脾氣虧虛與腹膜間皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬的關(guān)系探討

孟立鋒，吳敏華，劉前程，楊端云，史 偉，樊均明

(1廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，國家中醫(yī)藥管理局重點?？疲瑥V西 南寧 530023； 2西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合器官纖維化實驗室，四川 瀘州 646000； 3四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是終末期腎病患者的腎臟替代療法之一。與血液透析相比，PD可以較好地保護殘余腎功能，同時其早期生存率較高。目前使用PD的人數(shù)在欠發(fā)達國家快速增加，尤其是在中國[1]。對經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)而言，PD已成為大部分終末期腎病患者行血液凈化方式的首要選擇。近年來國內(nèi)外有學(xué)者提出PD優(yōu)先的原則[2]，但長期過度使用PD會導(dǎo)致間皮下細胞基外沉積、新生血管形成等結(jié)構(gòu)和功能的改變。研究表明，在PD開始后4～5 年內(nèi)，約50%的患者出現(xiàn)腹膜超濾功能衰竭，轉(zhuǎn)為血液透析[3]。腹膜超濾功能衰竭的主要因素是腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)，同時它也是患者退出PD的首要因素。PF最重要的特征就是腹膜間皮細胞(peritoneal mesothelial cells，PMC)逐漸向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，這是PF的早期階段和可逆過程，在PF的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[4]。因此，針對性干預(yù)PMC的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程是防治PF的重要靶點，開發(fā)延緩或逆轉(zhuǎn)EMT進程的技術(shù)或藥物就成為研究者所關(guān)注的重要課題。

自噬對真核細胞維持穩(wěn)態(tài)和實現(xiàn)更新有重要意義。自噬與PF的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，抑制自噬可減少人PMC EMT發(fā)生[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到體內(nèi)外因素破壞時,維持細胞生存的一種自我保護機制；調(diào)控PMC ERS可以保護PMC避免受到轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)的EMT[6]。ERS可誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬。針對性干預(yù)ERS誘導(dǎo)的自噬活性可能是防治EMT發(fā)生的重要靶點。

PF的發(fā)病機制復(fù)雜，目前缺乏有效防治措施。中醫(yī)藥在預(yù)防或延緩PF方面做了很多積極的研究。近年的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，具有益氣功效的中藥及其制劑可能具有干預(yù)細胞ERS[7]、進而干預(yù)EMT進程、防治PF的作用。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)脾氣虧虛是 PD相關(guān)的腹膜早期病變的主要病機[8]，而EMT又是PF的早期事件[9]。因此，我們認為脾氣虧虛與PMC ERS誘導(dǎo)的自噬有密切相關(guān)性，本文就二者之間的關(guān)系進行探討，以期從健脾益氣著手防治PD誘導(dǎo)的EMT，為中醫(yī)藥干預(yù)PF提供新策略。

1 PMC EMT是PF的早期階段和可逆過程

腹膜是體內(nèi)面積最大的漿膜組織，由PMC、基底膜和結(jié)締組織組成類似“三明治”的結(jié)構(gòu)。PMC對維持腹膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起重要作用，在非生理性的PD液、腹膜炎等因素的反復(fù)刺激下開啟自我修復(fù)的程序，從而引起腹膜形態(tài)的改變[10]，促進了PF的形成。

PF的初始因素是PMC損傷。2003年YANEZ-MO首次發(fā)現(xiàn)PMC EMT的現(xiàn)象。EMT是一個復(fù)雜的動態(tài)演變過程，包括重新排列細胞結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細胞分子水平及促進新生化標(biāo)志物的表達。在長期PD過程中，損傷了PMC層，導(dǎo)致PMC逐漸失去上皮細胞形態(tài)學(xué)特征，而呈現(xiàn)纖維母細胞樣表型，參與進行性纖維化及新生血管形成，腹膜通透性被改變，使腹膜溶質(zhì)轉(zhuǎn)運能力和超濾能力逐漸下降，最終導(dǎo)致腹膜超濾功能衰竭[11-12]。國內(nèi)有學(xué)者研究表明扶腎顆粒、健脾益氣方、扶腎方等中藥復(fù)方可能通過干預(yù)大鼠PMC EMT進程，進而延緩PF的進展[13-15]?？梢?，EMT是PF的早期階段和可逆過程，開展中醫(yī)藥針對PMC EMT進程防治PF的研究，體現(xiàn)了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“既病防變”的理念。

2 PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬參與了EMT進程

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)最大的膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，主要承擔(dān)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾、組裝和運輸?shù)闹厝?。?dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞時，可能導(dǎo)致錯誤/未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積聚，激活ERS。當(dāng)發(fā)生ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)來保護細胞和修復(fù)細胞的損傷。適度的ERS可啟動適應(yīng)性UPR，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持細胞生存；但嚴(yán)重或持續(xù)的ERS使保護機制不能與損傷抗衡，導(dǎo)致細胞損害甚至發(fā)生凋亡。大量證據(jù)表明，ERS參與器官纖維化，在間皮細胞表型轉(zhuǎn)化和凋亡中起到重要作用，ERS可以誘導(dǎo)肺臟和腎臟間皮細胞EMT改變，進而導(dǎo)致纖維化積聚[16-17]。

SHIN等[6]研究表明，PD可使PMC發(fā)生ERS，ERS參與并誘導(dǎo)人PMC EMT和凋亡，調(diào)控ERS可以預(yù)防TGF-β1引起的腹膜損傷。體外培養(yǎng)的人PMC經(jīng)ERS激活劑衣霉素刺激12 h，可以出現(xiàn)EMT改變，當(dāng)去除衣霉素干預(yù)后，EMT改變得到逆轉(zhuǎn)；延長衣霉素刺激至48 h，EMT改變不能逆轉(zhuǎn)；提示逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的EMT呈時間依賴方式。衣霉素預(yù)處理人PMC，可以對TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和凋亡起到保護作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)ERS阻滯劑牛熊去氧膽酸可以改善TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，說明ERS不能直接誘導(dǎo)EMT，但ERS是TGF-β1誘導(dǎo)的EMT中的主要調(diào)節(jié)因子。以上研究表明，激活ERS或阻斷過度的ERS是保護PMC的重要靶點[6]。

自噬是細胞應(yīng)激時啟動的一種依賴于溶酶體降解的程序，通過降解錯誤折疊蛋白質(zhì)或清除受損的細胞器來維持真核細胞的穩(wěn)態(tài)。1,25(OH)2D3通過干預(yù)mTOR信號通路影響高糖誘導(dǎo)的人PMC自噬，進而干預(yù)EMT進程[18]。體外研究表明，脂多糖誘導(dǎo)自噬能觸發(fā)PMC產(chǎn)生自主防御機制以應(yīng)對大腸桿菌感染[19]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫對高糖誘導(dǎo)的人PMC損傷有保護作用，其機制可能與硫化氫抑制細胞自噬有關(guān)[20]。因此，自噬是一種保護性機制。當(dāng)PMC受到致病因素損傷時，增加自噬水平可以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而保護細胞。

多項研究表明，ERS可通過多種分子機制誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力并促進細胞生存，且在長期應(yīng)激條件下觸發(fā)凋亡途徑。多數(shù)研究表明，ERS誘導(dǎo)的自噬起到促進細胞存活的作用，但高強度或持久的應(yīng)激可啟動細胞依賴自噬的死亡程序[21-22]。由于兩者間關(guān)系復(fù)雜，并且與PMC EMT有密切關(guān)系。因此，更好地了解ERS與自噬促生存或促凋亡信號轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵節(jié)點，通過治療性干預(yù)ERS通路的靶分子來調(diào)控自噬從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，延緩EMT，有望為PF的治療提供新的思路。

3 PMC ERS可能通過需肌醇激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)/X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)通路誘導(dǎo)自噬，進而導(dǎo)致EMT

ERS是分泌型細胞的經(jīng)典特征，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白[葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)]和三種跨膜信號蛋白[雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、IRE1和活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)]介導(dǎo)。其中，GRP78是ERS和UPR激活的標(biāo)志物[23]。當(dāng)錯誤折疊或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時，GRP78與感受器蛋白解離，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔執(zhí)行蛋白折疊功能。通過IRE1/XBP1、PERK-eIF2α和ATF6-ERSE三條信號通路完成UPR，調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯、折疊和降解能力以適應(yīng)內(nèi)環(huán)境紊亂。

有研究表明，PERK通過eIF2α磷酸化阻止ATF4等蛋白轉(zhuǎn)錄，ATF4通過調(diào)控ATG轉(zhuǎn)錄基因如Atg5、Atg7、Atg10激活自噬，而且在過度ERS時通過降解XIAP和CHOP蛋白激活凋亡[24]。ATF6則通過 XBP1和CHOP調(diào)控自噬和凋亡[25]。可見，PERK-eIF2α和ATF6-ERSE通路不能直接調(diào)控自噬，IRE1/XBP1通路則與自噬有直接關(guān)系。IRE1/XBP1通路中IRE1是ERI型跨膜蛋白，在人體中存在α和β兩種異構(gòu)體，IRE1β只在小腸表達，而IRE1α在各個組織均有表達。IRE1α同時具有蛋白激酶和核酸內(nèi)切酶活性，在發(fā)生ERS時，活化的IRE1α與底物XBP1的前體mRNA分子結(jié)合，移碼剪接成具有活性的轉(zhuǎn)錄因子剪接型X- 盒結(jié)合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)，激活UPR，起到保護細胞，促進細胞生存的作用。

IRE1α/XBP1通路把內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、自噬和EMT聯(lián)系起來，是一個重要的橋梁。一系列研究證實其在EMT調(diào)節(jié)中的新作用。有研究表明，在ERS的早期階段，磷酸化的IRE1α通過c-jun 氨基末端蛋白激酶解離自噬相關(guān)蛋白Beclin1/Bcl-2，近而激活自噬[26]，XBP1通過激活Beclin1觸發(fā)自噬[27]。最近有研究表明ERS通路IRE1α/XBP1在腫瘤細胞EMT進程中起重要作用[28]。有研究表明，ERS通過激活GRP78、XBP1等蛋白，引起肺泡上皮細胞、近曲小管上皮細胞出現(xiàn)EMT改變[29]。PD患者PMC GRP78的表達與PMC EMT程度呈正相關(guān)[6]。體內(nèi)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，XBP1s抑制劑可顯著減輕高糖誘導(dǎo)的腹膜形態(tài)學(xué)改變及PF[30]，這些研究表明ERS通路IRE1α/XBP1可能與PMC的自噬及EMT改變有密切關(guān)系。因此我們推測，ERS通路IRE1α/XBP1可能是PD誘導(dǎo)PMC自噬、發(fā)生EMT改變的主要分子機制。調(diào)控IRE1α/XBP1通路影響PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬活性，激活其適應(yīng)性保護機制，可能是預(yù)防PMC EMT發(fā)生的新靶點。

4 PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬可能是脾氣虧虛的微觀機制

PD的原理主要是利用腹膜完成血液與PD液之間的溶質(zhì)交換，從而實現(xiàn)血液凈化。但長期過度使用PD會導(dǎo)致腹膜損傷，出現(xiàn)腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變。通過對252例接受PD≥3個月的患者進行中醫(yī)證候的分析，發(fā)現(xiàn)PD初期以脾腎氣虛證多見[31-32]。《素問·熱論》中提出“脾主大腹”，說明腹膜功能與脾關(guān)系密切。大量的PD液灌入腹腔，造成人為的“水濕困脾”，長期容易損傷脾氣，出現(xiàn)脾氣虧虛的癥狀。曹曼等[33]研究表明，加味參苓白術(shù)散可改善患者的PD功能，降低血清中PF指標(biāo)(TGF-β1、纖維連結(jié)蛋白)。我們的研究以60例持續(xù)性不臥床PD患者為研究對象，發(fā)現(xiàn)健脾益氣法能顯著改善患者疲倦乏力、納差等臨床癥狀，而且能降低PD透出液中TGF-β1、血管內(nèi)皮生長因子的表達水平，從而保護腹膜功能[34]。脾氣虧虛是腹膜早期病變的主要病機，而EMT是PF的早期階段和可逆過程。因此，我們認為脾氣虧虛與PMC EMT有密切關(guān)系，健脾益氣法可能起到延緩或逆轉(zhuǎn)EMT的作用。

有諸內(nèi)，必形諸外。既然PD早期腹膜病變與脾氣虧虛密切相關(guān)，那么PMC損傷的病理機制也應(yīng)與脾氣虧虛有關(guān)。中醫(yī)理論認為脾主運化水液，指脾對水液的吸收、轉(zhuǎn)輸和布散功能。脾氣健旺才能正常發(fā)揮運化水液的功能，水液在體內(nèi)不停滯才能有效防止痰濕氣、水飲等病理產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果脾氣虧虛，運化功能減退，則導(dǎo)致津液代謝障礙，多余的水液停留在局部，即可產(chǎn)生痰飲、濕濁等病變。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有完成蛋白質(zhì)的合成和運輸?shù)墓δ埽@與中醫(yī)“脾主運化水液”的功能相似。當(dāng)PMC受到致病因素損傷時， 即發(fā)生ERS(脾氣虧虛、失于運化)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成的蛋白質(zhì)得不到及時的轉(zhuǎn)運，錯誤/未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積。此時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過啟動UPR和誘導(dǎo)細胞自噬來保護PMC和修復(fù)細胞的損傷，從而維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，有利于細胞存活。有研究表明，補脾方藥能改善脾陰虛糖尿病認知功能障礙，其機制可能與調(diào)節(jié)下丘腦中自噬及ERS相關(guān)[35]。邱靜[36]研究表明，加減薯蕷丸通過上調(diào)自噬水平和減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負荷，從而對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)元起到保護作用。我們的研究表明，健脾益氣方能有效減輕PD微炎癥狀態(tài)誘導(dǎo)的PMC損傷[15]。因此，我們推測健脾益氣法可能通過調(diào)控IRE1α-XBP1通路影響PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬活性，激活PMC的適應(yīng)性保護機制，延緩或逆轉(zhuǎn)EMT。

5 結(jié)語

綜上所述，結(jié)合目前中醫(yī)藥防治PF的研究成果及我們已有的工作基礎(chǔ)，針對PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬在EMT中的發(fā)生機制與“脾氣虧虛”有密切相關(guān)性，進一步研究健脾益氣功效的中藥，通過調(diào)控IRE1α/XBP1通路影響PMC ERS及其誘導(dǎo)的自噬活性，激活其適應(yīng)性保護機制，逆轉(zhuǎn)或延緩EMT進程，進而保護PMC結(jié)構(gòu)和功能。這不僅為闡明ERS誘導(dǎo)PMC自噬在EMT中的發(fā)生機制提供重要的實驗數(shù)據(jù)，而且對進一步開發(fā)有效保護腹膜功能和防治PF的中藥方劑提供新的思路和方法。