中性粒細(xì)胞在結(jié)核病中作用的研究進(jìn)展

林懿騫 張 敏

暨南大學(xué)附屬廣州紅十字會(huì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東廣州 510220

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）引起，主要通過空氣傳播的一種傳染病，目前是一個(gè)重要的全球健康問題。最新報(bào)告指出，2019年全球約有1/4的人口感染結(jié)核分枝桿菌，其中新增TB患者約有1000萬例，死亡人數(shù)約為122萬例，病死率仍然居于單一傳染病首位[1]。結(jié)核分枝桿菌的感染取決于其與宿主多種免疫細(xì)胞的相互作用，其中，中性粒細(xì)胞是最早被募集到感染部位，也是肺部結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)最多的免疫細(xì)胞，這已在多種TB模型中被證實(shí)[2]。近年來，很多研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞在TB中不僅發(fā)揮著病原體的直接殺滅作用，也在分子調(diào)節(jié)及病理損傷中具有重要的作用。因此，本文就中性粒細(xì)胞在結(jié)核病中作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1 中性粒細(xì)胞在結(jié)核病的早期免疫

1.1 中性粒細(xì)胞在結(jié)核病的趨化與募集

病原體侵入機(jī)體后，中性粒細(xì)胞被白細(xì)胞介素-8 （interleukin-8，IL-8/CXCL8）等趨化因子激活，其G蛋白耦聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）構(gòu)象發(fā)生改變，從而使中性粒細(xì)胞在流動(dòng)條件下牢固黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，然后順著補(bǔ)體 5a（complement component 5a，C5a）等趨化因子的濃度梯度在血管內(nèi)皮上遷移，最后通過周細(xì)胞間隙進(jìn)入受感染區(qū)域[3]。有一項(xiàng)研究表明，新型C型凝集素受體CLEC9A在與結(jié)核分枝桿菌結(jié)合后介導(dǎo)激活脾臟酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑，選擇性上調(diào) CXCL8，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集[4]。但是，在較早的一項(xiàng)小鼠實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)的胞外-5’-核苷酸酶（CD73）在缺氧情況下會(huì)刺激內(nèi)皮細(xì)胞形成內(nèi)皮屏障，降低結(jié)核分枝桿菌感染后中性粒細(xì)胞的大量募集[5]。而另一項(xiàng)斑馬魚的實(shí)驗(yàn)研究也表明，在分枝桿菌感染后，機(jī)體的miR-206會(huì)明顯上調(diào)，通過抑制Cxcl12/Cxcr4信號(hào)軸，進(jìn)而減少中性粒細(xì)胞向感染區(qū)域的募集[6]。可見，結(jié)核分枝桿菌對(duì)中性粒細(xì)胞的募集及趨化作用是雙向的，而且是多途徑并且受體內(nèi)理化因素的影響，這突出了中性粒細(xì)胞對(duì)分枝桿菌免疫反應(yīng)的復(fù)雜性。

1.2 中性粒細(xì)胞在結(jié)核病的吞噬作用

中性粒細(xì)胞在到達(dá)感染部位后，表達(dá)出Fc受體、C型凝集素受體、模式識(shí)別受體、補(bǔ)體受體等受體[7]，還會(huì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌表面的海藻糖二霉菌酸酯（trehalose-6，6-dimycolate，TDM）及硫脂（sulpholipids，SL）選擇性識(shí)別[8]，繼而啟動(dòng)吞噬作用：由偽足沿著與細(xì)菌結(jié)合的部位從四周伸展包抄，最后收口直至脫離質(zhì)膜形成吞噬體。Wilson等[9]發(fā)現(xiàn)，C型凝集素受體中CLECSF8影響結(jié)核分枝桿菌與中性粒細(xì)胞結(jié)合，其缺乏會(huì)明顯減少結(jié)核分枝桿菌與中性粒細(xì)胞的結(jié)合，降低中性粒細(xì)胞的吞噬作用。中性粒細(xì)胞表面存在的許多模式識(shí)別受體，盡管在過去的研究中被認(rèn)為在控制體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌感染方面是冗余的[10]，但是CLECSF8的研究讓人們意識(shí)到其在中性粒細(xì)胞吞噬中的重要作用。另一方面，分枝桿菌膜糖脂在與人中性粒細(xì)胞質(zhì)膜脂筏中的乳糖神經(jīng)酰胺 （lactosylceramide）結(jié)合后降低了誘導(dǎo)部分激酶的集合能力，阻礙了吞噬溶酶體的形成[11]，從而使結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和復(fù)制。結(jié)核分枝桿菌上的膜糖脂對(duì)乳糖神經(jīng)酰胺的作用或許能成為抗結(jié)核治療的新靶點(diǎn)。

1.3 中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)、中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)（neutrophil extracellular traps，NETs）在結(jié)核病中的作用

在中性粒細(xì)胞吞噬病原體后形成吞噬溶酶體，激發(fā)細(xì)胞的呼吸爆發(fā)形成活性氧（reactive oxygen species，ROS）。吞噬溶酶體上的NADPH氧化酶會(huì)通過將電子轉(zhuǎn)移到分子氧上生成超氧陰離子，然后通過超氧化物歧化酶及髓過氧化物酶轉(zhuǎn)化為過氧化氫、次氯酸和其他反應(yīng)性中間體，從而消除病原體[12]。然而在一項(xiàng)小鼠的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白PPE2與NADPH氧化酶的胞質(zhì)亞基p67相互作用，并阻止p67phox和p47phox定位到膜上，破壞了NADPH氧化酶復(fù)合物的組裝，導(dǎo)致NADPH 氧化酶活性降低，抑制活性氧的產(chǎn)生，從而有利于結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的存活[13]。更早的研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌會(huì)分泌出超氧化歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、整合膜蛋白（integral membrance protein）和巰基氧化還原酶（thiol-oxidoreductase）等形成膜相關(guān)氧化還原酶復(fù)合物 （membrane-associated oxidoreductase complex，MRC），通過氧自由基解毒和硫醇穩(wěn)態(tài)之間的協(xié)調(diào)來克服惡劣的氧化環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌自身分泌等多種蛋白使其有效躲避活性氧作用，降低中性粒細(xì)胞的殺菌作用[14]。因此，如何抑制相關(guān)蛋白的分泌，增加活性氧作用或許能成為另一個(gè)治療途徑。

中性粒細(xì)胞除了通過活性氧及脫顆粒作用破壞病原體外，還釋放一種稱為NETs的結(jié)構(gòu)，可以捕獲和殺死微生物。NETs是中性粒細(xì)胞的一種獨(dú)特的免疫應(yīng)答方式，其主要是由DNA組成骨架，多種蛋白包裹于內(nèi)，通過其特殊的三維結(jié)構(gòu)捕獲病原體，并通過抗菌蛋白對(duì)病原體進(jìn)行殺滅[15]。Ⅰ型干擾素是由先天性免疫細(xì)胞介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的抗病毒轉(zhuǎn)錄因子，但在活動(dòng)性肺結(jié)核中，Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄會(huì)增多，進(jìn)而促進(jìn)中性粒細(xì)胞形成NETs，NETs會(huì)引起免疫性損傷并最終破壞組織，反而推動(dòng)了病情的進(jìn)展[16]。另一面NETs因與游離的分枝桿菌有相似內(nèi)徑而能容納分枝桿菌[17]，從而保護(hù)細(xì)菌免受機(jī)體環(huán)境的壓力，反而促進(jìn)了其傳播。研究發(fā)現(xiàn)，NETs結(jié)構(gòu)對(duì)多數(shù)病原體如革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌都表現(xiàn)出明顯的殺菌作用[18]，然而其對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺菌作用卻有所減弱，不但保護(hù)了細(xì)菌的生存，同時(shí)也促進(jìn)了細(xì)菌對(duì)組織的損傷，因此抑制該結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生或許能有效減緩病情的發(fā)展。

1.4 中性粒細(xì)胞在結(jié)核病中的自噬與凋亡作用

自噬是一種確保細(xì)胞在壓力條件下生存的機(jī)制，是將受損的細(xì)胞器等物質(zhì)通過溶酶體形成自噬體，進(jìn)行降解再利用的過程，其也參與機(jī)體生長發(fā)育、免疫、腫瘤等病理生理過程。在過去，我們已經(jīng)知道中性粒細(xì)胞可以通過自噬殺滅炭疽芽孢桿菌[19]，而在最近的研究中顯示，在感染結(jié)核分枝桿菌后，結(jié)核分枝桿菌抗原會(huì)刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)共刺激因子信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子家族成員1（SLAMF1），其會(huì)激活及誘導(dǎo)自噬體的形成，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的自噬作用。但同時(shí)該組研究人員也發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞的自噬水平顯著降低。SLAMF1 水平較低，考慮與某些人類病理過程中共刺激分子的失衡有關(guān)[20]，仍需進(jìn)一步研究其中的矛盾機(jī)制。另一方面，杜金艷等[21]發(fā)現(xiàn)，感染結(jié)核分枝桿菌后，患者外周血中控制中性粒細(xì)胞自噬的相關(guān)基因Beclin 1的表達(dá)明顯下降，中性粒細(xì)胞中自噬標(biāo)志性蛋白LC3降低。表明在結(jié)核分枝桿菌感染后，中性粒細(xì)胞自噬功能會(huì)受到限制。

凋亡對(duì)于炎癥消退至關(guān)重要，中性粒細(xì)胞形成ROS、脫顆粒等過程后的產(chǎn)物會(huì)對(duì)機(jī)體自身造成損害，需要及時(shí)發(fā)生凋亡而易于被巨噬細(xì) 胞吞噬，并從系統(tǒng)中分解，這一過程的延遲及失效可導(dǎo)致組織損傷及病理改變。在早期的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，凋亡的中性粒細(xì)胞通過激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase-1）和白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放，增強(qiáng)了控制毒性結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞內(nèi)生長的能力[22]。但是，另一方面結(jié)核分枝桿菌利用毒力因子來限制體內(nèi)中性粒細(xì)胞的凋亡，并增加中性粒細(xì)胞的壞死[23]。這一過程減弱了上述控制細(xì)菌胞內(nèi)生長的能力，反而增加了中性粒細(xì)胞壞死的數(shù)量，壞死的中性粒細(xì)胞會(huì)削弱機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的控制，降低保護(hù)性細(xì)胞因子反應(yīng)[24]。

2 中性粒細(xì)胞在結(jié)核肉芽腫中的作用

與大部分細(xì)菌感染不同，人類機(jī)體的防御機(jī)制難以完全清除結(jié)核分枝桿菌，當(dāng)活動(dòng)性結(jié)核病被控制后，結(jié)核分枝桿菌會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)[25]，體內(nèi)形成肉芽腫，它是由上皮樣細(xì)胞聚集形成的保護(hù)結(jié)構(gòu)以隔離結(jié)核分枝桿菌，避免其造成進(jìn)一步損害，但同時(shí)其也成為擴(kuò)大傳播的一種機(jī)制[26]。中性粒細(xì)胞是肉芽腫內(nèi)的主要炎癥細(xì)胞之一[27]。Gideon等[28]在結(jié)核分枝桿菌感染獼猴實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等多種細(xì)胞因子，與外周血相比，肺肉芽腫內(nèi)的中性粒細(xì)胞具有更高程度的多功能性，參與了肉芽腫的細(xì)胞因子環(huán)境，可能是結(jié)核肉芽腫中重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。Scott等[29]發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞胞質(zhì)大量存在的鈣結(jié)合蛋白S100A8/A9在結(jié)核慢性肉芽腫中間接或直接地介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的積聚，此外，在募集至肺部后，結(jié)核分枝桿菌感染誘導(dǎo)的 S100A8 / A9 蛋白可能會(huì)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的吞噬受體表達(dá)，從而使中性粒細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌感染增加，促進(jìn)了疾病的進(jìn)展。在過去，肉芽腫的組織壞死曾被認(rèn)為是疾病轉(zhuǎn)歸的標(biāo)志，近期的斑馬魚實(shí)驗(yàn)證明，中性粒細(xì)胞隨時(shí)間在肉芽腫內(nèi)的募集，并發(fā)現(xiàn)與肉芽腫壞死成反比，一定程度的肉芽腫壞死可能是控制分枝桿菌感染的有效過程，是平衡感染與免疫的結(jié)果[30]。

3 總結(jié)

綜上所述，在結(jié)核感染過程中，中性粒細(xì)胞如同一柄雙刃劍，一方面通過加強(qiáng)早期募集、吞噬，增強(qiáng)功能性等正面抵抗著結(jié)核分枝桿菌的入侵，另一方面，NETs結(jié)構(gòu)會(huì)被結(jié)核分枝桿菌用于逃避免疫，增強(qiáng)機(jī)體的炎性反應(yīng)，而晚期的中性粒細(xì)胞聚集則會(huì)加強(qiáng)肺部病理損傷。此外，中性粒細(xì)胞在結(jié)核感染過程中表現(xiàn)出異質(zhì)性，如出現(xiàn)更多的低密度中性粒細(xì)胞（low density neutrophils，LDNs）[31]，在肉芽腫內(nèi)的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出更高程度的多功能性。其中的部分機(jī)制尚未完全清楚。結(jié)核感染過程中，中性粒細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞間的相互影響與調(diào)節(jié)，及與結(jié)核分枝桿菌的相互作用仍有待進(jìn)一步研究闡明，這將有助于更好地理解其在結(jié)核病中的作用。