骨髓增殖性腫瘤非驅(qū)動(dòng)基因突變對(duì)疾病表型的影響

趙越，蘇雁華，高玉娟，許鑫

作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是由造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的體細(xì)胞突變驅(qū)動(dòng)的血液系統(tǒng)疾病。JAK-STAT通路在MPN的發(fā)病機(jī)制中起著核心作用。經(jīng)典MPN的遺傳基礎(chǔ)已被廣泛研究，超過(guò)95%的真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）病人以及超過(guò)50%的原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）和原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF）病人存在Janus激酶2（JAK2）的單個(gè)氨基酸突變，稱為JAK2V617F突變，該突變存在于0.1%的個(gè)體中，并且與MPN的發(fā)展密切相關(guān)［1-2］。在大多數(shù)JAK2V617F陰性PV病人中，JAK2基因第12外顯子的突變也被確定為疾病驅(qū)動(dòng)因素［3］。CALR突變（calreticulin gene mutation）是繼JAK2V617F之后的第二常見(jiàn)突變，在ET和PMF病人中占25%～35%［4］。血小板生成素受體（MPL）突變是另一個(gè)占ET和PMF的3%～5%的主要疾病驅(qū)動(dòng)因素［5］。這三種突變幾乎以互斥的方式發(fā)生，很少有共同發(fā)生的報(bào)道［6-7］。三個(gè)突變都不攜帶的病人是多克隆的，被分類為“三陰性”病人［8］。除了JAK2，CALR和MPL突變外，一些非驅(qū)動(dòng)突變也會(huì)導(dǎo)致MPN表型和疾病異質(zhì)性。盡管它們中的大多數(shù)不是特定發(fā)生于MPN，但這些突變被認(rèn)為在MPN發(fā)育的不同階段起作用，包括克隆性造血的啟動(dòng)，疾病進(jìn)展為繼發(fā)性骨髓纖維化和白血病轉(zhuǎn)化。

1 DNA甲基化修飾劑

TET2（TET oncogene family member 2）突變是最常見(jiàn)的非表型驅(qū)動(dòng)程序突變，在多達(dá)22%的MPN中存在，在PV中突變頻率大約為16%，ET中5%，PMF中17%，PV后MF中14%，ET后MF中 的14%和MPN急 變 期（MPN in blast phase，MPN-BP）的17%［9］。TET2通過(guò)將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）在DNA甲基化中起關(guān)鍵作用。正常TET2功能的喪失會(huì)降低5hmC的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA超甲基化。這對(duì)HSC增加自我更新基因標(biāo)記的表達(dá)，使造血細(xì)胞對(duì)協(xié)同突變敏感并偏向骨髓單核細(xì)胞分化具有特殊作用［10］，并使造血細(xì)胞對(duì)協(xié)同突變敏感。Fran?ois等［11］發(fā)現(xiàn)，染色體4q24的缺失或重排是TET2功能喪失的另一種機(jī)制，并進(jìn)一步證實(shí)了該突變的早期分化及其與JAK2V617F突變的協(xié)同作用，但關(guān)于TET2突變及其是否影響轉(zhuǎn)化為急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的 風(fēng) 險(xiǎn) 存 在 爭(zhēng) 議［12］。在TET2突 變 之 前 獲 得JAK2V617F突變的病人具有更嚴(yán)重的表型，與ET相比，被診斷為PV的可能性更大，并且患血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增加，在JAK2V617F之前出現(xiàn)的TET2傾向于ET表型［13］。比較單突變JAK2V617F誘導(dǎo)的MPN和雙突變JAK2V617F和TET2突變型誘導(dǎo)的MPN的表型，JAK2V617F突變細(xì)胞受體的巨核細(xì)胞形成密集的簇，并且明顯多于來(lái)自野生型細(xì)胞受體的巨核細(xì)胞，還顯示出異常的核質(zhì)比、小葉核。此外，雙突變細(xì)胞不僅表現(xiàn)出JAK2V617F細(xì)胞受體的表型，而且還表現(xiàn)出白細(xì)胞增多，脾腫大和嚴(yán)重的髓外造血功能延長(zhǎng)，總生存期略短。

DNMT3A（DNA methyl transferase3A）負(fù)責(zé)控制CpG二核苷酸處的DNA甲基化［14］，在不到10%的MPN中發(fā)現(xiàn)了此突變，DNMT3A在髓樣惡性腫瘤中最常見(jiàn)的突變是一種錯(cuò)義突變，尤其是甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（R882）中的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致酶活性降低和再次DNA甲基化［15-16］。在MPN的JAK2V617F陽(yáng)性模型中使用CRISPR模型使DNMT3A功能喪失，會(huì)阻止紅系增殖并引起骨髓內(nèi)和肝內(nèi)纖維化并浸潤(rùn)脾臟，還會(huì)導(dǎo)致異常的自我更新和炎癥信號(hào)通路，以上結(jié)果確定了JAK2V617F驅(qū)動(dòng)的MPN與DNMT3A丟失之間的致癌協(xié)同作用，從而激活了造血干/祖細(xì)胞增強(qiáng)劑驅(qū)動(dòng)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)［17］。Guryanova等［18］也發(fā)現(xiàn)，DNMT3A功能喪失誘導(dǎo)體內(nèi)成熟的骨髓和骨髓祖細(xì)胞擴(kuò)增，脾臟增大并散在發(fā)育異常的巨核細(xì)胞，在DNMT3A缺失小鼠的骨髓中觀察到了正常成人造血幾乎不存在的cKit+，CD41+群體。

異檸檬酸脫氫酶1和2［Wild-type isocitrate dehydrogenase（NADP+）1 and 2，IDH1，IDH2］突變發(fā)生在少于5%的慢性期MPN中，但多數(shù)發(fā)生在20%至30%的MPN后AML病人中，突變發(fā)生在PMF較PV或ET更常見(jiàn)［19］。IDH突變體增加了2-羥基戊二酸酯（2-HG）的產(chǎn)生，從而阻止了組蛋白去甲基化。突變影響酶的活性催化位點(diǎn)中高度保守的精氨酸殘基，并導(dǎo)致其腫瘤抑制活性喪失。McKenney等［20］證明了JAK2V617F和IDH突變的協(xié)同作用，與單獨(dú)出現(xiàn)JAK2或IDH突變體相比，IDH1R132H和IDH2R140Q模型與JAK2V617F共同突變時(shí)表達(dá)更高的血清2-HG水平。與大多數(shù)后期分化祖細(xì)胞相比，突變的組合顯示出分化受損和未成熟祖細(xì)胞增加。用JAK2抑制治療不能顯著逆轉(zhuǎn)該表型，但通過(guò)聯(lián)合抑制JAK2和IDH2，雙重突變細(xì)胞恢復(fù)為更接近正?；募?xì)胞，需要進(jìn)一步研究以充分評(píng)估IDH突變?cè)贛PN后AML中的生物學(xué)作用。LT中IDH突變的存在使總生存期比非IDH突變的白血病要差，IDH突變的患病率較高，為12.5%～26%多項(xiàng)研究也顯示在獲得IDH突變后發(fā)生白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)更高［21，29］。

2 染色質(zhì)修飾劑

性 梳 樣 蛋 白1（additional sex combs-like 1，ASXL1）對(duì)同源基因的表達(dá)具有沉默和增強(qiáng)作用。它通過(guò)多梳阻遏物復(fù)合物2（PRC2）增強(qiáng)組蛋白標(biāo)記的甲基化，從而導(dǎo)致染色質(zhì)重塑基因（如HOXA）的抑制和沉默，影響組蛋白的翻譯、修飾，起到抑制癌癥的作用［22-23］，在PMF（18%～37%）和MPN后AML（17%～47%）中更為常見(jiàn)，并且與PV和PMF病人的預(yù)后不良相關(guān)［24］；EZH2（Enhancer of zeste homolog 2）編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，該組蛋白構(gòu)成PRC2功能的催化成分，以啟動(dòng)基因的表觀遺傳沉默［25］，二者均是多梳阻遏復(fù)合物甲基化組蛋白調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的一部分。但是，ASXL1的作用比EZH2更為廣泛，ASXL1可以通過(guò)與去泛素化酶（DUB）BRCA-1相關(guān)蛋白（BAP1）結(jié)合而參與PRC1復(fù)合物的形成，該蛋白是實(shí)體瘤中的關(guān)鍵腫瘤抑制因子［26］。此外，ASXL1還與核激素受體結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)Hox基因在發(fā)育中起著重要作用。

在一項(xiàng)針對(duì)169例PMF病人接受同種異體干細(xì)胞移植后分子遺傳學(xué)對(duì)其預(yù)后影響的研究發(fā)現(xiàn)，ASXL1和IDH2突變是降低無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［27］。監(jiān)測(cè)ASXL1突變的獲得可能與MPN病人的管理有關(guān)，因?yàn)锳SXL1突變是魯索替尼治療期間獲得的最頻繁的突變，并且與停藥時(shí)白細(xì)胞增多和低血小板的發(fā)生有關(guān)［28］。在一項(xiàng)針對(duì)135例MPN病人二代測(cè)序與突變特征的研究顯示，與具有JAK2或TET2突變的病人相比，具有ASXL1突變的PMF的病人有較高的AML轉(zhuǎn)化率，特別是具有ASXL1突變的PMF可能比具有JAK2或TET2突變的PMF（分別為P=0.08和P=0.25）具有更高的轉(zhuǎn)化為AML的風(fēng)險(xiǎn)［29］。

JAK2V617F和EZH2雙重突變小鼠的表型與PRC2靶基因表達(dá)的變化相關(guān)，特別是Lin28b/let7/Hmga2軸的表達(dá)變化有關(guān)，Hmga2的過(guò)表達(dá)在該表型中起重要作用。多項(xiàng)研究證實(shí)EZH2和JAK2V617F雙突變的存在加速M(fèi)F發(fā)展并大大降低了存活率，伴隨EZH2突變會(huì)減少紅細(xì)胞生成，但增強(qiáng)JAK2V617F陽(yáng)性小鼠中的巨核細(xì)胞表達(dá)［30-31］。

3 剪接體復(fù)合物

近幾年在不同的造血系統(tǒng)惡性腫瘤中檢測(cè)到了編碼剪接體蛋白的基因突變，在MDS中更為多見(jiàn)［32］。MPN中的剪接體基因突變基本上僅限于ET和MF。最 常 見(jiàn) 的 突 變 包 括SRSF2、SF3B1和U2AF1，與貧血和血小板減少癥相關(guān)。SRSF2編碼一種蛋白質(zhì)，1990年，F(xiàn)u和Maniatis首先使用針對(duì)哺乳動(dòng)物剪接體的單克隆抗體對(duì)其進(jìn)行了識(shí)別。該蛋白質(zhì)屬于SR家族，它包含核糖核蛋白（RNP）型RNA結(jié)合基序和含羧基末端的結(jié)構(gòu)域，與premRNA中的ESE序列結(jié)合。研究表明，在脯氨酸95（P95H）上的SRSF2突變可以優(yōu)先識(shí)別CCNG ESE基序，野生型可識(shí)別CCNG和GGNG ESE基序，這種改變將會(huì)導(dǎo)致許多錯(cuò)配事件的發(fā)生，從而影響功能，并且增加了雙鏈DNA斷裂，p53過(guò)度磷酸化和過(guò)度乙?；约凹?xì)胞周期停滯［33］。在小鼠造血細(xì)胞中也有類似的發(fā)現(xiàn)，其中SRSF2缺失的細(xì)胞具有生長(zhǎng)停滯，早期衰老和凋亡特征［34］。SRSF2突變?cè)诙嘣?%～22%的PMF和MPN后AML中發(fā)生，并與骨髓惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，包括多種類型的MPN和MPN后AML［35-36］。在另一項(xiàng)類似干預(yù)的研究中，SRSF2純合敲除小鼠顯示胸腺細(xì)胞損失70%～90%，CD4-/CD8-T細(xì)胞明顯增加，而CD4+/CD8+T細(xì)胞減少。因此，SRSF2的缺失似乎會(huì)影響胸腺中T細(xì)胞的成熟，可能是繼CD45剪接改變后繼發(fā)的［37］。

小鼠模型中SRSF2 P95H的表達(dá)導(dǎo)致髓樣偏倚，形態(tài)異常和單核細(xì)胞增多，以及造血干細(xì)胞數(shù)量減少，SRSF2的突變足以在自然造血的情況下啟動(dòng)MDS/MPN的 發(fā) 展［38］。MDS/MPN重 疊 綜 合 征（MMOS）可在初始診斷期間同時(shí)具有MDS（外周血細(xì)胞減少和/或增生異常骨髓）和克隆增殖（白細(xì)胞增多，血小板增多或肝脾腫大）的臨床和形態(tài)特征重疊［39］，SRSF2和U2AF1突變?cè)赑MF病人中的患病率分別為15%和22%，突變與預(yù)后不良有關(guān)［40］，但是在MMOS中，證據(jù)還不是很清楚。早期研究MMOS中SRSF2突變的研究報(bào)告，無(wú)論是CMML還是其他MDS/MPN重疊綜合征，SRSF2突變對(duì)總體生存率（overall survival rate，OS）均無(wú)影響［41］。SRSF2突變與JAK2和MPL驅(qū)動(dòng)程序突變結(jié)合似乎更常見(jiàn)，U2AF1突變占MPN慢性期的比例不到2%，與MPN白血病轉(zhuǎn)化中5%～9%的進(jìn)展有關(guān)［23］。

4 腫瘤抑制因子

腫瘤抑制基因TP53（Tumor protein P53）位于17號(hào)染色體上，編碼一種DNA結(jié)合蛋白，該蛋白通過(guò)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄程序?qū)NA損傷做出反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或通過(guò)凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡［42］。在大約40%～50%的MPN繼發(fā)性白血病中發(fā)現(xiàn)了針對(duì)TP53腫瘤抑制功能的各種突變和細(xì)胞遺傳學(xué)損傷。這通常包括TP53基因的錯(cuò)義突變或缺失或靶向TP53轉(zhuǎn)錄抑制劑MDM4的1q染色體的擴(kuò)增［43］。

TP53突變?cè)诼訫PN中并不常見(jiàn)，但易發(fā)生在11%～36%的MPN后AML病人中。除了較高的突變頻率，與慢性期樣本相比，來(lái)自MPN后AML病人樣本中TP53突變的變異等位基因分?jǐn)?shù)更高，表明TP53突變會(huì)導(dǎo)致MPN中的白血病轉(zhuǎn)化。與野生型病人相比，攜帶TP53突變的MPN后AML病人的總生存期較差［44-45］。使用國(guó)際血液和骨髓移植研究中心數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了177例MPN-BP病人的骨髓造血細(xì)胞移植（HCT）和二代測(cè)序結(jié)果，在多變量模型中，TP53突變病人的OS較差，復(fù)發(fā)率增加；細(xì)胞遺傳學(xué)改變和TP53突變狀態(tài)可預(yù)測(cè)MPN-BP中HCT的結(jié)果，而不是原始細(xì)胞減少。TP53突變的病人未觀察到HCT有意義的益處［46］。一項(xiàng)關(guān)于二代測(cè)序分析對(duì)MPN相關(guān)內(nèi)臟靜脈血栓（MPN patients with splanchnic vein thromboses，MPN-SVT）病人預(yù)后影響的研究，JAK2V617F等位基因負(fù)荷≥50%或存在染色質(zhì)/剪接體/TP53突變與不良的MPN-SVT血液學(xué)結(jié)果相關(guān)［47］。1q染色體的擴(kuò)增或17p的缺失靶向MDM4（TP53轉(zhuǎn)錄抑制子）轉(zhuǎn)錄水平的提高，蛋白質(zhì)MDM2和MDM4會(huì)抑制TP53轉(zhuǎn)錄功能，從而干擾了TP53通路，導(dǎo)致MPN進(jìn)展［48］。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

JAK2和程序性死亡配體1（PD-L1）基因均位于染色體9p24上，最近研究證明JAK2V617F突變小鼠的T細(xì)胞、巨核細(xì)胞和單核細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增加，STAT3（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3）和STAT5與編碼PD-L1的Cd247啟動(dòng)子結(jié)合，并明確指出STAT3是上調(diào)Cd247表達(dá)的主要機(jī)制?？筆D-1抗體治療能夠降低小鼠JAK2V617F等位基因負(fù)擔(dān)，該作用依賴于完整的供體T細(xì)胞反應(yīng)。這一實(shí)驗(yàn)初步奠定了PD-1/PD-L1作為骨髓增殖性腫瘤的潛在治療靶標(biāo)［49］。就目前而言，MPN-BP治愈或長(zhǎng)期緩解的唯一希望仍然是ASCT，并且及早確定患有白血病轉(zhuǎn)化高風(fēng)險(xiǎn)的MPN病人，以便他們可以更早地接受ASCT治療。

激活JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)的MPN表型驅(qū)動(dòng)程序突變是MPN發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。具有表型驅(qū)動(dòng)因子的克隆生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，惡性克隆可能需要數(shù)十年的時(shí)間才能充分?jǐn)U展以引起臨床癥狀，這取決于影響生長(zhǎng)速度的其他因素，包括生活方式，炎癥和驅(qū)動(dòng)程序突變的類型等。MPN-BP的預(yù)后不佳，甚至比原發(fā)性AML更差。單獨(dú)的藥物治療雖然能夠在少數(shù)病人中達(dá)到CR，但在長(zhǎng)期緩解方面無(wú)效。

MPN病人常有復(fù)雜的分子特征，臨床異質(zhì)性主要與突變的組合以及突變基因的獲得順序有關(guān)。每個(gè)突變的確切作用及其對(duì)MPN表型的影響仍需要進(jìn)一步研究。借助高通量DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)更多的非驅(qū)動(dòng)基因突變并進(jìn)行深入的分子遺傳學(xué)研究，正越來(lái)越多地用于預(yù)測(cè)預(yù)后和評(píng)估疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。眾多臨床觀察為臨床試驗(yàn)基因靶向療法和免疫療法的應(yīng)用提供了依據(jù)，特別是為無(wú)法耐受標(biāo)準(zhǔn)化療的復(fù)發(fā)/難治性病人，未來(lái)應(yīng)致力于研究降低PMF進(jìn)展和白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)以及克服不良遺傳風(fēng)險(xiǎn)特征的藥物以改善MPN病人的生存率。