抽動障礙動物模型的研究及應用

史文麗，陳慧敏，馬丙祥

(1.河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒童腦病診療康復中心，鄭州 450000)

抽動障礙(tic disorder，TD)是一種兒童常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為突然、快速、反復、非節(jié)律性的運動或發(fā)聲[1]。近年來，本病在全球范圍發(fā)病率逐步上升[2-3]，國內最新研究顯示為1%～4%，國際報道約3%，以5～7歲發(fā)病者最多，14～16歲仍有表現(xiàn)，30%～40%可延續(xù)至成人，對學習、生活、社交均造成危害[4-5]，由此可見TD不僅僅是一個醫(yī)學問題，更逐漸成為醫(yī)學背景下急待解決的社會問題。但目前TD發(fā)病因素及發(fā)病機制不明，故無特效治療藥物，且90%的患者可伴注意缺陷多動障礙、強迫障礙、自閉、焦慮、品行障礙、人格障礙及睡眠障礙等共患病[6-7]，更顯疾病的復雜性[8-10]，增加治療難度。動物模型是挑戰(zhàn)和驗證病理生理學假說的重要工具，并且在驗證新的治療方案中扮演重要角色，故關于TD動物模型的研究可提高對TD的認識和研究水平，成為探索神經(jīng)精神系統(tǒng)與TD發(fā)病關系的關鍵點。然而，國內醫(yī)學界對TD及其動物模型的認知非常有限，為提高通過更精確的動物模型發(fā)現(xiàn)疾病的病因及病機水平及加速新藥研發(fā)進程，現(xiàn)對近年國際上TD動物模型的最新研究熱點進行闡述及比較。

1 TD動物模型研究的最新熱點

考慮到抽動表型的高度復雜性，動物方面通常采用哺乳動物，尤其是嚙齒類動物(大鼠、小鼠、倉鼠)，同樣是基于它們具有很高的成本效益和與人類神經(jīng)生物學高度相似性[11]。構建的理想動物模型主要特征：表面有效性(模型行為表現(xiàn)與TD癥狀和體征的類比度)；結構有效性(TD病因、病機與模型中生物學的一致性)；預測有效性(模型對藥物的反應性與患者的相似性)[12]。

表面有效性可通過觀察抽動行為實現(xiàn)，但由于嚙齒類動物的行為方式與人類截然不同，它會以重復和適應不良的方式復制有目的的行為，同時因兩者的喉運動結構不同很難判斷是否為發(fā)聲性抽動，且無法復制先驅性沖動，故基于此評估方法的動物模型已被證實偏倚性和低可靠性[13]。

預測有效性可作為表面有效性的補充，但部分患者對任何有效的療法均無反應，而研究者迫切通過動物模型和抽動行為驗證療法的反應性，因此會降低通過動物獲取不同作用機制新型治療方法的有效性。同時該方法需要有明確的病理生理學基礎，通過美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊》第5版中根據(jù)嚴重程度而并非神經(jīng)生物學進行亞型分類可知目前對TD認識不足。故可解釋基于此評估方法動物模型局限性的原因。

結構有效性即基于可遺傳性、易感性確定相對應的內在表型，主要結合抽動表型、生物化學、神經(jīng)解剖、神經(jīng)心理和認知特征確定其關聯(lián)性，尤其在涉及跨物種參數(shù)時(如人和嚙齒類動物)更能可靠及有效地應用，故研究甚多。由上背景可見，TD動物模型的國際研究熱點涉及2個：①基于基因變異和環(huán)境因素的動物模型開發(fā)，旨在復制與病因相關的關鍵因素；②通過表面、結構和預測有效性判斷TD模型的內在表型。

2 基因模型

30多年前，TD的遺傳學基礎就得到了學術界的認可[14-16]，基于人群和雙胞胎家庭的研究表明一級親屬患病風險顯著增加[17]，8%～57%的父母有抽動病史，同卵雙胞胎的患病一致率為53%～56%，而異卵雙胞胎卻僅有8%。既往認為TD是符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因遺傳病，但二代測序檢測技術的廣泛應用很快修正了這一看法，提出TD是一種多基因病，并增加了大量的候選基因[18-20]，但需注意的是并非所有的基因變異都被用來建立有效的臨床前模型。既往公布了第一個全基因組的關聯(lián)分析，更有學者希望找到基因型與遺傳方式、遺傳異質性、不完全外顯的關聯(lián)[21]，但數(shù)據(jù)顯示在不到1%的患者中發(fā)現(xiàn)了特定的遺傳異常(包括多態(tài)性和拷貝數(shù)變異)[22-23]，并在此過程中構建了相應的基因變異小鼠，通過特定的病理生理學進行了模型驗證，故基于基因技術的TD動物模型應運而生。

2.1多巴胺轉運體1(dopamine transporter 1,DAT1)基因模型 DAT1基因是編碼突觸多巴胺含量的主要調節(jié)因子之一。DAT的主要功能是促進多巴胺重新攝取到突觸前末端，因此其表達減少和功能減退會導致紋狀體區(qū)突觸多巴胺水平的顯著提高。既往關于DAT1與TD遺傳異質性關聯(lián)性的研究表明，DAT1變異是易感性的潛在危險因素，基于行為學檢測的小鼠研究發(fā)現(xiàn)了刻板行為、過度活動和注意力改變[24]。進一步的研究提示，DAT1基因敲除小鼠表現(xiàn)出質子泵抑制劑缺陷，此缺陷可被多巴胺D2和5-羥色胺2A血清素受體的拮抗劑以及去甲腎上腺素轉運體的阻斷劑抵消，并對多巴胺D1樣受體阻斷劑敏感。動物模型的比較研究表明，與野生型小鼠相比，DAT1缺陷小鼠表現(xiàn)出較低的D1受體表達和結合率。DAT1突變體小鼠因內在表型與TD最接近，是國際上最早使用且最成熟的基因模型。

2.2單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)基因模型 MAOA是5-羥色胺和去甲腎上腺素代謝的關鍵酶，在多巴胺降解中起重要的促進作用，而MAOA基因敲除的表型特征與TD發(fā)病機制部分吻合。既往研究表明，MAOA基因變異會增加TD的遺傳易感性，人類MAOA無義突變會導致攻擊行為，其啟動子功能性變數(shù)串聯(lián)重復多態(tài)性的低活性變異體與攻擊性相關，這在早期有創(chuàng)傷史的男性中尤為突出。動物模型顯示，MAOA轉基因小鼠在環(huán)境和社會加工、自發(fā)攻擊性、挑戰(zhàn)環(huán)境時的不適應行為、重復刻板行為等方面異常[25-26]，對N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受體拮抗劑具有高反應性，這與臨床相吻合，故是繼DAT1后又一熱點模型。此外，MAOA基因敲除小鼠的體感皮質明顯受損，這將進一步為TD患者該區(qū)域的神經(jīng)解剖學研究提供依據(jù)。

2.3接觸蛋白相關蛋白樣2(contactin-associated protein-like 2，CNTNAP2)基因模型 CNTNAP2在細胞黏附途徑和皮質發(fā)育中起關鍵作用，部分家族性TD患者中已確認CNTNAP2基因的變異，并且該基因的單核苷酸多態(tài)性變異與腫瘤干細胞具有關聯(lián)性[27]。動物實驗已證實，該基因敲除小鼠表現(xiàn)出抽動樣、孤獨癥譜系障礙樣和多動癥表型，并有神經(jīng)元遷移異常、中間神經(jīng)元數(shù)量減少和神經(jīng)元網(wǎng)絡活動異常，而治療TD臨床療效確切的利培酮可減少模型動物的高度重復刻板行為。有分子生物學研究顯示，CNTNAP2基因敲除小鼠紋狀體區(qū)多巴胺釋放水平增加，γ-氨基丁酸能中間神經(jīng)元減少，抑制信號改變，而氟哌啶醇可改善此狀態(tài)[28]，故此模型可從臨床表型、神經(jīng)生化及結構進行復制。

2.4SLITRK基因模型 SLIT和NTRK-like均為SLITRK基因家族成員，該家族由6個編碼富含亮氨酸跨膜蛋白的基因組成，參與軸突靶向和神經(jīng)元分化，與皮質-紋狀體-丘腦-皮質回路動態(tài)相關，并調節(jié)神經(jīng)突觸的生長。既往研究已證實SLITRK1為家族性TD的一個責任基因，并與共患病(如強迫癥和拔毛癥)及腫瘤干細胞相關[29]。小鼠動物研究顯示，SLITRK1的過度表達誘導神經(jīng)元生長，而家族的其他成員起到抑制生長作用，SLITRK1基因敲除小鼠顯示出高去甲腎上腺素水平以及焦慮樣癥狀，并對可樂定敏感。而SLITRK5等位基因變異度為零的小鼠紋狀體細胞形態(tài)學發(fā)生改變，并表現(xiàn)出過度的自體生長和高度的焦慮樣反應，這與眶額皮質的過度激活相關，且對由谷氨酸受體亞單位組成的氟西汀敏感。因此，國際上在研究抽動共患強迫方面常使用此模型。

2.5L-組氨酸脫羧酶(L-histidine decarboxylase，HDC)基因模型 組胺在TD病理生理學中的作用尚不清楚，但動物實驗已證明該神經(jīng)遞質在紋狀體區(qū)多巴胺能傳遞中發(fā)揮重要調節(jié)作用。HDC通過促進組氨酸轉化為組胺，在組胺能信號轉導中發(fā)揮作用。研究者在家族性TD中發(fā)現(xiàn)了人類發(fā)展中心基因的變異[30]，從而促成HDC基因敲除小鼠模型的制備。該模型動物被驗證可表現(xiàn)出紋狀體區(qū)多巴胺水平的升高以及高度的自發(fā)刻板行為[31]，而這些現(xiàn)象能被多巴胺D2受體阻斷，并能被腦內組胺輸注減弱。此外，在該模型中發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白膽固醇缺乏可導致小鼠質子泵抑制劑缺乏和大腦D2/D3受體結合上調[32]。HDC基因模型的造模目的和應用范圍與TD基本重合，是近年國際上在基因模型領域新的研究熱點。

2.6神經(jīng)連接蛋白(neuroligin，NLGN)基因模型 NLGN是突觸后細胞黏附分子，參與突觸可塑性調節(jié)，在TD多巴胺能神經(jīng)傳遞的調控中具有潛在意義。NLGN4基因突變體可編碼神經(jīng)球蛋白-4(一種突觸細胞黏附蛋白)，一個罕見家族性NLGN4缺失的研究提示該基因與TD和孤獨癥譜系障礙有關，編碼蛋白被證實與抽動樣行為及早期發(fā)育階段的社會互動缺陷相關[33]。NLGN基因敲除小鼠模型可表現(xiàn)出獲得性重復行為，其基礎是對表達D1受體的神經(jīng)元突觸選擇性損害抑制，但腹側紋狀體和伏隔核中的D2受體沒有損害[34]。一項基于神經(jīng)網(wǎng)絡的研究已證實，該模型體感皮質網(wǎng)絡興奮性降低[35]，但是否與體感皮質變薄有關仍須進一步研究。

2.7SAP90相關蛋白3(SAP90 associated protein 3，SAPAP3)基因模型 SAPAP3基因編碼突觸后致密區(qū)蛋白復合物的關鍵支架成分，最近的研究強調該基因是TD和強迫癥的一個候選基因。SAPAP3基因敲除小鼠模型顯示出過度修飾，以及許多功能和神經(jīng)結構異常，通過慢病毒載體或外側眶上紋狀體回路的光遺傳刺激恢復該蛋白可改善模型動物的抽動表型[36]。SAPAP3基因模型和SLITRK一樣，是國際上在研究抽動共患病方面常選用的模型。

2.8D1CT-7基因模型 基于鼠遺傳突變株特征的鑒定已顯示該模型與TD相似，其中基于霍亂毒素胞內酶亞單位A1與人多巴胺D1受體啟動子連接產(chǎn)生的D1CT-7轉基因小鼠目前被認為是具有最高表面和預測有效性的TD模型之一[37]，因為其抽動樣表現(xiàn)對藥物治療有反應。另一個是Hoxb8轉基因小鼠，表現(xiàn)出皮質-紋狀體-丘腦-皮質和腦干環(huán)投射神經(jīng)元的顯著異常，而這些特征可能與TD及相關疾病(如拔毛癥)有關[38-39]。盡管這些模型的行為模式與TD相似，但是結構有效性受到質疑，因為目前缺乏這些變異病理生理學的進一步驗證。如D1CT-7轉基因小鼠，該突變體可于第3周出現(xiàn)具有性別二型性的抽動樣表現(xiàn)(男性嚴重且復雜)、過度活動、跳躍、強迫或其他精神運動異常，以及D1神經(jīng)元亞群的活性長期增強，且對抗精神病藥物敏感。但與表面和預測有效性相反的是其人工性質和解剖定位不確定性，故如何通過質子泵抑制劑和基底神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)生物學改變來評估TD主要內在表型中的結構有效性，仍有待于未來進一步探索。

3 基于環(huán)境因素暴露的動物模型

基于環(huán)境因素暴露TD動物模型的開發(fā)依賴于兩種互補策略，旨在最大限度地提高結構和病因學有效性，主要體現(xiàn)：環(huán)境因素的復制和接觸與TD的高風險相關(如產(chǎn)前或產(chǎn)后早期暴露于壓力或炎癥)[40-41]；通過與個體發(fā)育中涉及的主要神經(jīng)遞質系統(tǒng)相關的藥理學干預來模擬TD病理生理學的特定方面。

3.1基于早期應激和產(chǎn)科因素模型 既往流行病學研究表明，早期暴露于一些關鍵環(huán)境因素可能在TD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，特別是產(chǎn)前和圍生期有不良事件和(或)應激史的患者，發(fā)病風險明顯增加[42]。產(chǎn)科因素、母親吸煙與多種精神疾病有關，目前通過孕期糖尿病、子癇前期、低體重、妊娠出血、孕母營養(yǎng)不良、母體感染、產(chǎn)前壓力等方式已經(jīng)制備了多種多巴胺功能異常的動物模型[43]，試圖復制導致其后遺癥的病理生理學機制，并通過動物實驗再次驗證。因為多巴胺能信號的改變，大多數(shù)模型可出現(xiàn)顯著的抽動現(xiàn)象學癥狀、刻板行為、質子泵抑制劑缺乏，但大部分還沒有從TD的角度進行專科驗證，故其有效性有待于進一步確定。

3.2基于早期神經(jīng)炎癥的模型 神經(jīng)炎癥[特別是產(chǎn)前和(或)產(chǎn)后早期的感染]是文獻記載的最早關于環(huán)境因素的動物模型，其中最經(jīng)典的是A組β溶血性鏈球菌(group A beta-hemolytic Streptococcus，GABHS)與TD和其他神經(jīng)精神疾病之間的關系，GABHS抗體的發(fā)現(xiàn)更進一步驗證了關聯(lián)性。將TD患者血清注射到紋狀體后會出現(xiàn)多巴胺水平和多巴胺轉運體表達改變，可導致運動性及發(fā)聲性抽動緩解。故基于TD患者血清和基底神經(jīng)節(jié)中細胞因子含量變化，研究者已開發(fā)幾種動物模型，目的是再現(xiàn)早期暴露于關鍵候選細胞因子如白細胞介素(interleukin，IL)-2和IL-6的相關表型[44]，如妊娠中期使用IL-2干預懷孕雌性小鼠會導致行為改變，IL-6干預會導致質子泵抑制劑減少，而兩者可溶性受體的特定亞單位干預會導致刻板動作的多維度改變。給予患者血清和(或)GABHS抗原后的模型動物與TD神經(jīng)生物學表型譜具有高度異質性[45]，這種可變性可能反映了抗體含量差異，且該模型驗證的再現(xiàn)性差、預測有效性不確定，故之后的研究提示將GABHS暴露作為獨立病因仍須探究。鉀/鈉超極化激活的環(huán)核苷酸通道4屬于調節(jié)蒼白球γ-氨基丁酸釋放的通道家族，其編碼基因的多態(tài)性變異與強迫癥和情緒障礙有關，但一項基于嚙齒動物的基礎研究顯示，使用環(huán)核苷酸通道4干預可使刻板動作和抽動樣反應增加[46]，故環(huán)核苷酸通道4和TD之間的直接聯(lián)系有待于進一步研究。

4 不同類型動物模型應用

目前越來越多的流行病學研究及環(huán)境因素暴露的隊研究顯示諸多因素參與TD的發(fā)生及發(fā)展，明確這些因素不僅可指導早期預防，并且對深一層次研究本病的病理生理及臨床治療有益。國內對TD的研究多局限于藥理學模型[47]，但高度還原TD臨床表型及發(fā)病機制的動物模型是研究本病的第一步。目前國內外仍主要使用3種有效性對動物模型進行評估[48-49]，基于表面有效性評估因人類與嚙齒類動物跨物種區(qū)別不能完全呈現(xiàn)抽動表型(尤其發(fā)聲性抽動)，基于預測有效性評估因部分動物對臨床療效確切藥物仍然無效，故限制兩者在實驗研究中的應用。隨著目前基因檢測尤其是全基因組的廣泛應用，大量疾病的臨床表型與基因型的關聯(lián)性(即內在表型)逐漸確立，故基于基因變異和環(huán)境因素暴露的動物模型因更能體現(xiàn)模型的結構有效性，有助于發(fā)現(xiàn)病理生理學變化以及內在表型，故成為動物模型首推的制備方法。并且除了特定單基因的靶向研究外，目前尚沒有任何一種模型符合預測有效性。目前，環(huán)境因素暴露展現(xiàn)出較為典型的腦內神經(jīng)遞質變化，符合目前研究結果(即理論假設的腦結構及功能損傷改變)，對于研究孕期、圍生期及GABHS暴露等相關病因、病機研究較為符合。其中孕期和圍生期環(huán)境因素暴露模型的子鼠能確切體現(xiàn)多巴胺功能異常的病理生理學基礎，更適合發(fā)病因素研究；GABHS暴露的神經(jīng)炎癥模型不僅能體現(xiàn)表面有效性，其腦功能及結構的異常亦符合當前的理論假設，但因對抗體含量要求高和模型復制性差，限制了其廣泛應用?；蜃儺愺w對應的是不同的腦功能及腦結構異常，故基于遺傳的基因模型更能明確其造模目的及藥物作用靶點，能夠較好地實現(xiàn)模型的3種有效性評估。

5 小 結

TD腦功能及結構異常、基因變異都是近年來研究者正在探索的熱點領域，有利于挖掘TD發(fā)病因素及機制、驗證治療方法有效性。雖然當前尚沒有完全符合3個基本有效性的理想模型，但基因模型是目前國際上TD動物模型首選及研究熱點，建議結合研究目的選擇合適的動物模型進行制備，除病因學外的動物實驗可優(yōu)先選擇基因模型，以便更好地推進TD的深入研究。而如何與病理生理學及藥物作用靶點結合，更精確地進行模型制備是要進一步解決的問題。