富含半胱氨酸蛋白61對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及細胞周期的影響及其機制研究*

李大眾，黃敏敏，劉慧玲

（連云港市第二人民醫(yī)院 婦科，江蘇 連云港 222006）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma, EC）是女性生殖道高發(fā)惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的7%左右，且發(fā)病率呈上升趨勢[1]。目前EC 以手術(shù)治療為主，輔助內(nèi)分泌治療、放化療，遠期預(yù)后較好，但仍是導致女性死亡的主要疾病之一，亟待更為有效的干預(yù)方式。近年來，國內(nèi)外學者對EC發(fā)病機制進行了深入研究，旨在尋找其特異基因，為EC 的基因治療提供靶點[2-3]。富含半胱氨酸蛋白61（cysteine-rich 61, CYR61）是 CNN 家族重要成員，促有絲分裂活性、趨化性作用顯著，在腫瘤中表現(xiàn)為多樣化的生物學功能。CHEN 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，CYR61 在黑色素瘤中異常高表達，且上調(diào)CYR61將進一步促進腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，目前關(guān)于CYR61在EC 中的表達水平及作用尚不明確。本研究通過體外實驗，觀察CYR61 對EC 細胞株HEC-1B 增殖及細胞周期的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞由上海博湖生物科技有限公司提供并進行質(zhì)量控制，EC 細胞株HEC-1B 購自上海酶研生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 CYR61 過表達質(zhì)粒pcDNA3.1 CYR61 及陰性對照質(zhì)粒pcDNA3.1-NC（上海海吉浩格生物科技有限公司），β-catenin 通路激活劑LiCl（上海莼試生物技術(shù)有限公司），MTT Assay 試劑盒（美國Abcam 公司），兔抗人CYR61、β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 一抗（美國R&D 公司）。

1.1.3 主要儀器 DYCZ-24 電泳儀（北京六一生物科技有限公司），GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司），Stat Fax-4200 酶標儀（美國Awareness 公司），EPICS XL 流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞株培養(yǎng)于F12/DMEM 培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，鏈霉素0.1 g/L，青霉素105IU/L，置于標準環(huán)境（5% CO2、37℃、飽和濕度）中培養(yǎng)[5]。細胞貼壁約80%時，經(jīng)0.25%胰蛋白酶（含0.01% EDTA）消化、傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組及干預(yù) 取對數(shù)生長期HEC-1B 細胞，按1×105個/mL 的密度接種至6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜。將細胞隨機分為Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61 組、pcDNA3.1 CYR61+LiCl組。 Control 組不處理， pcDNA3.1-NC 組依據(jù)LipofectamineTM3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)染陰性對照 質(zhì) 粒 pcDNA3.1-NC，pcDNA3.1 CYR61 組 轉(zhuǎn) 染CYR61 過 表 達 質(zhì) 粒 pcDNA3.1 CYR61，pcDNA3.1 CYR61+LiCl 組轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 CYR61，并加入 LiCl 使其終濃度為60 mmol/L[7-8]。每組設(shè)置5 個復孔。培養(yǎng)48 h 用于后續(xù)實驗。

1.2.3 Western blotting 檢 測 CYR61、β -catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白的表達 取對數(shù)生長期人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞株，加入預(yù)冷RIPA 細胞裂解液，轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心15 min，BCA 法測定蛋白含量。取50 μg 待測蛋白，與上樣緩沖液充分混合，金屬浴煮沸5 min，離心取上清液，上樣電泳后濕轉(zhuǎn)至膜，封閉液室溫搖床封閉2 h，TBST 清洗，加入兔抗人CYR61 一抗（1∶800），4℃搖床孵育過夜，TBST 清洗，加入山羊抗兔 I gG 二抗（1∶2 000），室溫孵育 2 h，TBST 清洗[6]。加入ECL 發(fā)光液顯色，暗室曝光，經(jīng)全自動凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的蛋白/內(nèi)參GAPDH 灰度值表示蛋白相對表達量。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖抑制率 取各組細胞，PBS 充分洗滌后用0.25%胰蛋白酶消化，重懸后調(diào)整密度至1×105/mL，接種至96 孔板，24 h、48 h、72 h后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），2 h 后棄上清液，每孔加入150 μL DMSO 溶液，振蕩10 min 至甲瓚結(jié)晶完全溶解，采用酶標儀檢測各組490 nm波長處吸光度（Absorbance, A）值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=（1-干預(yù)組A 值/Control組 A 值）×100%[9]。

1.2.5 PI 染色法檢測細胞周期占比 取各組細胞，細胞生長至鋪滿底部＞80%時用0.25%胰蛋白酶消化，輕吹細胞，移至15 mL離心管，4℃、3 500 r/min離心5 min；PBS 沖洗，繼續(xù)離心 5 min；PBS 100 μL 重懸，加入70%預(yù)冷乙醇1 mL，混合均勻；4℃固定12 h，離心后 P BS 沖洗；加入染液（PI 染液 2 5 μL，RNaseA 10 μL，染色緩沖液 0 .5 mL），避光冰浴30 min；采用300 目細胞濾網(wǎng)過濾，在60 min 之內(nèi)采用流式細胞儀檢測細胞周期。所有操作重復3 次，取平均值[10]。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞CYR61蛋白相對表達量比較

人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞、HEC-1B 細胞CYR61 蛋白相對表達量分別為（1.25±0.27）和（0.41±0.06），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.971，P=0.000），與人正常子宮內(nèi)膜腺上皮細胞比較，HEC-1B細胞CYR61蛋白相對表達量降低。見圖1。

圖1 兩種細胞CYR61蛋白的表達

2.2 各組細胞CYR61蛋白相對表達量比較

轉(zhuǎn) 染 48 h 后 ，Control 組 、pcDNA3.1-NC 組 、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61+LiCl組CYR61蛋白相對表達量分別為（0.40±0.06）、（0.39±0.05）、（1.01±0.14）、（0.57±0.07），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=55.093，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：與 Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組CYR61 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與pcDNA3.1 CYR61 組比較，pcDNA3.1 CYR61+ LiCl 組CYR61 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；Control 組與pcDNA3.1-NC 組CYR61 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞CYR61蛋白的表達

2.3 各組細胞增殖抑制率比較

pcDNA3.1-NC組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61+ LiCl 組 24 h、48 h、72 h 增殖抑制率比較，采用重復測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點增殖抑制率有差異（F=25.416，P=0.000）；②3 組增殖抑制率有差異（F=46.962，P=0.000），pcDNA3.1 CYR61 組增殖抑制率較高，增殖抑制效果好；③3 組增殖抑制率變化趨勢有差異（F=37.541，P=0.000）。見表1。

表1 各組增殖抑制率比較 （%，）

表1 各組增殖抑制率比較 （%，）

注 ：? 與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

組別pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1 CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組72 h 0.49±0.08?51.57±6.92 36.69±7.30?24 h 0.47±0.05?25.98±4.37 12.36±3.91?48 h 0.45±0.07?37.49±6.92 24.47±4.29?

2.4 各組細胞周期占比比較

Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 G0/G1、S、G2/M 期占比比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與Control 組、pcDNA3.1-NC 組 比 較 ， pcDNA3.1 CYR61 組 G0/G1期占比升高（P＜0.05），S、G2/M 期占比降低 （P＜0.05）； 與 pcDNA3.1 CYR61 組 比 較 ， pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 G0/G1期占比降低 （P＜0.05），S、G2/M 期 占 比 升 高 （P＜0.05）； Control 組 與pcDNA3.1-NC 組 G0/G1、S、G2/M 期占比比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組細胞周期占比比較 （%，）

表2 各組細胞周期占比比較 （%，）

注 ：①與Control組、pcDNA3.1-NC組比較，P ＜0.05；②與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

組別Control組pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組F 值P 值G2/M 51.74±4.71 51.18±4.62 33.63±2.74①42.38±3.02①②911.341 0.000 G0/G1 23.12±5.23 23.29±6.01 56.26±7.24①39.87±5.71①②33.777 0.000 S 25.14±3.74 25.53±3.65 10.11±2.03①17.75±3.14①②274.651 0.000

2.5 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較

Control 組、pcDNA3.1-NC 組、pcDNA3.1 CYR61組、pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組 β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與pcDNA3.1 CYR61 組比較，pcDNA3.1 CYR61 + LiCl 組 β -catenin、 Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；Control 組與pcDNA3.1-NC 組β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3 和表 3。

圖3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白的表達

表3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較 （）

表3 各組細胞β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達量比較 （）

注 ：①與 Control 組、pcDNA3.1-NC 組比較，P ＜0.05；②與pcDNA3.1 CYR61組比較，P ＜0.05。

Cyclin D1 0.96±0.08 0.97±0.09 0.21±0.03①0.32±0.04①②790.105 0.000組別Control組pcDNA3.1-NC組pcDNA3.1 CYR61組pcDNA3.1 CYR61+LiCl組F 值P 值β-catenin 0.27±0.03 0.26±0.04 0.08±0.01①0.15±0.03①②322.667 0.000 Caspase-3 0.98±0.07 0.99±0.08 0.12±0.02①0.51±0.06①②965.142 0.000

3 討論

EC 是一組起源自子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，有研究認為內(nèi)源性或外源性雌激素異常、糖尿病、肥胖及不良生活習慣均是其發(fā)生的危險因素[11]。目前關(guān)于EC 發(fā)病機制的觀點較多，大多認為與基因、信號通路活性異常引發(fā)細胞失控性增殖、微衛(wèi)星多態(tài)性增加、p53 突變等有關(guān)[12]。因EC 早期癥狀較為明顯，確診較早，多數(shù)患者可采用手術(shù)切除治療，但其創(chuàng)傷較大，且術(shù)后面臨著較高復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險。隨著基因治療技術(shù)的不斷進步，尋找有效的腫瘤標志物并針對性干預(yù)為進一步改善EC 預(yù)后提供了新的希望[13]。

CYR61是由生長因子誘導的立早基因，同時是關(guān)鍵的細胞基質(zhì)調(diào)控因子，參與組織重塑、切口愈合及炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展[14]。此外，CYR61也是腫瘤調(diào)控基因，與細胞增殖、侵襲、黏附，以及血管形成密切相關(guān)，但在不同腫瘤中的作用存在較大差異，例如在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等中發(fā)揮促癌作用，但在EC 中起到抑癌作用。有學者在研究CYR61 對EC 的診斷價值時發(fā)現(xiàn)[15]，其在子宮內(nèi)膜組織中的表達明顯偏低，且在EC 細胞增殖中發(fā)揮負調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1 CYR61 組增殖抑制率升高，G0/G1期占比升高，S、G2/M 期占比降低，提示上調(diào)CYR61 可抑制細胞增殖，并將其阻滯在G0/G1期。

Wnt/β-catenin 信號通路是引發(fā)腫瘤的重要通路之一，包含β-catenin、Caspase-3、Cyclin D1 等多個部分，其中β-catenin 是該通路的關(guān)鍵因子，在生物信號自細胞膜轉(zhuǎn)移至胞漿、細胞核的過程中發(fā)揮重要作用。當該通路被激活時，酪蛋白酶與糖原合成激酶失活，無法降解β-catenin，使其活化并大量積累于細胞質(zhì)中，從而激活下游靶基因Caspase-3、Cyclin D1，促進細胞增殖并抑制其凋亡。KASOHA 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在EC 中存在雌激素信號傳導系統(tǒng)與Wnt/β-catenin 信號通路失調(diào)，且兩種途徑中某些成分之間相互作用，從而表現(xiàn)出疾病特征，提示該通路參與EC 進程。本研究結(jié)果中 ， pcDNA3.1 CYR61 組 β -catenin、 Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達量低于Control 組、pcDNA3.1-NC 組 ， pcDNA3.1 CYR61+LiCl 組 上 述 指標高于pcDNA3.1 CYR61 組，且在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 CYR61 的基礎(chǔ)上聯(lián)用Wnt/β-catenin 信號通路的激活劑LiCl 可以減弱細胞增殖的抑制作用、細胞周期的阻滯作用，提示W(wǎng)nt/β-catenin 信號通路在EC 中被激活，上調(diào)CYR61 可能通過抑制該通路，抑制EC 細胞增殖，并阻滯其細胞周期，從而發(fā)揮抗癌作用。CYR61基因及Wnt/β-catenin 信號通路可能成為治療EC 的新靶點。