根性神經(jīng)痛動物模型的研究進(jìn)展*

黃軍凱，陳祁青，趙繼榮，馬東，楊云云

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050）

根性神經(jīng)痛是指脊神經(jīng)根由于機(jī)械壓迫、炎癥、免疫、神經(jīng)毒性、腫瘤、血供不足、代謝性疾病等因素或其他原因受到傷害性刺激而引起神經(jīng)根或背根節(jié)的異位放電導(dǎo)致的疼痛，是椎間盤（髓核）突出、椎管狹窄和椎體退行性改變最常見的癥狀之一，也是近年來臨床研究的熱點[1-3]。動物模型的復(fù)制在根性神經(jīng)痛的研究中占重要地位，通過復(fù)制動物模型，能夠模擬根性神經(jīng)性疼痛，其中大部分是通過對脊神經(jīng)、脊神經(jīng)根和背根神經(jīng)節(jié)等進(jìn)行操作產(chǎn)生，不同點在于對脊神經(jīng)操作的強(qiáng)度、位置和方式不同，同時由于動物無法用語言表達(dá)所受到的傷害性刺激，因此觀察操作后動物各種異常行為的表現(xiàn)也是動物模型制備成功的關(guān)鍵。本文就根性神經(jīng)痛動物模型的研究進(jìn)展綜述如下。

1 根性神經(jīng)痛模型動物的選擇及異常行為觀測指標(biāo)

人類對疼痛的感知過程非常復(fù)雜，需要多個水平的神經(jīng)系統(tǒng)組件共同參與。當(dāng)前對根性神經(jīng)痛的發(fā)生機(jī)制及藥理作用等基礎(chǔ)研究依賴于動物模型，選擇一個合適的動物模型并合理利用實驗動物自身特性（解剖、器官、結(jié)構(gòu)、反應(yīng)性等），不僅能夠減少實驗誤差、降低操作難度，而且可以有效地提高研究質(zhì)量[4]。當(dāng)前用于神經(jīng)痛模型的動物包含了鼠、兔、羊、豬、猴及狒狒等。雖然靈長類的猴、狒狒等動物與人類在解剖、生理及病理特征上更為接近，制作出的模型更理想且具有實際意義，但由于動物實驗倫理和價格昂貴等的限制，且模型的重復(fù)性差、實驗周期長，難以廣泛普及應(yīng)用。因此，目前臨床最廣泛應(yīng)用的還是以鼠、兔等廉價而易操作和獲取的動物為主，如SD 大鼠、Wistar 大鼠、新西蘭白兔等[5-6]。

模型動物在受到有害刺激時可以感受到和人類疼痛相似的感覺并做出反應(yīng)，但由于動物無法用言語表達(dá)疼痛的程度且無法直接測量疼痛程度，因此對神經(jīng)損傷引起的各種神經(jīng)行為學(xué)異常的觀察及正確分析成為動物模型成功和研究根性神經(jīng)痛的關(guān)鍵。其主要觀測指標(biāo)分為刺激誘發(fā)性和非刺激誘發(fā)性兩種[7]。刺激誘發(fā)性傷害感受觀測指標(biāo)：①機(jī)械性痛覺過敏：在動物的尾巴或后爪上施加傷害性機(jī)械刺激（常用von Frey 或Semmes-Weinstein 系統(tǒng)壓迫，測試后退收縮次數(shù)），觀測動物縮腳、逃跑、嘶叫和攻擊性行為等；②熱刺激痛覺過敏：應(yīng)用輻射、紅外線等發(fā)熱源照射動物腳底或運用熱探針、熱浸泡方式作用于動物腳底產(chǎn)生傷害性刺激，觀測咬、舔或畏縮四肢等行為（回縮潛伏期）；③冷刺激痛覺過敏：和熱刺激觀測指標(biāo)相同，其方法是將動物放置在制冷金屬板上或運用冷浸泡、丙酮作用于動物腳底產(chǎn)生傷害性刺激[8-11]。非刺激誘發(fā)性傷害感受觀測指標(biāo)：①自噬或自切行為（動物咬除由于損傷造成神經(jīng)感覺缺失的身體部分）；②自發(fā)性保護(hù)性行為（躲避、蜷縮、形態(tài)異常等）；③鬼臉行為（眼眶收緊、鼻子隆起、臉頰隆起、耳朵位置和胡須位置變化等）；④步態(tài)行為：跛行、拖腿和不使用肢體等行為（常使用步態(tài)分析系統(tǒng)進(jìn)行觀測分析）；⑤其他行為（舔咬、退縮、搔抓、嘶叫等）[12-13]。

2 根性神經(jīng)痛動物模型種類及模型復(fù)制方法

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，根性神經(jīng)痛的發(fā)生機(jī)制主要有機(jī)械壓迫、神經(jīng)根炎癥反應(yīng)和神經(jīng)體液反應(yīng)3 種。創(chuàng)建一種理想化的動物模型對于研究這些機(jī)制具有重要意義，同時也為探索臨床各種治療方案和新藥物測試，以及基礎(chǔ)實驗研究提供了良好的實驗載體。以下概述常用的根性神經(jīng)痛動物模型種類及模型復(fù)制方法。

2.1 L5/L6脊神經(jīng)根結(jié)扎損傷模型

L5/L6脊神經(jīng)根結(jié)扎損傷模型（spinal nerve ligation, SNL）由 KIM 和CHUNG[14]提出，其模型復(fù)制方法是運用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下取俯臥位，在腰椎單側(cè)L5～S1左側(cè)切開約5 mm 的縱向切口，打開背腰筋膜，鈍性分離筋膜和椎旁肌肉組織，去除橫突后暴露L5、L6神經(jīng)根，在遠(yuǎn)離背根神經(jīng)節(jié)的位置用6-0 的絲線對L5/L6脊神經(jīng)緊密結(jié)扎，止血后逐層縫合皮膚。SNL 模型使大鼠長期出現(xiàn)機(jī)械系異常疼痛、痛覺過敏和持續(xù)性疼痛等，這與根性神經(jīng)痛的病理表現(xiàn)相近，同時該模型也為研究根性神經(jīng)痛的機(jī)制、病理和解剖提供了有力的實驗基礎(chǔ)[15-16]。HUANG 等[17]運用 SNL 大鼠模型研究保留椎旁肌的重要性，通過比較保留和切除椎旁肌兩種模型導(dǎo)致的神經(jīng)病變行為、肌肉損傷和炎癥的生化標(biāo)志物水平，發(fā)現(xiàn)保留椎旁肌的SNL 大鼠模型術(shù)后會產(chǎn)生較少的肌肉損傷和炎癥反應(yīng)，再次證明該模型是一種具有較高可重復(fù)性、易于獲取且侵入性小的神經(jīng)性疼痛模型。SNL 模型能夠較好地定位區(qū)分神經(jīng)根節(jié)段且易對其進(jìn)行損傷操作，有利于研究神經(jīng)根在根性神經(jīng)痛機(jī)制中的作用，但結(jié)扎的松緊度和固定位置不易控制，會產(chǎn)生一定的個體差異，存在一定局限性。

2.2 脊神經(jīng)根壓迫模型

脊神經(jīng)根壓迫模型（chronic spinal nerve root compression model, CNRC）由王擁軍等[18]提出。其模型復(fù)制方法是通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮麻醉大鼠，無菌條件下以L4、L5椎體間隙為中心取正中切口，逐層切開皮膚，鈍性分離肌肉組織后到達(dá)椎板，于L4/L5處對右側(cè)椎板、棘突和部分小關(guān)節(jié)進(jìn)行切除，在手術(shù)顯微鏡下充分暴露右側(cè)L5神經(jīng)根后使用硅膠管片放置在神經(jīng)根周圍對其進(jìn)行壓迫，局部固定后消毒縫合。研究發(fā)現(xiàn)，CNRC 模型中硅膠管對脊神經(jīng)根的慢性壓迫會對神經(jīng)根造成可修復(fù)的損傷，從而在脊髓中激活可修復(fù)的小膠質(zhì)細(xì)胞，激活的膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放疼痛通路中神經(jīng)元的可溶性因子導(dǎo)致痛覺過敏和異常性疼痛，這與腰椎管狹窄癥和腰椎間盤突出癥的臨床表現(xiàn)及病理變化一致，為研究根性神經(jīng)痛提供了較理想的模型[19]。CNRC 模型通過硅膠片對脊神經(jīng)根進(jìn)行操作，較符合脊神經(jīng)根慢性受壓的病理學(xué)解剖基礎(chǔ)且方便調(diào)控?fù)p傷的位置和程度，具有較高的可調(diào)控性，但硅膠管存在移位、脫落風(fēng)險，會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

2.3 慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)模型

慢性壓迫背根神經(jīng)節(jié)模型（chronic compression of dorsal root ganglia, CCD）由第四軍醫(yī)大學(xué)胡三覺教授團(tuán)隊[20]提出。其模型復(fù)制方法是運用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下取俯臥位，在腰椎左側(cè)L4～L6間垂直切開皮膚，逐層切開分離皮下肌肉組織后并充分暴露左側(cè)L5椎間孔，然后先用一個鈍性L 型細(xì)針傾斜30°插入L5椎間孔約4 mm，若出現(xiàn)術(shù)側(cè)下肢大腿肌肉輕微、短暫的抽搐則表明到達(dá)背根神經(jīng)節(jié)，最后拔出L 型針并將一根長4 mm、直徑0.5～0.8 mm 的不銹鋼棒沿原路徑插入L5椎間孔，出現(xiàn)上述表現(xiàn)后提示模型復(fù)制成功，最后逐層縫合皮膚并使用抗生素預(yù)防感染。有研究[21]發(fā)現(xiàn)鋼棒的內(nèi)植入會導(dǎo)致神經(jīng)元體細(xì)胞過度興奮，出現(xiàn)與痛覺過敏、自發(fā)性疼痛和機(jī)械異常性疼痛相關(guān)的自發(fā)動作電位，同時會保留外周傳遞的功能，出現(xiàn)炎癥因子的累積和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活，這與椎間盤突出和椎間孔狹窄引起根性神經(jīng)疼痛的機(jī)制相契合。CCD 模型操作簡單便捷、創(chuàng)傷小、且無須打開椎管暴露脊神經(jīng)根，大大降低了感染風(fēng)險，大鼠成活率高。但由于不同體型大鼠需定制不同大小鋼棒器械，費用較高且存在移位、脫落風(fēng)險，存在一定局限性[22]。

2.4 脊神經(jīng)根移位模型

該模型由FINSKAS 等[23]提出，又稱注射針神經(jīng)根移位模型。其模型復(fù)制方法是采用蒸發(fā)異氟烷麻醉大鼠，無菌條件下在大鼠的左側(cè)L3、L4行小關(guān)節(jié)和椎板切除術(shù)后暴露椎間盤和L4神經(jīng)根，然后通過切口針（直徑0.4 mm）切開L3/L4椎間盤，利用穿刺針穿刺椎間盤后將L4神經(jīng)根側(cè)向移位以達(dá)到損傷神經(jīng)根的效果，最后將穿刺針頭固定在椎體下的骨骼中以產(chǎn)生持久的神經(jīng)根移位。雖然在針刺過程中容易損傷其他組織器官，但該模型大鼠神經(jīng)根損傷比單純的髓核突出和背根神經(jīng)節(jié)損傷會產(chǎn)生更多的疼痛行為變化（僅限于術(shù)側(cè)后爪行為），是更貼近于臨床研究神經(jīng)根性疼痛的模型之一。有研究[24]發(fā)現(xiàn)椎間盤穿刺的深度能夠影響結(jié)構(gòu)性椎間盤退變的速度和嚴(yán)重程度，且疼痛行為與椎間盤高度降低和炎癥狀態(tài)有關(guān)，而由于背根神經(jīng)節(jié)敏感性增強(qiáng)可能導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子在疼痛水平中起更重要的作用，這有助于研究疼痛的機(jī)制和治療方法。

2.5 髓核移植壓迫/非壓迫（刺激）神經(jīng)根模型

SHAMJI 等[25]和 KIM 等[26]均利用大鼠自體髓核移植壓迫神經(jīng)。模型復(fù)制方法是腹膜內(nèi)注射戊巴比妥麻醉大鼠，在近端尾部背側(cè)做一切口（約1 cm），橫向收縮分離肌腱后暴露尾部椎間盤，然后穿刺該椎間盤并將髓核收集到刮匙后縫合；取背中線切口，在L5棘突左側(cè)切開胸腰筋膜，側(cè)向牽開椎旁肌，暴露小關(guān)節(jié)和椎板間隙，然后進(jìn)行部分單側(cè)椎板切開術(shù)和內(nèi)側(cè)小關(guān)節(jié)切除術(shù)，露出左側(cè)L5背根神經(jīng)節(jié)，將取出的自體髓核組織放置在暴露的L5背根神經(jīng)節(jié)并壓迫，逐層縫合傷口。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，有研究[27]發(fā)現(xiàn)在無機(jī)械壓迫的情況下，髓核組織也能夠誘導(dǎo)神經(jīng)根發(fā)生炎癥反應(yīng)引發(fā)疼痛。CHO 等[28]采用同樣的模型復(fù)制方法將大鼠自體髓核組織放置到L5神經(jīng)根旁但不對其壓迫，術(shù)后通過對大鼠進(jìn)行機(jī)械疼痛閾值觀測，顯示大鼠術(shù)側(cè)后爪疼痛機(jī)械退縮閾值明顯降低，在疼痛行為學(xué)方面有穩(wěn)定表現(xiàn)，證明了髓核本身也能夠引起神經(jīng)根炎癥反應(yīng)引發(fā)疼痛。此類模型利用大鼠自身組織進(jìn)行操作，產(chǎn)生的傷害小，大大降低了操作難度和費用，可以較好地模擬神經(jīng)根受壓和炎癥反應(yīng)的病理狀態(tài)，但該模型只對壓迫物大小進(jìn)行了量化，未考慮到個體對移植髓核組織的免疫吸收反應(yīng)，可能會對標(biāo)準(zhǔn)化的研究產(chǎn)生影響。

2.6 化學(xué)神經(jīng)根炎癥模型

該模型由趙彩萍等[29]提出。其模型復(fù)制方法是對大鼠腹腔注射水合氯醛進(jìn)行麻醉，無菌條件下以雙側(cè)髂前上棘連線的中點為中心取正中切口（約2 cm），順著棘突方向逐層切開皮膚、皮下組織，切開深筋膜后鈍性分離椎旁肌暴露橫突，用咬骨鉗去除橫突后暴露L4、L5神經(jīng)根，將體積分?jǐn)?shù)4%甲醛浸泡的無菌濾紙塊（約0.4 cm×0.6 cm）放置在L4/L5神經(jīng)旁邊并適當(dāng)包繞，固定后逐層縫合。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，機(jī)械壓迫是引發(fā)根性神經(jīng)痛的主要因素，但隨著分子生物學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn)，某些化學(xué)性因素的作用導(dǎo)致纖維環(huán)破裂髓核漏出，漏出的髓核內(nèi)容物的化學(xué)刺激和免疫反應(yīng)能夠引起神經(jīng)根的炎癥狀態(tài)引發(fā)神經(jīng)根性疼痛[30]。該模型在無機(jī)械壓力條件下利用一定濃度的甲醛溶液浸泡濾紙后置于大鼠神經(jīng)根旁，模擬炎癥狀態(tài)，引發(fā)神經(jīng)根損害產(chǎn)生根性神經(jīng)疼痛，是一種可行的模型復(fù)制方法。但由于不同種類和濃度的化學(xué)物質(zhì)會產(chǎn)生較大的實驗差異，因此需要結(jié)合大量的對照實驗進(jìn)行驗證。

3 展望

疼痛是一種多維度體驗，需要多種行為學(xué)結(jié)果研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制[31]。運用動物作為載體進(jìn)行實驗較臨床試驗的優(yōu)點在于，動物個體之間的差異不明顯，實驗組間產(chǎn)生的差異較小。因此用于根性神經(jīng)痛的理想模型動物也應(yīng)具有與人類解剖有著較高的相似性和可比擬性，還應(yīng)具有重復(fù)性高、可調(diào)控性高和標(biāo)準(zhǔn)化的特征。本文所概述的模型是通過手術(shù)對大鼠進(jìn)行操作，采用結(jié)扎、鋼棒、硅膠片、注射針、自體組織以及濾紙等工具對脊神經(jīng)或背根神經(jīng)節(jié)操作誘發(fā)不同程度的損傷、卡壓及炎癥反應(yīng)，這能夠較好地模擬不同情況下根性神經(jīng)疼痛的發(fā)生。但仍需對以下問題進(jìn)行改進(jìn)：在壓迫模型中，外部器械（鋼棒、硅膠片、注射針等）及移植的自體髓核組織可能會隨著動物的不斷運動而松動移位甚至掉落，從而影響實驗結(jié)果，因此應(yīng)當(dāng)探索不易脫落的固定方式；在結(jié)扎模型中，結(jié)扎的松緊度和位置不易控制，對不同位置的神經(jīng)根和松緊度操作可能會導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)纖維損傷，產(chǎn)生較大的實驗差異從而影響實驗結(jié)果，因此也應(yīng)探求一種既保證結(jié)扎位置相同，又保證結(jié)扎程度一致且不對神經(jīng)根產(chǎn)生過量傷害的手段；在化學(xué)誘導(dǎo)神經(jīng)根炎癥模型中，采用不同種類和濃度的化學(xué)物質(zhì)會在不同研究中產(chǎn)生較大的差異，對此應(yīng)當(dāng)尋求一種安全穩(wěn)定且濃度合適的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)一使用。

當(dāng)前，根性神經(jīng)痛模型動物主要以鼠或兔為主，且大多是對L5脊神經(jīng)根進(jìn)行操作，其原因是L5脊神經(jīng)是最易模擬發(fā)生損傷的部位且與人類脊神經(jīng)位置符合；而L4脊神經(jīng)根損傷容易導(dǎo)致動物自主行為的運動障礙，L6脊神經(jīng)根較人體解剖結(jié)構(gòu)位置偏低，操作起來相對困難，這都會影響疼痛行為的觀察和測量，應(yīng)用較少。此外，近年來也有一部分研究者采用離斷[32]、夾子[33]、外固定架[34]以及遺傳學(xué)工具[35]等對大鼠的脊神經(jīng)根進(jìn)行操作，以此來模擬神經(jīng)性疼痛，雖然取得了一定的成果，但是這些方式操作過程較為復(fù)雜、手術(shù)范圍較大、成功率低且不易推廣，目前使用較少。

迄今為止，國內(nèi)外眾多研究者通過動物模型從不同角度對根性神經(jīng)痛進(jìn)行模擬、復(fù)制。運用手術(shù)物理損傷和化學(xué)炎癥誘導(dǎo)等方式復(fù)制模型，為根性神經(jīng)痛的研究提供了不同的參考模型，但根性神經(jīng)痛的發(fā)生機(jī)制仍不明晰。因此，在未來的研究中，應(yīng)改良和創(chuàng)新誘發(fā)根性神經(jīng)痛的模型復(fù)制方法，增強(qiáng)動物模型臨床可操作性，以及減少動物模型與人類解剖和生理結(jié)構(gòu)的差異，開發(fā)一種可調(diào)控性高、重復(fù)性好、操作簡便、投入小，能夠真實模擬人類生理解剖結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生與人類高度統(tǒng)一的根性神經(jīng)痛癥狀和感覺變化且能引起可靠的行為學(xué)和功能性疼痛表現(xiàn)的理想模型。相信隨著根性神經(jīng)痛動物模型的不斷發(fā)展，更理想的模型終將被開發(fā)出來，未來人們終將解決疼痛相關(guān)的未知問題。