新生兒B族鏈球菌定植菌株與侵襲性感染菌株血清型、α樣蛋白基因及菌毛島基因特征分析*

劉建瑜,陳繼昌,傅錦堅(jiān)△

1.桂平市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西貴港 537200；2.柳州市婦幼保健院預(yù)防保健科，廣西柳州 545001

B族鏈球菌(GBS)是革蘭陽(yáng)性球菌，約15%～30%的健康女性生殖道或胃腸道中有GBS定植[1-2]。GBS可由孕產(chǎn)婦垂直傳播給新生兒，導(dǎo)致新生兒發(fā)生GBS侵襲性感染[3-4]。新生兒GBS侵襲性感染一直備受關(guān)注，因?yàn)镚BS一旦入侵到新生兒無(wú)菌體液后，可導(dǎo)致患兒發(fā)生危及生命的腦膜炎、肺炎和敗血癥[5-6]。也有研究表明，一旦新生兒發(fā)生GBS侵襲性感染，其長(zhǎng)期結(jié)局不容樂(lè)觀，可增加包括死亡和慢性病(如腦癱、癲癇病和各種神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。多糖莢膜是GBS最重要的毒力因子，基于表面多糖結(jié)構(gòu)的差異，目前的分子方法已鑒定出10種公認(rèn)的莢膜多糖血清型，即血清型Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ至Ⅸ[10]。由于GBS血清型分布和攜帶率存在地理區(qū)域差異性，因而獲取本地GBS菌株的分子流行病學(xué)關(guān)鍵信息可為開發(fā)GBS疫苗及實(shí)施GBS預(yù)防策略的模型算法提供依據(jù)。本研究回顧性收集桂平市人民醫(yī)院分娩的新生兒以及外地轉(zhuǎn)診的感染性新生兒的GBS標(biāo)本，并對(duì)GBS菌株抗菌藥物敏感性、血清型和分子特征進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年6月在桂平市人民醫(yī)院出生或由外院轉(zhuǎn)診至桂平市人民醫(yī)院的新生兒，出生時(shí)立刻采集標(biāo)本(涂抹新生兒的耳朵、口腔和臍帶后放入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中)。經(jīng)外院轉(zhuǎn)診的新生兒，到本院新生兒科后，馬上使用無(wú)菌拭子采集咽部標(biāo)本放入轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基中，送至檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。若出生后/經(jīng)由外院轉(zhuǎn)診至桂平市人民醫(yī)院進(jìn)行救治的新生兒出現(xiàn)了氣促、呻吟、發(fā)紺或膚色蒼白等感染性癥狀，或體溫≥37.3 ℃，對(duì)此類患兒抽取2 mL血液進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征的患兒抽取腦脊液(床旁接種)進(jìn)行培養(yǎng)，并將上述患兒轉(zhuǎn)到新生兒重癥監(jiān)護(hù)室(NICU)中進(jìn)行治療。對(duì)分離鑒定為GBS的菌株，進(jìn)一步分為定植菌株(定植組)和侵襲性感染菌株(感染組),即從血液、腦脊液等無(wú)菌體液中分離培養(yǎng)出的GBS菌株納入感染組[11]，從非無(wú)菌體液(新生兒的耳朵、口腔和臍帶)中檢出GBS菌株，且新生兒本身無(wú)感染癥狀、體征，該菌株納入定植組。本研究已經(jīng)得到桂平市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批(批文20170010)。

1.2GBS標(biāo)本的分離鑒定 標(biāo)本送至桂平市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)室后，半小時(shí)內(nèi)將標(biāo)本接種于肉湯增菌培養(yǎng)基，在含有5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)、37 ℃培養(yǎng)18～24 h，再轉(zhuǎn)種至GBS顯色培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18～24 h之后，挑選粉色、紫色、紅色等可疑陽(yáng)性菌落至VITECK Compact 2鑒定儀(儀器購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司)中進(jìn)行鑒定，確定分離株為GBS。對(duì)于腦脊液和血液等無(wú)菌體液的標(biāo)本，放置血培養(yǎng)箱(儀器購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司)內(nèi)培養(yǎng)，報(bào)陽(yáng)后抽出標(biāo)本進(jìn)行革蘭染色并轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平板，進(jìn)一步進(jìn)行分離鑒定，過(guò)程同上。

1.3抗菌藥物敏感性試驗(yàn)和耐藥基因檢測(cè) K-B紙片法用于GBS的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，藥敏紙片的選擇和折點(diǎn)的判讀參照美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)提出的標(biāo)準(zhǔn)[12]。選擇青霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、氯霉素、利奈唑胺和萬(wàn)古霉素進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為菌株對(duì)≥3種不同類別的抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。此外，四環(huán)素耐藥基因型(tetM、tetO、tetL、tetK、tetT和tetS)，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因型(ermA、ermB、ermC和mefA/E)和林可酰胺耐藥基因型(linB)的檢測(cè)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，操作程序和引物的設(shè)計(jì)方法等參考文獻(xiàn)[3]。

1.4GBS的分子特征分析 采用多重PCR方法檢測(cè)GBS的血清型，α樣蛋白基因[Alpha-C蛋白(alphaC)基因、rib基因、epsilon基因、α樣蛋白2/3(alp2/3)基因和α樣蛋白4(alp4)基因]和菌毛島基因(PI1、PI2a和PI2b)，引物的設(shè)計(jì)見參考文獻(xiàn)[3]，選擇生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述基因引物后，根據(jù)文獻(xiàn)[3]的PCR擴(kuò)增步驟，對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25,P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。對(duì)血清型與α樣蛋白基因、菌毛島基因之間的關(guān)系，采用對(duì)應(yīng)分析比較兩者之間的分布差異性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1感染組和定植組的人口學(xué)和臨床特征分析 共從44例新生兒標(biāo)本中分離出GBS，經(jīng)分析其臨床癥狀和特征，其中12例(27.3%)被納入感染組，其余32例(72.7%)被納入定植組。對(duì)上述兩組新生兒的人口學(xué)特征和臨床特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，感染組早產(chǎn)兒比例高于定植組(P=0.004)。見表1。

表1 感染組和定植組的人口學(xué)和臨床特征分析

2.2定植組與感染組的耐藥表型、耐藥基因型、α樣蛋白基因、菌毛島基因與血清型分析 所有的菌株對(duì)青霉素、頭孢曲松、萬(wàn)古霉素和利奈唑胺均敏感，對(duì)紅霉素和克林霉素均耐藥，對(duì)四環(huán)素、左氧氟沙星和氯霉素的耐藥率分別為79.5%、38.6%和6.8%，多重耐藥率達(dá)88.6%。感染組攜帶菌毛島基因PI2b和α樣蛋白基因rib的比例高于定植組(P<0.05)。定植組攜帶菌毛島基因PI2a和α樣蛋白基因alphaC的比例高于感染組(P<0.05)。定植組血清型Ⅰa型比例高于感染組(P<0.05)，而感染組血清型Ⅲ型比例高于定植組(P<0.05)。見表2。

表2 定植組與感染組的耐藥表型、耐藥基因型、α樣蛋白基因、菌毛島基因與血清型分析[n(%)]

2.3新生兒GBS菌株血清型與耐藥基因型、α樣蛋白基因和菌毛島基因的特征分析 四環(huán)素耐藥基因tetT更常見于血清型Ⅰa型菌株(P=0.043)；α樣蛋白基因alphaC基因常見于血清型Ⅰa型菌株(P<0.001)；α樣蛋白基因rib基因常見于血清型Ⅲ型菌株(P<0.001)。見表3。

表3 GBS菌株血清型與耐藥基因型、α樣蛋白基因和菌毛島基因的特征分析

2.4GBS菌株血清型與α樣蛋白基因、菌毛島基因的對(duì)應(yīng)分析 對(duì)應(yīng)分析結(jié)果顯示，α樣蛋白基因在不同血清型菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.02，P<0.001)，表現(xiàn)為α樣蛋白基因rib、alp2/3更常見于血清型Ⅲ型菌株，而alphaC更常見于血清型Ⅰa型菌株，見圖1。菌毛島基因在不同血清型菌株中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.42，P=0.004)，表現(xiàn)為血清型Ⅲ型菌株更容易攜帶PI2b，而血清型Ⅰa型菌株更容易攜帶PI2a，見圖2。

圖1 GBS菌株血清型與α樣蛋白基因分布的對(duì)應(yīng)分析

圖2 GBS菌株血清型與菌毛島基因分布的對(duì)應(yīng)分析

3 討 論

一項(xiàng)納入5 315例GBS感染引起的新生兒遲發(fā)性菌血癥/腦膜炎病例的meta分析結(jié)果顯示，早產(chǎn)與GBS感染引起的新生兒遲發(fā)性菌血癥/腦膜炎風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(OR=5.66,95%CI：4.43～7.22)[11]。此外，一項(xiàng)在丹麥和荷蘭進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，早產(chǎn)不僅可以導(dǎo)致GBS侵襲性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加，且GBS感染與早產(chǎn)兩個(gè)危險(xiǎn)因素疊加，致使新生兒發(fā)生腦神經(jīng)發(fā)育受損和死亡的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[13]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，感染組早產(chǎn)兒比例高于定植組(P=0.004)，提示GBS侵襲性感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與早產(chǎn)兒的出生有關(guān)，早產(chǎn)是新生兒發(fā)生GBS感染的危險(xiǎn)因素之一，未來(lái)的GBS疫苗研究應(yīng)嘗試確定母體在妊娠期間接種GBS疫苗，且選擇最佳時(shí)間，以保護(hù)早產(chǎn)兒免受GBS侵襲性感染。

有研究顯示，GBS對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和克林霉素耐藥率在世界范圍均有逐步升高的趨勢(shì)[14-15]，且某些GBS菌株對(duì)萬(wàn)古霉素和慶大霉素產(chǎn)生了耐藥[3]。有研究報(bào)道，GBS菌株對(duì)紅霉素和克林霉素產(chǎn)生耐藥的主要分子遺傳背景基礎(chǔ)與血清型Ⅲ型/序列型別ST17流行高度相關(guān)[16]。本研究結(jié)果顯示，所有的GBS菌株均對(duì)紅霉素和克林霉素耐藥，這與以往的研究報(bào)道相似[4]。我國(guó)報(bào)道的GBS菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率為58.0%～70.8%，而歐洲和北美洲報(bào)道的GBS菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的耐藥率僅為11.5%和36.0%[4]。本研究結(jié)果表明，本地區(qū)臨床醫(yī)生不能使用紅霉素和/或克林霉素進(jìn)行預(yù)防性用藥，在抗菌藥物選擇性壓力下，本地區(qū)的GBS菌株在不久的將來(lái)有可能對(duì)氨芐青霉素、青霉素和/或頭孢類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，最終會(huì)導(dǎo)致對(duì)青霉素不耐受患者的用藥選擇十分有限。

有研究結(jié)果顯示，從定植菌株和侵襲性感染菌株分離的GBS血清型的頻率相似[17]，但本研究結(jié)果顯示，定植組更容易攜帶血清型Ⅰa型而感染組更容易攜帶血清型Ⅲ型。GBS血清型Ⅲ型已成為亞洲最為流行的菌株之一，在所有的GBS侵襲性感染中所占的比例為32.2%～77.9%[16]。盡管GBS菌株的血清型隨時(shí)間和空間分布容易發(fā)生變化，但血清型Ⅲ型在新生兒群體分離的GBS菌株中比例一直在增加[16]。孕婦接種GBS疫苗是預(yù)防新生兒發(fā)生侵襲性感染的有效策略之一[18]。世界衛(wèi)生組織提出了加快GBS疫苗的研發(fā)速度以便降低新生兒GBS侵襲性感染的發(fā)病率和病死率[19]，在此情況下，本研究的結(jié)果為本地區(qū)GBS菌株的分子流行病學(xué)特征和血清型分布提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

迄今為止，基于表型和分子特征區(qū)分GBS克隆的數(shù)據(jù)較少。本研究觀察到某些血清型與α樣蛋白基因之間存在良好的一致性，且α樣蛋白基因與血清型的分布存在差異，如血清型Ⅲ-rib和血清型Ⅰa-alphaC，與此前的研究報(bào)道GBS的特定血清型-alp基因組合(如血清型Ⅴ-alp2/3，血清型Ⅲ-rib、血清型Ia-epsilon、血清型Ⅱ-rib和血清型Ⅰb-alp2/3)的結(jié)果相似[3,20]。此外，本研究觀察到alphaC存在于非血清型Ⅲ型的GBS菌株中。因此，若能研究出由alphaC和血清型Ⅲ型組成的結(jié)合疫苗即有可能對(duì)大多數(shù)GBS感染具有保護(hù)作用。

本研究觀察到每株GBS菌株至少可檢測(cè)出一種菌毛島基因，且根據(jù)對(duì)應(yīng)分析結(jié)果，特定的血清型與菌毛島基因的分布具有一致性，如血清型Ⅲ型的GBS菌株更易攜帶菌毛島基因PI2b，血清型Ⅰa型的GBS菌株更易攜帶菌毛島基因PI2a，此發(fā)現(xiàn)與之前的研究報(bào)道結(jié)果一致[21]。有研究報(bào)道表明，菌毛島基因的存在可能會(huì)增加某些菌株在人體中的適應(yīng)性和定植潛力，菌毛島基因可使GBS菌株錨定在孕產(chǎn)婦陰道內(nèi)并增加了隨后GBS垂直傳播的機(jī)會(huì)[22-23]。結(jié)合本研究結(jié)果和以往研究結(jié)論，可加深臨床醫(yī)生對(duì)不同標(biāo)本來(lái)源和不同地區(qū)來(lái)源菌株的菌毛島基因分布模式和菌株遺傳背景多樣性的了解，并對(duì)未來(lái)基于菌毛島基因開發(fā)新的GBS疫苗提供啟示。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示本地區(qū)分離的新生兒GBS菌株對(duì)紅霉素和克林霉素有較高的耐藥性，強(qiáng)調(diào)了持續(xù)性監(jiān)測(cè)GBS菌株抗菌藥物敏感性的必要性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)GBS菌株特定的血清型-α樣蛋白基因和血清型-菌毛島基因的組合，即GBS菌株的α樣蛋白基因和菌毛島基因在不同血清型菌株中的分布存在差異性，凸顯了監(jiān)測(cè)GBS菌株的分子特征以發(fā)現(xiàn)GBS新的流行病學(xué)趨勢(shì)的價(jià)值，并為制訂新的GBS疫苗提供了本土流行病學(xué)依據(jù)。