yīng)的中心平臺(tái)，慢性ERS引起的細(xì)胞損傷正成為糖尿病、神經(jīng)退行性變、卒中和癌癥等廣泛流行的人類疾病的病理生理學(xué)核心。鑒于全球超重和肥胖的流行，了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝適應(yīng)的基礎(chǔ)生物學(xué)可能為代謝紊亂提供新的治療方法。ERS及其直接參與的細(xì)胞凋亡過程均為DPN患者以及動(dòng)物模型DPN演變進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)，基于機(jī)制的治療方法可以預(yù)防這種損傷級(jí)聯(lián)并有效改善DPN的癥狀和體征，研發(fā)能夠調(diào)節(jié)ERS相關(guān)分子的藥物，可能為DPN的治療提供新思路。一些天然化合物有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體功能機(jī)制的研究，但藥理學(xué)上，上述物質(zhì)在人類疾病治療中的應(yīng)用仍面臨較大挑戰(zhàn)，包括ERS操作的多效性、化合物藥理學(xué)靶向可能導(dǎo)致的非靶向不良反應(yīng)等，但結(jié)合目前相關(guān)的科研學(xué)術(shù)成果推測(cè)，針對(duì)ERS途徑的干預(yù)措施以及增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能是未來探索DPN治療方法的新方向。