外源植物激素對膠球藻生物量和油脂富集的影響*

李玉芹，齊振華，郝麗陽，樊怡雯

(湘潭大學(xué) 化工學(xué)院 生物與食品工程系，湖南 湘潭 411105)

0 引言

產(chǎn)油微藻具有光合固碳效率高、不占農(nóng)用耕地以及富含胞外多糖和不飽和脂肪酸(如油酸、亞油酸和亞麻酸等)等優(yōu)勢，屬可持續(xù)生產(chǎn)高品質(zhì)油脂的理想原料[1-2].但目前微藻油脂工業(yè)化應(yīng)用較為困難，其主要原因是高微藻培養(yǎng)成本及低微藻油脂產(chǎn)率.近年來，國內(nèi)外研究者圍繞如何提高微藻油脂積累開展了大量研究，證實貧營養(yǎng)、低溫、高光、高鹽、重金屬離子等不利培養(yǎng)條件均可誘導(dǎo)藻細(xì)胞富集油脂[3].然而，這些非生物脅迫手段利于細(xì)胞油脂含量提高的同時也限制了其生長，影響整體油脂產(chǎn)率.探尋全面調(diào)控微藻生長代謝及油脂富集策略是解決這一瓶頸問題的關(guān)鍵.

植物激素是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長代謝的重要小分子信號物質(zhì)，研究證實其對微藻生物量積累和胞內(nèi)油脂富集具有關(guān)鍵調(diào)控作用[4].張誠鵬等[5]以水楊酸誘導(dǎo)三角褐指藻，其油脂含量較無水楊酸對照顯著提高87.48%；Contreras等[6]和李悅明等[7]研究發(fā)現(xiàn)外源脫落酸對小球藻和微擬球藻中油脂積累也具有明顯的促進作用.進一步地，Jyoti等[8]研究報道外源生長素和細(xì)胞分裂素能顯著提高柵藻中超歧物氧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性，阻止光合色素和蛋白質(zhì)氧化降解，促進細(xì)胞分裂生長和油脂積累；Guldhe等[9]使用吲哚乙酸顯著提高了小球藻中調(diào)控油脂合成積累的accD基因表達量，并且上調(diào)了核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)活性，從而使小球藻生物量和油脂含量大大提高；此外，GA3也可通過刺激酯酶活性和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)碳流分布來促進微藻生長和油脂積累[10].盡管以上外源植物激素能通過調(diào)控微藻胞內(nèi)油脂合成積累因子促進細(xì)胞代謝生長和油脂富集，但其對微藻胞內(nèi)油脂合成積累的具體調(diào)控機制尚不清晰.

膠球藻屬單細(xì)胞綠藻，在適宜條件下可積累干重58%的甘油三酯，加之全基因組測序已完成，是食源性微藻油脂開發(fā)的優(yōu)良藻株.然而，利用激素誘導(dǎo)強化膠球藻生長和油脂積累鮮有報道.本研究通過在膠球藻不同生長時期外源添加水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和脫落酸(ABA)考察其對生物量及油脂富集的影響，并解析最佳激素誘導(dǎo)膠球藻油脂代謝通路上的關(guān)鍵酶活性，為探明植物激素在調(diào)控膠球藻生長和油脂積累過程中的作用以及膠球藻油脂規(guī)模化生產(chǎn)提供參考.

1 材料與方法

1.1 膠球藻菌株及種子液制備

膠球藻CocccomyxasubellipsoideaC-169為湘潭大學(xué)生物食品系藻菌資源開發(fā)與利用實驗室保藏菌株.挑取活化單菌落藻細(xì)胞接入改進Basal培養(yǎng)基[11]，在(27±1) ℃，光照強度(3 000±200) lux，轉(zhuǎn)速為120 r/min，光暗比12 h/12 h條件下培養(yǎng)168 h獲得膠球藻種子液.

1.2 外源植物激素誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻

在無菌操作條件下，將膠球藻種子液以體積比10%的接種比例接入100 mL Basal培養(yǎng)基，并同時在培養(yǎng)初期分別加入濃度梯度為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L SA，0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA，以及0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L ABA.在(27±1) ℃，光照強度(3 000±200) lux，轉(zhuǎn)速為120 r/min，光暗比12 h/12 h下分別培養(yǎng)168 h收獲藻液.

同理，在無菌操作下，將膠球藻種子液以體積比10%接種比例接入100 mL Basal培養(yǎng)基，在(27±1) ℃，光照強度(3 000±200) lux，轉(zhuǎn)速為120 r/min，光暗比12 h/12 h下培養(yǎng)168 h至穩(wěn)定期，分別加入濃度梯度為0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L SA，0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA，0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L ABA繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)天至藻液收獲.

1.3 生物量測定

收集1.2節(jié)中培養(yǎng)的膠球藻液，在8 000 r/min離心15 min，棄上清獲得藻泥.將藻泥放入-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍10 h，再放入冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥至恒重，稱重凍干藻粉得生物量.

1.4 油脂含量測定

稱取20 mg藻粉，依次加入0.5 mL蒸餾水、1.0 mL無水甲醇和2.0 mL三氯甲烷，漩渦振蕩混勻20 min，8 000 r/min離心10 min，收集氯仿層，重復(fù)上述步驟5次后，合并所有氯仿層，置于真空干燥器內(nèi)蒸發(fā)至恒重，采用差重法計算油脂含量[12].

1.5 超微結(jié)構(gòu)表征

離心收集激素誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻液，以磷酸鹽緩沖溶液洗滌藻泥.將藻泥懸浮于DMSO溶液中，經(jīng)誘導(dǎo)、尼羅紅染色后采用激光共聚焦對熒光油脂細(xì)胞進行成像，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長560～615 nm.同步收集激素誘導(dǎo)膠球藻細(xì)胞，根據(jù)報道方法[11]將藻細(xì)胞進行固定、脫水、包埋、聚合、切片后進行透射電鏡表征.

1.6 脂肪酸成分測定

參照GB5009.168—2016方法進行脂肪酸定性定量檢測.

1.7 膠球藻油脂積累路徑關(guān)鍵調(diào)控酶活性測定

磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)、3-磷酸甘油脫氫酶(α-glycerophosphate dehydrogenase, GPD)、甘油磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase, GDPD)、蘋果酸酶(malate dehydrogenase, ME)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)和單甘油酯酰基轉(zhuǎn)移酶(monoglyceride acyltransferase, MGAT)含量采用植物ELISA檢測試劑盒(南京德恒立生物科技有限公司)進行測定.

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件對實驗樣本相關(guān)數(shù)據(jù)t檢驗考察組間差異顯著性，p<0.01 (**)為組間差異極顯著；p<0.05 (*)為組間差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同外源植物激素誘導(dǎo)對膠球藻生物量和油脂積累的影響

研究報道顯示，與高光、缺氮和低溫等非生物脅迫相比，諸多植物激素不僅能誘導(dǎo)微藻生長且能促進其胞內(nèi)油脂富集.如張誠鵬等[5]使用SA誘導(dǎo)三角褐指藻發(fā)現(xiàn)，隨著SA濃度增大其生物量呈下降趨勢，而油脂含量呈增加趨勢，在40 μg/mL SA時油脂含量較對照增加了87.48%；Du等[13]研究發(fā)現(xiàn)布朗葡萄藻油脂產(chǎn)量隨外源SA濃度增加而增加，在添加20 mg/L SA時達到最大值0.22 g/L，而0.1 mg/L ABA誘導(dǎo)時油脂含量和油脂產(chǎn)量最大為32.33%和0.20 g/L；此外，Udayan等[14]研究結(jié)果顯示20 μg/mL MeJA對海洋微擬球藻生長和油脂積累具有促進作用，其生物量和油脂含量分別是對照組的1.37倍和2.26倍，但較高濃度的MeJA則會對微藻生長和油脂積累產(chǎn)生抑制效應(yīng).然而，由以上可知，不同藻株對不同植物激素以及不同添加時期響應(yīng)有所差別，所需激素誘導(dǎo)濃度也不盡相同[4].因此，本研究考察了SA、MeJA以及ABA誘導(dǎo)對膠球藻生物量和油脂積累的影響.

注：本文圖中同一生物指標(biāo)中不同小寫字母表示不同SA處理濃度有顯著性差異,相同小寫字母表示不同SA處理濃度無顯著性差異圖1 不同生長時期添加SA對膠球藻生物量和油脂積累影響：(a)生長初期；(b)穩(wěn)定期Fig.1 The effect of adding SA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea:(a)early growth stage;(b) stable growth stage

不同濃度SA對膠球藻生物量和油脂積累影響如圖1所示.由圖1(a)可知，在生長初期添加不同濃度SA誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻，其生物量隨SA濃度增加呈先上升后下降趨勢，在15 mg/L SA時生物量達到最大值4.5 g/L，是對照組0 mg/L SA的1.09倍，當(dāng)SA濃度由15 mg/L增至20 mg/L時，膠球藻生長受到抑制，生物量由4.5 g/L降至3.9 g/L.而隨著SA誘導(dǎo)濃度增加，膠球藻油脂含量也呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，10 mg/L SA濃度顯著促進油脂積累，油脂含量達到最大值58.8%，是對照組0 mg/L SA油脂含量的1.88倍.隨著SA濃度的提高，膠球藻油脂產(chǎn)量變化趨勢與油脂含量一致，在10 mg/L SA條件下達到最大值為2.53 g/L，是對照組和其他SA濃度誘導(dǎo)條件下的1.05～1.96倍.由圖1(b)可知，在穩(wěn)定期添加不同濃度SA誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻，不同濃度的SA對穩(wěn)定期膠球藻細(xì)胞生物量均無顯著性影響，而油脂含量和油脂產(chǎn)量均隨著SA濃度增加呈先上升后下降趨勢.在SA濃度為15 mg/L時，油脂含量和油脂產(chǎn)量最大分別為53.7%和2.27 g/L，是對照油脂含量和油脂產(chǎn)量的1.72倍和1.76倍，較生長初期添加10 mg/L SA獲得的最大油脂產(chǎn)量減少了11.45%.綜上，SA的最佳添加時間和添加濃度為生長初期添加10 mg/L.

圖2 不同生長時期添加MeJA對膠球藻生物量和油脂積累影響：(a)生長初期；(b)穩(wěn)定期Fig.2 The effect of adding MeJA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea：(a)early growth stage;(b) stable growth stage

外源MeJA誘導(dǎo)培養(yǎng)基對膠球藻生物量和油脂含量影響如圖2所示.由圖2(a)可知，在生長初期添加不同濃度MeJA誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻，其生物量隨MeJA濃度增加呈先上升后降低趨勢，在10 mg/L MeJA時生物量達到最大值5.2 g/L，較對照和其他濃度MeJA誘導(dǎo)膠球藻生物量分別提高了25.6%、16.07%、1.96%和2.2%.此外，經(jīng)MeJA誘導(dǎo)的膠球藻油脂含量也隨著MeJA濃度提高呈先增加后降低趨勢，其在10 mg/L MeJA誘導(dǎo)條件下油脂含量達到最高為52.88%，較對照油脂含量提高了69.2%.而10 mg/L MeJA誘導(dǎo)條件下的膠球藻油脂產(chǎn)量也較對照提高了2.13倍.圖2(b)顯示膠球藻生長穩(wěn)定期添加MeJA也顯著促進了細(xì)胞生長，尤其在5 mg/L MeJA條件下，其生物量達到5.89 g/L，較0 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L MeJA誘導(dǎo)膠球藻生物量分別提高了1.03～1.42倍.而5 mg/L MeJA誘導(dǎo)的膠球藻油脂含量和油脂產(chǎn)量也分別達到最大值60.08%和3.54 g/L，分別是對照膠球藻細(xì)胞的1.92倍和2.74倍，與生長初期添加10 mg/L MeJA條件下的最大油脂含量和產(chǎn)量相比增加了14.97%和28.72%.而且生長穩(wěn)定期添加5 mg/L MeJA誘導(dǎo)的膠球藻細(xì)胞油脂和產(chǎn)量較生長初期添加10 mg/L SA誘導(dǎo)的膠球藻細(xì)胞油脂含量和產(chǎn)量分別提高了3.4%和39.92%.綜上，MeJA的最佳添加時間和添加濃度為生長穩(wěn)定期添加5 mg/L.

在生長初期添加不同濃度ABA誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻，發(fā)現(xiàn)ABA顯著提高了膠球藻細(xì)胞生長，其生物量隨ABA濃度增加呈先上升后趨于穩(wěn)定趨勢，在4 mg/L ABA誘導(dǎo)下膠球藻生物量達到最大值為6.77 g/L，較無ABA誘導(dǎo)對照提高了63.53%.生長初期添加ABA對膠球藻油脂含量影響也較為顯著，在4 mg/L ABA時達到最大值70.25%，在4～8 mg/L范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定.并且4 mg/L ABA誘導(dǎo)的膠球藻最大油脂含量70.25%是對照組的2.25倍.油脂產(chǎn)量也隨著ABA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后穩(wěn)定趨勢，在4 mg/L ABA誘導(dǎo)條件下油脂產(chǎn)量最大為4.76 g/L，較對照提高了72.89%(見圖3(a)).并且在膠球藻生長初期添加4 mg/L ABA誘導(dǎo)獲得的最大油脂產(chǎn)量是以上生長初期添加10 mg/L SA和生長穩(wěn)定期添加5 mg/L MeJA最高油脂產(chǎn)量的2.68和1.91倍.由圖3(b)可知，在膠球藻生長穩(wěn)定期添加不同濃度ABA對其細(xì)胞生長無顯著促進作用.而油脂含量則隨著ABA濃度的提高呈先增加后穩(wěn)定趨勢，在2 mg/L ABA誘導(dǎo)下達到最大值55.5%，在此ABA濃度下油脂產(chǎn)量為2.31 g/L，分別較對照提高了1.78倍和1.79倍，但較生長初期添加4 mg/L ABA誘導(dǎo)膠球藻最大油脂含量和產(chǎn)量分別減少了14.75%和106.06%.與SA和MeJA添加效果相比，生長初期添加4 mg/L ABA所獲得的生物量、油脂含量及油脂產(chǎn)率都是最高的.因此，在生長初期添加4 mg/L ABA不僅能顯著增強膠球藻生物量，且對其胞內(nèi)油脂積累和油脂產(chǎn)量提高也具有顯著促進作用.

圖3 不同生長時期添加ABA對膠球藻生物量和油脂積累影響：(a)生長初期；(b)穩(wěn)定期Fig.3 The effect of adding ABA at different growth stages on the biomass and lipid accumulation of C. subellipsoidea：(a)early growth stage;(b) stable growth stage

綜合以上，本研究中外源添加SA、MeJA和ABA至不同生長期膠球藻中，發(fā)現(xiàn)3種植物激素對膠球藻生物量和油脂積累影響差異顯著，與上述報道的微藻生長和積累油脂最適植物激素及使用濃度也完全不同，其中以生長初期添加4 mg/L ABA誘導(dǎo)對膠球藻生物量和油脂積累促進效應(yīng)最為顯著，這說明外源ABA更適宜于調(diào)控膠球藻細(xì)胞生物量積累和胞內(nèi)油脂富集.

2.2 植物激素誘導(dǎo)對膠球藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

由不同外源植物激素對膠球藻生物量和油脂積累影響可知，在生長初期添加ABA能顯著增強膠球藻積累胞內(nèi)油脂.為進一步確認(rèn)ABA促進膠球藻積累油脂的最佳時間點，對ABA誘導(dǎo)藻細(xì)胞進行了微觀結(jié)構(gòu)表征.由圖4可知，經(jīng)ABA誘導(dǎo)168 h的膠球藻油脂熒光強度高于ABA誘導(dǎo)24 h、72 h、120 h、120 h和216 h的藻細(xì)胞熒光強度，并顯著強于無ABA誘導(dǎo)培養(yǎng)24～216 h的膠球藻細(xì)胞熒光強度，證實ABA誘導(dǎo)168 h的膠球藻細(xì)胞油脂含量最高，這與前面研究結(jié)果一致.由ABA誘導(dǎo)膠球藻細(xì)胞透射結(jié)果可以看出，在無ABA條件下培養(yǎng)24～216 h的膠球藻細(xì)胞淀粉顆粒占整個細(xì)胞體積的一半以上.而在ABA誘導(dǎo)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，膠球藻細(xì)胞淀粉顆粒大小和數(shù)量逐漸萎縮，在ABA誘導(dǎo)168 h時，淀粉顆粒萎縮最為顯著，以電子密集點形式存在的油脂體聚合成群，占據(jù)細(xì)胞體積的一半以上，說明脂質(zhì)含量顯著提高，這與激光共聚焦脂質(zhì)熒光結(jié)果顯示了一致性，再次證實在生長初期添加ABA能顯著促進膠球藻積累胞內(nèi)油脂.

圖4 ABA不同作用時間對膠球藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響(LP:油脂滴；ST:淀粉顆粒)Fig.4 The effect of ABA on the ultrastructure of C. subellipsoidea cells at different time(LP：lipid droplet;ST:starch granule)

2.3 植物激素誘導(dǎo)對膠球藻脂肪酸組成的影響

盡管ABA誘導(dǎo)有效提高了膠球藻胞內(nèi)油脂含量，但油脂中脂肪酸類型和組成直接影響其下游生物基產(chǎn)品特性[2].在美國農(nóng)業(yè)部(USDA)發(fā)布的《美國人膳食指南》中，建議多食用不飽和脂肪酸含量相對豐富的植物油脂.常見食用大豆油中亞油酸和亞麻酸含量分別占總脂的53%和6.10%；油菜籽油中亞油酸和亞麻酸含量占比20.40%和7.90%；花生油中亞油酸和亞麻酸占總脂的28.40%和0.3%[15].可以發(fā)現(xiàn)，常見單一食用油很難同時滿足富含多種不飽和脂肪酸.

而本研究通過生長初期添加4 mg/L ABA誘導(dǎo)膠球藻油脂脂肪酸組成可知，ABA誘導(dǎo)膠球藻細(xì)胞中總脂肪酸含量為90.7%，較無ABA誘導(dǎo)對照組總脂肪酸含量(75.25%)提高了1.21倍，而ABA誘導(dǎo)和對照組細(xì)胞脂肪酸均以C16和C18為主，但其各脂肪酸比例顯著不同(見表1).另外，經(jīng)ABA誘導(dǎo)的膠球藻細(xì)胞中富含人體多種必需脂肪酸，其中亞油酸和亞麻酸含量分別為30.06%和37.18%，是對照組細(xì)胞含量的1.23和1.13倍，且油酸C18∶1比例(15.46%)也顯著高于對照組細(xì)胞油酸含量(11.24%).整體上，經(jīng)ABA誘導(dǎo)的膠球藻細(xì)胞中不飽和脂肪酸總含量高達84%以上，這略高于Yu等[16]報道的以粗甘油誘導(dǎo)培養(yǎng)膠球藻細(xì)胞中的亞油酸(28.78%)和亞麻酸(27.38%)含量，并顯著優(yōu)于Wang等[11]以葡萄糖結(jié)合乙酸鈉碳源條件下培養(yǎng)的膠球藻中亞油酸(16.50%)和亞麻酸(9.9%)含量以及Peng等[17]以CO2為補充碳源培養(yǎng)的膠球藻細(xì)胞中亞油酸(24.73%)和亞麻酸(23.85%)含量，證實ABA激素誘導(dǎo)不僅顯著提高了膠球藻細(xì)胞中總脂含量，而且能增強人體必需脂肪酸的積累，是食源性油脂原料的理想來源.

表1 外源ABA誘導(dǎo)下膠球藻細(xì)胞脂肪酸組成

2.4 植物激素誘導(dǎo)對膠球藻中油脂積累關(guān)鍵調(diào)控酶活性影響

為進一步探究外源ABA對膠球藻油脂富集的調(diào)控作用，對膠球藻細(xì)胞中油脂合成積累路徑關(guān)鍵調(diào)控酶活性進行了表征.磷酸甘油酸激酶(PGK)是光合自養(yǎng)生物糖酵解和卡爾文固碳途徑的關(guān)鍵酶，主要催化1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸并產(chǎn)生ATP分子以及光合碳代謝[18-19].研究顯示，在異養(yǎng)條件下，小球藻中參與油脂合成的基因上調(diào)，而調(diào)控光合碳代謝的關(guān)鍵酶(如PGK)幾乎完全降解，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞油脂大量積累[20].另外，Li等[21]也發(fā)現(xiàn)三角褐指藻中PGK活性降低導(dǎo)致葉綠體功能受損，促使藻細(xì)胞生長和脂質(zhì)積累.由圖5可知，4 mg/L ABA誘導(dǎo)對固碳路徑PGK產(chǎn)生顯著影響，使其活性顯著下調(diào)，較對照細(xì)胞PGK活性降低了33.46%(p<0.01).因此，可以推測PGK活性降低驅(qū)使固定的碳流向油脂合成路徑，在一定程度上促進了膠球藻胞內(nèi)油脂的富集.三磷酸甘油脫氫酶(GPD)和甘油磷酸二酯酶(GDPD)是甘油磷脂代謝路徑上的關(guān)鍵調(diào)控酶，其分別催化磷酸二羥丙酮生成3-磷酸甘油和水解甘油磷酸二酯生成3-磷酸甘油[22].Wang等[23]和Cheng等[24]分別于萊茵衣藻和柵藻中過表達GPD酶基因，使得藻細(xì)胞中油脂含量較對照細(xì)胞分別提高了67.5%和1.45倍.Cheng等[24]和Mehra等[25]研究發(fā)現(xiàn)外界脅迫條件能使擬南芥和稻谷中的GDPD家族基因表達顯著上調(diào)，從而促進油脂積累.如圖5所示，在ABA激素誘導(dǎo)下，膠球藻細(xì)胞中GPD和GDPD酶活性顯著增強，其中GPD較對照組增加了14.75%(p<0.05)，其上調(diào)表達可促使極性酯向非極性酯轉(zhuǎn)化，3-磷酸甘油大量積累，為TAG生物合成提供足量的前體物質(zhì)，這也是ABA誘導(dǎo)膠球藻細(xì)胞油脂含量提高的重要貢獻者.此外，ABA誘導(dǎo)也使得膠球藻細(xì)胞中蘋果酸酶(ME)活性較對照提高了11.07%(見圖5).ME在丙酮酸代謝路徑上能夠催化蘋果酸形成CO2和脂肪酸合成前體物質(zhì)丙酮酸，對油脂合成積累具有重要的調(diào)控作用[26].Xue等[27]研究表明，將蘋果酸酶基因?qū)胄∏蛟寮?xì)胞中過高表達，ME活性提高3倍的同時油脂含量較野生藻株提高了3.2倍.因而在外源ABA誘導(dǎo)下，ME酶活的增強使得丙酮酸大量積累，為脂肪酸合成提供前體物質(zhì).脂肪酸合酶(FAS)是脂肪酸合成關(guān)鍵限速酶之一，催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成長鏈脂肪酸[28].本文研究顯示ABA激素誘導(dǎo)膠球藻細(xì)胞FAS活性也上調(diào)表達，較對照組增加了23.88%(p<0.05)，同時藻細(xì)胞中的脂肪酸含量較對照提高了1.46倍，證實ABA誘導(dǎo)可通過調(diào)控膠球藻FAS活性來促進脂肪酸合成，這與馬淑霞等[29]對裂壺藻報道結(jié)果一致.單甘油酯?；D(zhuǎn)移酶(MGAT)是植物甘油三酯(TAG)合成途徑關(guān)鍵酶，與甘油二酯?；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)協(xié)同促進TAG合成與脂滴擴張[30- 31].Divi等[32]研究得出MGAT活性增強對于煙草葉中TAG含量的增加具有重要的調(diào)控作用，而在ABA誘導(dǎo)的膠球藻細(xì)胞中MGAT顯著上調(diào)了1.43倍，其細(xì)胞內(nèi)的油脂滴體積也較對照顯著增大，因此可推斷MGTA是調(diào)控微藻油脂合成積累的關(guān)鍵因子之一.

圖5 外源ABA誘導(dǎo)對膠球藻油脂代謝途徑關(guān)鍵酶活性的影響Fig.5 Effects of exogenous ABA induction on the activities of key enzymes in the lipid metabolism pathway of C. subellipsoideaol

3 結(jié)論

外源添加4 mg/L ABA誘導(dǎo)膠球藻脂質(zhì)合成積累結(jié)果提示：(1)膠球藻在生長初期添加ABA作用獲得最佳生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量分別為6.77 g/L、70.25%和4.76 g/L；(2)ABA作用誘導(dǎo)了膠球藻胞內(nèi)多不飽和脂肪酸(如亞油酸和亞麻酸)合成積累，較無ABA作用膠球藻細(xì)胞提高了22.8%和17.66%；(3)ABA作用顯著下調(diào)了膠球藻固碳路徑PGK酶活，同步上調(diào)甘油磷脂通路GPD和GDPD、丙酮酸路徑ME、油脂路徑FAS以及TAG合成路徑MGAT活性，消弱光合固碳，使得中心碳代謝流流向脂質(zhì)路徑，加之甘油酯路徑的強化，從而協(xié)同促進了膠球藻脂質(zhì)合成積累.然而，仍需考慮以多組學(xué)手段揭示ABA誘導(dǎo)藻細(xì)胞富集油脂機制，也需評估采用ABA誘導(dǎo)生產(chǎn)功能脂質(zhì)的經(jīng)濟安全性，以期為進一步拓展食源性膠球藻脂質(zhì)應(yīng)用奠定基礎(chǔ).