月泰貼臍片影響宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠生育功能實(shí)驗(yàn)研究

詹燕珊 劉銳萍 羅 璽 覃楚悅 時 軍,2*

1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省局部精準(zhǔn)遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

隨著社會壓力增大，生育年齡推遲，職業(yè)緊張度增加，女性的生育能力面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，不孕不育發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢。根據(jù)中國第二次不孕不育患病率大規(guī)模調(diào)查，不孕不育的發(fā)生率為18%[1]。中醫(yī)認(rèn)為，宮寒血瘀腎虛型不孕癥是由于腎陽不足、溫補(bǔ)不足、氣血瘀滯而導(dǎo)致的腎陽虛狀態(tài)，導(dǎo)致臟腑生理功能受到抑制，子宮內(nèi)生態(tài)環(huán)境低下[2]。如婦科名醫(yī)羅元愷教授認(rèn)為排卵障礙所致不孕者多屬腎陽虛衰，病機(jī)關(guān)鍵為腎之陰陽消長轉(zhuǎn)化異常[3]。在各臟腑中，腎與女子不孕癥關(guān)系最為密切。若先天稟賦不足，房勞多產(chǎn)或過于勞累等，使腎虛血虧；而腎又為五臟陰陽之本，腎氣虛推動無力，致宮寒血瘀，均可影響沖任，使腎虛不能攝精成孕[4]。

月泰貼臍片是選用延胡索、肉桂、細(xì)辛、當(dāng)歸、小茴香等中藥組方而成，為深褐色藥片，具芳香氣味，外用于患者臍部(神闕穴)，每日1次，1次1貼；具有理氣、止痛、活血化瘀和溫經(jīng)散寒的功效作用[5]，臨床用于治療宮寒血瘀引起的痛經(jīng)、不孕等。為進(jìn)一步揭示該方的作用機(jī)制，我們觀察了該方對腎虛不孕癥大鼠中血清促排卵(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)水平的影響，以期為其防治宮寒血瘀型腎虛不孕證提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠(SPF級，90只，雌性60只，雄性30只，體重220～250 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心提供，合格證號：SCXK(粵)2016-0041。

1.2 試劑 羥基脲(批號：A13GS144627，上海源葉生物科技有限公司)，血清促排卵素試劑盒(批號：E-EL-R0391c)、黃體生成素試劑盒(批號E-EL-R0026c)、雌二醇試劑盒(批號：E-EL-0152c)均購自Elabscience。無水乙醇(批號：100092683)、二甲苯(批號：10023418)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，HE染液套裝(批號：G1003，Servicebio)，中性樹膠(批號：10004160，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；月泰貼臍片(批號：210301，煙臺榮昌制藥股份有限公司)

1.3 儀器 K3 TOUCH酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)；TGL-16R離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)；LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；Donatello脫水機(jī)(DIAPATH)；JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；JB-L5凍臺(武漢俊杰電子有限公司)；KD-P組織攤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；Giotto染色機(jī)(DIAPATH)；GFL-230烤箱(天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司)；Nikon Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)。

2 方法

2.1 模型制備、干預(yù)方法及取材 腎虛不孕模型制備參照文獻(xiàn)方法[6,10]，模型組及藥物高、中、低劑量組大鼠每日早晨均給羥基脲(450 mg/kg)灌胃，持續(xù)15 d。腎虛模型建立標(biāo)準(zhǔn)：拱背，活動少，反應(yīng)慢，體毛稀疏不亮，脫毛明顯，肌肉松弛無力，食量減少。

在給大鼠灌胃的同時，對各組給予相應(yīng)處理：隨機(jī)將60只大鼠分為模型組(12只)，月泰貼臍片高、中、低劑量治療組(各12只)，正常組(12只)。按照月泰貼臍片藥品說明書0.55 g/(d·人)為標(biāo)準(zhǔn)，按照體表面積劑量換算法計算大鼠給藥劑量。

選取大鼠臍部，標(biāo)記(定位：神闕穴)，參考實(shí)驗(yàn)用大鼠經(jīng)穴定位：臍部神闕穴位于腹部、胸劍聯(lián)合與恥骨聯(lián)合連線上8/13與下5/13位置處(胸劍聯(lián)合下44 mm)[7]。將大鼠臍部局部剪去鼠毛，臍部給藥后，使用醫(yī)用創(chuàng)口貼外敷固定藥物。高劑量組給予0.99 mg/(kg·日)；中劑量組給予0.495 mg/(kg·日)；低劑量組給予0.2475 mg/(kg·日)；正常組給予蒸餾水灌胃；模型組不進(jìn)行額外干預(yù)。期間各組動物均正常飲食，自由飲水。第11天，各組雌鼠與雄鼠按比例2∶1[8]同籠4 d制備妊娠模型，第15天取出合籠的雄鼠，繼續(xù)飼養(yǎng)7 d后，無菌條件下處死取血清，測定血清促排卵素(FSH)、黃體生成素(LH)、雌二醇(E2);取得子宮，用10%多聚甲醛固定，后續(xù)選用HE染色法觀察子宮組織的形態(tài)學(xué)改變。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.2.1 觀察指標(biāo) 觀察大鼠活動形態(tài)、毛發(fā)光澤、活動頻率、納食情況、大小便等。

2.2.2 大鼠受孕率 受孕率=受孕大鼠數(shù)/大鼠總數(shù)×100%[公式(1-1)]。

2.2.3 使用ELISA法檢測各組雌鼠性激素含量 包括血清促排卵素、黃體生成素、雌二醇的含量。給藥23 d后，所有組別的大鼠，均腹腔靜脈取血，操作過程中使用不含內(nèi)毒素的無菌試管，收集大鼠血清樣品，依據(jù)說明書進(jìn)行檢測，并求出待測大鼠血清中相應(yīng)激素的濃度。

2.2.4 常規(guī)子宮組織樣本病理學(xué)研究 處死大鼠，收集子宮，固定于10%多聚甲醛，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察子宮組織的病理變化。

3 結(jié)果

3.1 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠一般情況的影響 正常組大鼠毛發(fā)油亮順滑，活動靈敏，進(jìn)食飲水及二便均正常。采用羥基脲灌胃15 d制備腎虛不孕模型后，模型組大鼠出現(xiàn)背部拱起，持續(xù)性萎靡不振，蜷縮少動，反應(yīng)遲緩，體毛黯淡無光澤，進(jìn)食量減少等腎虛癥狀。高劑量組可以減輕上述腎虛癥狀。

3.2 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠妊娠率的影響 正常組雌鼠在自由同籠法[8]同籠4d后受孕率可達(dá)100%。模型組受孕率為零，月泰貼臍片高中低給藥組相比模型組可不同程度提高受孕率。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠受孕率比較

3.3 月泰貼臍片對各組大鼠血清FSH的影響 對大鼠血清中FSH含量進(jìn)行測定，由圖1可知，模型組FSH含量降低，和正常組比較有一定差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對FSH表達(dá)有提高作用(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組；與模型組比較，*P<0.05

3.4 月泰貼臍片對各組大鼠血清LH的影響 對大鼠血清中LH含量進(jìn)行測定，由圖2可知，模型組LH含量降低，和正常組比較有差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對FSH表達(dá)有提高作用(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組;與模型組比較，*P<0.05

3.5 月泰貼臍片對各組大鼠血清E2的影響 測定大鼠血清中E2含量，由圖3可知，模型組E2含量降低，和正常組比較有差異性(P<0.05)，證明模型組造模成功；與模型組比較，月泰貼臍片高劑量組對E2表達(dá)有提高作用(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

L：低劑量組；M：中劑量組；H：高劑量組；X：模型組；K：正常組；與模型組比較，*P<0.05

3.6 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠子宮形態(tài)的影響 肉眼觀察，可以觀察到正常組大鼠子宮較厚，顏色鮮紅，血管豐富；模型組子宮小，內(nèi)壁薄，色澤蒼白發(fā)黃；與模型組比較，月泰貼臍片給藥組子宮形態(tài)均有不同程度的改善，且高劑量組可達(dá)到正常組相近水平，子宮血液循環(huán)較為順暢，血流量較多。

光學(xué)顯微鏡下可見，正常組子宮內(nèi)膜細(xì)胞排列緊密，固有層子宮腺豐富，卵泡發(fā)育良好，卵泡數(shù)目多，膠原豐富，結(jié)構(gòu)緊密，間質(zhì)細(xì)胞呈類圓形，肌層肌纖維排列緊密。與正常組比較，模型組子宮內(nèi)膜上皮呈現(xiàn)不規(guī)則凹陷，且子宮肌層較薄，常見一些閉鎖卵泡和原始卵泡，幾乎不見成熟卵泡。高劑量組局部內(nèi)膜上皮細(xì)胞增生，上皮增厚，子宮腺數(shù)量增多，卵泡發(fā)育較好，膠原增多，結(jié)構(gòu)較為緊密，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，局部密度增大。中劑量組子宮內(nèi)膜上皮較為均勻，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均勻增多，密度略增大，卵泡數(shù)量相比正常組較少，原始卵泡較多。低劑量組相比正常組卵泡數(shù)量較少，子宮病理形態(tài)改善情況不明顯。如圖4。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎者主水，受五臟六腑之精而藏之。即腎藏精，主生殖，為生命之源，元?dú)庵?，而精作為?gòu)成人體的物質(zhì)基礎(chǔ)，腎氣充，才能使生殖之精成熟，陰陽之精相合，從而孕育胎兒[9]。根據(jù)當(dāng)代中醫(yī)研究報道，在正常排卵和孕育中，腎精的作用機(jī)制，可類比于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸”中下丘腦的作用[10]，其功能紊亂會導(dǎo)致性腺軸激素分泌不足，是造成不孕的常見誘因[11]。因此通過調(diào)節(jié)機(jī)體性激素，可以促進(jìn)輸卵管卵泡發(fā)育，促進(jìn)胚胎著床，提高受孕率。

圖4 月泰貼臍片對腎虛不孕模型大鼠子宮形態(tài)的影響圖(HE，×200)

月泰貼臍片由醋延胡索、肉桂、細(xì)辛、當(dāng)歸、小茴香等藥物組成。方中君藥醋延胡索具活血行氣止痛之功[12]；臣藥肉桂和細(xì)辛可補(bǔ)火助陽、散寒止痛、活血調(diào)經(jīng)，共達(dá)強(qiáng)腎培陽的功效，使胞宮得以濡養(yǎng)溫煦[13-14]；當(dāng)歸、小茴香補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、活血行氣以補(bǔ)腎活血化瘀[15-16]。諸藥合用，既能補(bǔ)腎暖宮，止痛化瘀，又各司其職，并行不悖，使寒凝血瘀的子宮和虛寒的腎臟得以恢復(fù)其精氣。

研究中采用羥基脲灌胃制備宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠模型，模型大鼠出現(xiàn)持續(xù)性萎靡不振，背毛不整，毛色不光亮不光潔，食少納呆，飲水增多，大便增多，糞質(zhì)變稀軟，反應(yīng)遲緩，扎堆趴窩等現(xiàn)象，符合宮寒血瘀癥狀，且模型組受孕率為零，提示宮寒血瘀型腎虛不孕大鼠模型制備成功。在大鼠臍部黏貼月泰貼臍片，可改善上述癥狀，并提高大鼠受孕率?；诓±韺W(xué)結(jié)果，提示月泰貼臍片治療宮寒血瘀型大鼠的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)與改善子宮的病理形態(tài)密切相關(guān)，包括促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生，增加子宮內(nèi)卵泡數(shù)量，促進(jìn)卵泡成熟等子宮形態(tài)改變，從而改善胚胎著床環(huán)境。研究表明，對于宮寒血瘀模型大鼠，月泰貼臍片可改善其子宮內(nèi)膜形態(tài)，這和性腺軸激素(FSH、LH、E2)等變化有著緊密聯(lián)系。月泰貼臍片高劑量組和模型組相比，可提高大鼠中FSH、LH、E2的含量，提示月泰貼臍片通過提高性激素含量以促進(jìn)胚胎著床，提高受孕率。