p53、p57聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型在葡萄胎診斷中的應(yīng)用*

劉蘭蘭，楊晶珍

（贛州市婦幼保健院 婦科，江西 贛州 341000）

葡萄胎是指妊娠后胎盤絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增生，絨毛間質(zhì)高度水腫，形成大小不等的水泡，這些水泡相連成串，形似葡萄而得名[1]。葡萄胎屬于良性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤，分為完全性葡萄胎和部分性葡萄胎。完全性葡萄胎是胎盤絨毛全部受累，整個(gè)宮腔充滿水泡狀，彌漫性滋養(yǎng)細(xì)胞增生，沒(méi)有胎兒及胚胎組織可見(jiàn)；部分性葡萄胎是部分胎盤絨毛變性，局部滋養(yǎng)細(xì)胞增生，可以看見(jiàn)胚胎以及胎兒組織，但往往胎兒已經(jīng)死亡[2]。早期診斷對(duì)葡萄胎患者的治療具有重要意義。組織學(xué)形態(tài)是臨床鑒別葡萄胎的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。近年來(lái)，臨床通過(guò)超聲檢查可以發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)葉細(xì)胞腫瘤病變，然而，葡萄胎病變與水腫性流產(chǎn)較為相似，可能會(huì)出現(xiàn)誤診[4]。有研究[5]報(bào)道，p53、p57 蛋白表達(dá)在葡萄胎鑒別中具有重要價(jià)值。p53基因分為野生型和突變型，野生型p53基因具有抑癌作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化，而突變型p53能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變型p53在葡萄胎中的突變率較高。p57基因位于染色體11p15.5，為父源性印記基因母源性表達(dá)，而完全性葡萄胎不含母體核DNA，部分性葡萄胎和水腫性流產(chǎn)DNA 來(lái)自于父母雙方，檢測(cè)p57基因表達(dá)可用于葡萄胎鑒別[6]。此外，短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型廣泛用于遺傳標(biāo)記，具有重復(fù)次數(shù)不同的核心序列，形成豐富的群體多態(tài)性，通過(guò)分析短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)可以快速判斷葡萄胎DNA 來(lái)源[7]。然而，p53、p57 蛋白及短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型單獨(dú)用于葡萄胎診斷的準(zhǔn)確率并不高。本研究擬探討p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型用于葡萄胎的診斷及其臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取 2017 年 3 月—2020 年 3 月贛州市婦幼保健院收治的經(jīng)病理檢查確診的46 例完全性葡萄胎患者（完全性葡萄胎組），34 例部分性葡萄胎患者（部分性葡萄胎組），以及26 例水腫性流產(chǎn)患者（水腫性流產(chǎn)組）作為研究對(duì)象。其中，完全性葡萄胎組患者年齡19～38 歲，平均（27.42±4.69）歲；初次妊娠32 例，2 次及以上14 例。部分性葡萄胎組患者年齡18～39 歲，平均（26.78±4.35）歲；初次妊娠23 例，2 次及以上11 例。水腫性流產(chǎn)組患者年齡19～37 歲，平均（26.56±4.18）歲；初次妊娠18 例，2 次及以上8 例。3 組患者的年齡、妊娠次數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

獲取所有患者的組織標(biāo)本，對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行免疫組織PV 9000 法染色，脫蠟、水化后蘇木精浸染5 min，沖洗，1%鹽酸酒精分化3 s，清水沖洗40 min，0.5%伊紅酒精浸染1 min，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，制成 4 μm 切片，鼠抗人 p 57、p53 單克隆抗體購(gòu)自武漢華美生物技術(shù)有限公司，試劑盒購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司。

p57 蛋白定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，選取切片中不同部位5 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)著色細(xì)胞數(shù)占比，著色細(xì)胞占比＞30%為陽(yáng)性，著色細(xì)胞占比≤30%為陰性。p53 蛋白定位于細(xì)胞核，呈棕黃色，著色細(xì)胞數(shù)＞10%為陽(yáng)性，著色細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性[8]。

采用短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型試劑盒（購(gòu)自福州泰普生物科技有限公司），根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行15 個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)及1 個(gè)性別識(shí)別位點(diǎn)擴(kuò)增識(shí)別分析，比較每個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)等位基因，識(shí)別絨毛組織中異常父源等位基因。若至少2 個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)全部為父源性等位基因，則為完全性葡萄胎；若每個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)均出現(xiàn)2 個(gè)父源性和1 個(gè)母源性等位基因，則為部分性葡萄胎；若具有來(lái)自雙親的平衡性雙等位基因表型，則為水腫性流產(chǎn)[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較做t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)或Kappa 一致性檢驗(yàn)，兩兩比較用 Pearson χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果

完全性葡萄胎：絨毛間質(zhì)明顯水腫，且有水池形成，滋養(yǎng)葉細(xì)胞明顯增生。部分性葡萄胎：絨毛間質(zhì)輕微水腫，可見(jiàn)有水池，滋養(yǎng)細(xì)胞包涵體形成，滋養(yǎng)葉細(xì)胞輕度或中度增生。水腫性流產(chǎn)：絨毛間質(zhì)輕微水腫，滋養(yǎng)葉細(xì)胞增生不明顯。見(jiàn)圖1。

2.2 3組患者p53陽(yáng)性率的比較

完全性葡萄胎組中，41 例p53 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為89.13%；部分性葡萄胎組中，27 例p53 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為79.41%；水腫性流產(chǎn)組中，3 例p53 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為11.53%。3 組p53 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.716，P=0.000）；完全性葡萄胎組和部分性葡萄胎組p53 陽(yáng)性率均高于水腫性流產(chǎn)組（χ2=42.081和27.149，P=0.000）。見(jiàn)表1。

2.3 3組患者p57陽(yáng)性率的比較

完全性葡萄胎組中，p57 陽(yáng)性0 例，陽(yáng)性率為0.00%；部分性葡萄胎組中，30 例p57 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為88.24%；水腫性流產(chǎn)組中，26 例p57 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100.00%。3 組p57 陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=84.035，P=0.000）；完全性葡萄胎組p57 陽(yáng)性率均低于部分性葡萄胎組和水腫性流產(chǎn)組（χ2=64.941和72.000，P=0.000）。見(jiàn)表2。

表2 3組患者p57陽(yáng)性率的比較

2.4 短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型結(jié)果

41 例完全性葡萄胎短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為89.13%（41/46）；31 例部分性葡萄胎短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為91.18%（31/34）；25 例水腫性流產(chǎn)短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為96.15%（25/26）。所有患者總符合率為91.51%（97/106），經(jīng)Kappa 一致性檢驗(yàn)，2 種診斷方法具有較好的一致性（κ=0.755，P=0.000）。見(jiàn)表3。

表3 短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型結(jié)果 例（%）

2.5 p53、p57聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型結(jié)果

44 例完全性葡萄胎p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為95.65%（44/46）；32 例部分性葡萄胎 p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為94.12%（32/34）；26 例水腫性流產(chǎn)p53、p57聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，符合率為100.00%（26/26）。所有患者總符合率為96.23%（102/106），經(jīng)Kappa 一致性檢驗(yàn)，2 種診斷方法具有較好的一致性（κ=0.804，P=0.000）。見(jiàn)表4。

3 討論

葡萄胎主要由受精卵異常引起，卵子中無(wú)核DNA，僅有胞漿DNA，與精子受精后，只有精子DNA自身復(fù)制，或者雙精子同時(shí)受精一個(gè)空卵，導(dǎo)致受精卵46 條染色體全是父源性，進(jìn)而使大量滋養(yǎng)細(xì)胞增生，且沒(méi)有胚胎結(jié)構(gòu)，從而形成葡萄胎[10]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄胎多發(fā)于高齡（＞35 歲）或低齡（＜20 歲）孕婦，此外，營(yíng)養(yǎng)不足、葉酸缺乏、病毒感染、遺傳等均是葡萄胎形成的重要因素，患者臨床主要表現(xiàn)為孕期不規(guī)則陰道流血以及下腹部疼痛，臨床主要采用清宮和藥物治療[11]。病理形態(tài)診斷是鑒別葡萄胎的主要方法，然而，部分患者缺乏典型特征，臨床鑒別時(shí)容易誤診，進(jìn)而影響臨床治療和預(yù)后[12]。因此，臨床急需尋找準(zhǔn)確鑒別葡萄胎的方法。

本研究中完全性葡萄胎p53、p57 陽(yáng)性率分別為89.13%、0.00%，部分性葡萄胎p53、p57 陽(yáng)性率分別為79.41%、88.24%，水腫性流產(chǎn)p53、p57 陽(yáng)性率分別為11.54%、100.00%，說(shuō)明p53 蛋白在完全性葡萄胎，部分性葡萄胎中陽(yáng)性表達(dá)率較高，在水腫性流產(chǎn)中陽(yáng)性表達(dá)率較低，而p57 蛋白在部分性葡萄胎、水腫性流產(chǎn)中陽(yáng)性表達(dá)率較高。短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型與病理形態(tài)診斷總符合率為91.51%，具有較好的一致性。有研究報(bào)道，完全性葡萄胎與野生型p53 上調(diào)有關(guān)，p53 上調(diào)能夠一定程度上阻止完全性葡萄胎的過(guò)度增生[13]。完全性葡萄胎p53 陰性表達(dá)者，可能與突變性p53 缺失有關(guān)[14]。然而，p53 突變位點(diǎn)及種類較多，臨床僅根據(jù)p53 表達(dá)尚不能準(zhǔn)確鑒別葡萄胎[15]。由于p57 母系表達(dá)，完全性葡萄胎染色體均來(lái)自父系，故p57 不表達(dá)，部分性葡萄胎為三倍體，其中1 個(gè)來(lái)自母系，則p57 表達(dá)，因此，檢測(cè)p57 表達(dá)用于鑒別完全性葡萄胎具有重要價(jià)值[16]。臨床檢測(cè)p57 表達(dá)鑒別部分性葡萄胎與水腫性流產(chǎn)仍然具有一定的困難[17]。本研究中p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷結(jié)果與病理診斷相符，總符合率為96.23%（102/106），與病理診斷具有較好的一致性，通過(guò)p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型診斷葡萄胎能夠進(jìn)一步提高臨床診斷準(zhǔn)確性。短串聯(lián)重復(fù)序列遍布于人類整個(gè)基因組，在非編碼區(qū)含量豐富且高度遺傳穩(wěn)定，其位點(diǎn)具有重復(fù)單元小、片段短，易于擴(kuò)增的優(yōu)點(diǎn)，可以多個(gè)位點(diǎn)同步擴(kuò)增，提高工作效率，節(jié)約鑒別診斷時(shí)間[18]。然而，短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型僅可以區(qū)分三倍體是父源性還是母源性，不能區(qū)分雙親來(lái)源，且在家族性葡萄胎檢測(cè)中誤診、漏診率較高[19]。因此，p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型用于葡萄胎診斷可以充分利用每種鑒別方法的優(yōu)點(diǎn)，盡可能地降低誤診、漏診，同時(shí)結(jié)合臨床病理形態(tài)特點(diǎn)，提高葡萄胎鑒別診斷的準(zhǔn)確性。

綜上所述，p53、p57 聯(lián)合短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型用于葡萄胎診斷具有一定價(jià)值，臨床可通過(guò)完全性和部分性葡萄胎核型和病理特征進(jìn)行區(qū)別，p53、p57 免疫組織化學(xué)法可以輔助區(qū)別。