病毒性出血熱動(dòng)物模型研究進(jìn)展

梁 燕，鄭煦暘，連建奇

( 1空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，陜西 西安 710038； 2西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

病毒性出血熱(viral hemorrhagic fevers，VHFs)是由多種病毒引起，以發(fā)熱、出血、休克等為特征的一類重要傳染病，多為自然疫源性疾病[1]。已知引起VHFs的病原體均為有包膜的RNA病毒，按照現(xiàn)行國(guó)際通用病毒學(xué)分類屬于砂粒病毒科、漢坦病毒科、白蛉病毒科、黃病毒科、披膜病毒科、絲狀病毒科6個(gè)科[2]，上述病毒曾多次引起傳染病疫情，其致病機(jī)制和治療措施研究受到極大關(guān)注。2018年，WHO從疾病流行潛力及應(yīng)對(duì)措施等方面對(duì)傳染病進(jìn)行了評(píng)估和篩選，明確了10種已知的有可能引起突發(fā)公共衛(wèi)生事件、缺乏有效藥物治療和疫苗防疫、迫切需要加緊研究的疾病，其中5種為VHFs(克里米亞-剛果出血熱、埃博拉病毒病、馬爾堡出血熱、拉沙熱、裂谷熱)[3]，也說(shuō)明了VHFs研究的緊迫性。

人類疾病動(dòng)物模型是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象和材料，使用人類疾病動(dòng)物模型是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中極為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段。鑒于多種VHFs發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，救治措施仍然有限，開發(fā)和運(yùn)用動(dòng)物模型，復(fù)制VHFs發(fā)病過(guò)程，對(duì)研究VHFs具有深遠(yuǎn)意義。本文從不同疾病出發(fā)，綜述VHFs動(dòng)物模型研究現(xiàn)狀及其優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)出開發(fā)理想的出血熱動(dòng)物模型的可能思路。

1 拉沙熱(Lassa fever，LF)

LF是一種由拉沙病毒(Lassa virus，LASV)引起的、通過(guò)鼠類傳播的急性動(dòng)物源性傳染病，病死率高，疫區(qū)主要分布在非洲西部的尼日利亞等地。據(jù)估計(jì)，西非每年有30萬(wàn)～50萬(wàn)人感染LASV，死亡5 000～10 000例[4]。2020年10月發(fā)布的《全球傳染病疫情概要》指出，LF病死率高達(dá)20.6%，排名第三[5]。

1.1 嚙齒動(dòng)物模型

嚙齒動(dòng)物是LASV的天然宿主，可攜帶并散播病毒而自身無(wú)病理表現(xiàn)[6]。YUN等[7]發(fā)現(xiàn)敲除STAT1基因(STAT1-/-)的129Sv小鼠不僅對(duì)LASV感染高度敏感(包括臨床分離株)，而且還會(huì)有脾臟壞死凋亡、肝細(xì)胞廣泛損傷、播散性感染等與臨床患者類似的表現(xiàn)，可出現(xiàn)致死性結(jié)局，該模型已用于LF的發(fā)病機(jī)制和免疫學(xué)研究，也可用于疫苗和抗病毒藥物篩選。SHIEH等[8]建立了一種基于Pichinde病毒(與LASV一樣屬沙粒病毒科，是一種對(duì)人類無(wú)致病性的病毒)的雜交Hartley豚鼠模型，其與人感染LASV的組織病理學(xué)表現(xiàn)和病毒抗原分布相似，可作為L(zhǎng)ASV感染和發(fā)病機(jī)制研究以及疫苗和藥物篩選的模型[6]。

1.2 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型

NIKLASSON等[9]采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)來(lái)定量檢測(cè)作為人類LF模型的恒河猴血清中的LASV抗原，對(duì)建立LF的快速診斷方法做出了貢獻(xiàn)。食蟹猴感染LASV后可出現(xiàn)非常類似人類LF的疾病，是疫苗和抗病毒藥物評(píng)估以及發(fā)病機(jī)制研究的理想模型[9]。雖然非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可作為人類LF的良好模型，但其昂貴的成本使其應(yīng)用受到限制。

2 腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)

HFRS是由漢坦病毒引起的一種自然疫源性疾病。主要致病的漢坦病毒有四種——漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)、漢城病毒、多布拉伐-貝爾格萊德病毒和普馬拉病毒[10]。HTNV的主要宿主和傳染源是黑線姬鼠。HFRS主要表現(xiàn)為急性腎損傷、血管通透性增加、凝血功能異常[11]。

2.1 嚙齒動(dòng)物模型

姚楚錚等[12]在乳鼠腦內(nèi)接種漢坦病毒 A16株后，發(fā)現(xiàn)該病毒對(duì)新生乳鼠具有高度致病性，但與人類疾病表現(xiàn)不同，而成年小鼠接種后不發(fā)病。當(dāng)給成年小鼠多次小劑量注射環(huán)磷酰胺以抑制其免疫功能時(shí)，小鼠由隱性感染變?yōu)榧毙灾滤佬愿腥荆∷佬∈蟮哪X、肺和脾等器官均有明顯病變，且特點(diǎn)與人的病理改變基本相同，為探討其發(fā)病機(jī)制提供了思路。SHIMIZU等[13]論述重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠感染HTNV后會(huì)導(dǎo)致伴有肺水腫的致死性疾病，但未見HFRS所特有的出血病變。也有人發(fā)現(xiàn)從患者體內(nèi)分離的某些毒株可引起成年小鼠腎出血。MA等[14]建立的NLRC3-/-小鼠模型感染HTNV后出現(xiàn)腎臟髓質(zhì)出血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化和血漿中部分細(xì)胞因子表達(dá)的升高，可能有助于評(píng)估候選疫苗和治療方法。

敘利亞倉(cāng)鼠是HTNV感染的另一種常見動(dòng)物模型，HTNV可在具有免疫力的倉(cāng)鼠中引起致死性疾病。HOOPER等[10]研制了一種針對(duì)HTNV M片段的DNA疫苗。該疫苗對(duì)倉(cāng)鼠有保護(hù)作用。PERLEY等[15]提出了一種HTNV低劑量倉(cāng)鼠感染模型，增強(qiáng)了倉(cāng)鼠模型在疫苗和治療試驗(yàn)中的有效性。

2.2 其他動(dòng)物模型

PERLEY等[15]證明雪貂能夠被高滴度的HTNV感染，但被感染的雪貂除了體質(zhì)量減輕外，沒(méi)有出現(xiàn)腎功能損害及其他明顯癥狀。PERLEY等[15]還首次報(bào)道暴露在HTNV下的狨猴會(huì)發(fā)生無(wú)癥狀感染，產(chǎn)生高水平的中和抗體?？傮w來(lái)看，目前HTNV的感染模型主要適用于試驗(yàn)疫苗和抗病毒藥物，尚無(wú)良好的發(fā)病模型。

3 發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)是2009年我國(guó)科學(xué)家首次從一類以發(fā)熱、血小板減少、白細(xì)胞減少、胃腸道癥狀、精神癥狀等為臨床表現(xiàn)的患者體內(nèi)分離出的一種新型布尼亞病毒[16]，其與白蛉病毒屬的親緣關(guān)系最近，現(xiàn)命名為“Dabie bandavirus”。

3.1 SFTS嚙齒動(dòng)物模型

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心對(duì)C57/B16、BALB/c、敘利亞倉(cāng)鼠、黃金地鼠等免疫系統(tǒng)健全的健康嚙齒動(dòng)物進(jìn)行研究，結(jié)果表明上述動(dòng)物對(duì)SFTSV耐受，感染SFTSV后均未出現(xiàn)嚴(yán)重感染或致死性結(jié)局[17]。該單位使用新生昆明小鼠感染SFTSV后發(fā)現(xiàn)，新生小鼠對(duì)SFTSV高度敏感，被感染個(gè)體均在感染后7～8 d內(nèi)死亡，這可能與新生小鼠免疫功能尚未發(fā)育健全有關(guān)。同時(shí)，在免疫功能健全的健康小鼠感染SFTSV后，被感染個(gè)體均能存活，而將小鼠用絲裂霉素C處理后(抑制免疫功能)再感染SFTSV，則會(huì)出現(xiàn)一些感染癥狀甚至致死結(jié)局[17]。美國(guó)MATSUNO等[18]對(duì)缺乏α/β干擾素(interferon α/β，IFN-α/β)受體的C57/BL6小鼠進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其感染SFTSV后的癥狀表現(xiàn)與人類SFTS病例中多臟器損傷的特點(diǎn)相似。日本研究人員用缺乏IFN-α/β受體的AG129小鼠來(lái)評(píng)價(jià)抗血清、利巴韋林等對(duì)SFTS的治療作用[17]。目前，免疫缺陷小鼠特別是IFN-α/β干擾素受體敲除的小鼠已被普遍接受為SFTSV的有效動(dòng)物模型。

GOWEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，感染SFTSV的倉(cāng)鼠血液和大部分組織中均出現(xiàn)感染病毒滴度，且脾臟、肝臟出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥病變，而法匹拉韋治療SFTSV感染的STAT2-/-倉(cāng)鼠可將血清病毒載量降低3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。

3.2 其他SFTS動(dòng)物模型

MATSUNO等[18]評(píng)估SFTSV對(duì)食蟹猴的致病作用，并未觀察到臨床癥狀。我國(guó)研究人員對(duì)恒河猴也進(jìn)行了類似實(shí)驗(yàn)，結(jié)果僅表現(xiàn)為輕度癥狀，未致病或引起死亡。

PARK等[20]提出年齡是SFTS發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，報(bào)告了一種與年齡有關(guān)的SFTSV感染和發(fā)病機(jī)制的雪貂模型，與人類SFTS表現(xiàn)類似。年輕成年雪貂感染SFTSV后沒(méi)有出現(xiàn)任何癥狀，而高齡雪貂感染SFTSV后表現(xiàn)出嚴(yán)重的血小板和白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少以及高熱癥狀，死亡率高達(dá)93%。此外，高齡雪貂的病毒載量更高。同年，PARK等[21]用SFTSV感染貓，發(fā)現(xiàn)貓對(duì)SFTSV高度敏感，癥狀與人類SFTS病例相似或更為嚴(yán)重。

4 登革熱(Dengue fever，DF)

DF是由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起并經(jīng)伊蚊傳播的一種急性傳染病，分為典型、輕型和重型。重型患者可出現(xiàn)休克、出血癥狀，病情發(fā)展迅速，多因中樞性呼吸衰竭和出血性休克而在24 h內(nèi)死亡。近年來(lái)，我國(guó)口岸多次檢出輸入性DF病例[22]。

4.1 DF嚙齒動(dòng)物模型

DENV感染BALB/c小鼠的動(dòng)物模型可觀察細(xì)胞免疫反應(yīng)，用于發(fā)病機(jī)制研究、治療藥物和疫苗測(cè)試，但免疫功能健全的小鼠只能建立感染模型，無(wú)法建立致病模型。有人用DENV感染成年BALB/c小鼠及裸鼠，發(fā)現(xiàn)裸鼠對(duì)DENV更為敏感，證明T細(xì)胞在抗DENV感染中起重要作用[23]。還有研究者利用缺乏IFN-α/β、IFN-γ受體的AG129小鼠構(gòu)建了感染模型，在感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)了高水平病毒復(fù)制，感染的小鼠表現(xiàn)出病毒血癥、血漿滲漏等體征，也產(chǎn)生了免疫病理反應(yīng)[24]，因此，該模型成為研究DF發(fā)病機(jī)制的常用動(dòng)物模型。BENTE等[25]將人臍血造血祖細(xì)胞(CD34+)移植到缺乏T、B細(xì)胞的非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic， NOD)/SCID小鼠中，構(gòu)建人源化小鼠，使其感染DENV，引發(fā)人類部分對(duì)DENV的特異性免疫應(yīng)答，結(jié)果小鼠出現(xiàn)發(fā)熱、血小板減少等癥狀，可用于發(fā)病機(jī)制的研究和藥物篩選。JANGALWE等[26]開發(fā)了干細(xì)胞因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和IL-3的人源化NSG小鼠(NSG-SGM3小鼠)，用DENV感染NSG-SGM3小鼠后，產(chǎn)生的特異性IgM和IgG反應(yīng)水平高于對(duì)照小鼠，可能成為研究人抗DENV B細(xì)胞反應(yīng)的有用模型。其他一些人源化小鼠如NRG小鼠、DRAG小鼠也被用于DENV感染模型，但均未出現(xiàn)人類DENV感染中的血漿滲漏和出血現(xiàn)象[27]。

4.2 其他DF動(dòng)物模型

DENV的自然宿主是人類和伊蚊，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染后并不表現(xiàn)典型癥狀。FERNANDEZ等[28]使用恒河猴感染模型來(lái)評(píng)估一種新的DENV候選疫苗的免疫原性和限制感染后病毒復(fù)制的能力。MOI等[29]在普通狨猴模型中評(píng)估了二次異型DENV感染，即先后使用兩種血清型DENV感染狨猴，結(jié)果顯示，第二次感染后，狨猴會(huì)產(chǎn)生高水平的病毒血癥，并具有某些嚴(yán)重DF的表現(xiàn)，狨猴中和抗體滴度的快速增加與人類DENV感染時(shí)的抗體應(yīng)答模式類似，這表明狨猴模型可用于研究DENV感染，是DENV感染研究和疫苗開發(fā)的潛在有用動(dòng)物模型。

在另一項(xiàng)研究中，用DENV皮下注射感染豬，可產(chǎn)生病毒血癥、抗DF IgM、IgG和中和抗體反應(yīng)，但并未出現(xiàn)任何癥狀。通過(guò)靜脈注射DENV感染豬，出現(xiàn)皮疹和皮膚水腫的癥狀。對(duì)豬進(jìn)行疫苗接種，可產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答[30]。

5 埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)

EVD亦可稱為埃博拉病，是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一種烈性傳染病，其致病性強(qiáng)、病死率高。EVD不僅威脅著非洲的公共衛(wèi)生安全，也可以通過(guò)病毒攜帶者危及世界。EVD呈不規(guī)律暴發(fā)特征，四季均可發(fā)病。2020年10月發(fā)布的《全球傳染病疫情概要》指出，EVD病死率高達(dá)42.3%，排名第一[5]。

5.1 EVD嚙齒動(dòng)物模型

EBOV不能感染免疫系統(tǒng)完整的成年小鼠[31]，而成年的免疫缺陷小鼠如SCID小鼠可被感染致死，其臨床表現(xiàn)不同于人類。SCID小鼠感染后仍能健康生存數(shù)周，后出現(xiàn)體質(zhì)量下降等體征，20～25 d后死亡[32]。使用部分免疫相關(guān)基因敲除，如IFN-α/β受體或STAT基因敲除小鼠，也可以表現(xiàn)出類似EVD的特征。與小鼠相比較，使用豚鼠僅引起短期的非致死發(fā)熱癥狀，但可表現(xiàn)出相對(duì)更為嚴(yán)重的凝血功能障礙，包括血小板數(shù)量減少、凝血時(shí)間延長(zhǎng)等現(xiàn)象[33]。SAITO等[34]用rVSV/EBOV(假病毒)感染敘利亞倉(cāng)鼠，導(dǎo)致其死亡，證明該動(dòng)物模型可作為篩選靶向EBOV GP藥物的有用工具。

5.2 EVD非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染EBOV后表現(xiàn)與人類類似，其中恒河猴、食蟹猴均對(duì)EBOV高度敏感，食蟹猴臨床癥狀出現(xiàn)最快，恒河猴臨床癥狀雖然出現(xiàn)時(shí)間晚[32]，但更接近于人類，該模型被廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)。

6 結(jié)語(yǔ)

總結(jié)上述幾種VHFs動(dòng)物模型的研究情況，我們可以發(fā)現(xiàn)，目前較為成熟的動(dòng)物模型多為嚙齒動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型。在嚙齒動(dòng)物中，一些免疫相關(guān)基因敲除或基因缺陷的動(dòng)物存在感染、發(fā)病、致死等情況，在發(fā)病機(jī)制研究中應(yīng)受到關(guān)注；而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物表現(xiàn)與人類似，在藥物驗(yàn)證和疫苗研發(fā)中應(yīng)受到關(guān)注。

理想的動(dòng)物模型應(yīng)該具有相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性以及經(jīng)濟(jì)性等特點(diǎn)。動(dòng)物模型應(yīng)盡可能地復(fù)制人類疾病，也應(yīng)盡量便于控制其疾病的發(fā)生發(fā)展，以利于研究的開展。同時(shí)，動(dòng)物模型應(yīng)采用容易執(zhí)行的方法來(lái)特異地反映某種疾病發(fā)生、發(fā)展及其病理生理改變，從而讓研究成本較低且具有較好的重復(fù)性[35]。從上述角度分析，目前VHFs動(dòng)物模型仍存在以下缺陷：①感染途徑單一，不能模擬氣溶膠傳播、蟲媒傳播等感染途徑；②不同病毒株感染后癥狀不統(tǒng)一；③不能完全模擬人類被病毒感染發(fā)病的過(guò)程，且疾病表現(xiàn)與人體差異大，如現(xiàn)有的HTNV感染模型均不能模擬HFRS患者毛細(xì)血管損傷和血漿滲漏等嚴(yán)重的病理生理過(guò)程；④一些免疫相關(guān)基因敲除之后影響抗病毒免疫反應(yīng)，不利于系統(tǒng)開展機(jī)制研究。目前，應(yīng)用于VHFs的免疫缺陷動(dòng)物模型較多，主要包括：T淋巴細(xì)胞功能缺陷(裸鼠)；聯(lián)合免疫功能缺陷(T、B淋巴細(xì)胞功能缺陷的SCID小鼠、NOD/SCID小鼠)；其他免疫缺陷模型，如B淋巴細(xì)胞功能缺陷(XID小鼠)、NK細(xì)胞缺陷(Beige小鼠)。此外，有研究者提出，病原體感染劑量也是動(dòng)物模型建立中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題[36]。為克服現(xiàn)有VHFs動(dòng)物模型的種種缺陷，使用基因工程技術(shù)導(dǎo)入來(lái)自人類的基因片段，或直接將來(lái)自人體的細(xì)胞或組織移植入小鼠所構(gòu)建的人源化小鼠模型中，可能是未來(lái)VHFs動(dòng)物模型研究的重要方向。例如，在應(yīng)用CB17-SCID小鼠移植人免疫系統(tǒng)的模型構(gòu)建之前，黑猩猩是適用于HIV研究的惟一動(dòng)物模型，人源化小鼠模型為體內(nèi)研究HIV提供了可能，而且可用于HIV感染、疾病發(fā)生過(guò)程、潛伏期以及病毒學(xué)等多方面研究。從HIV模型建立的過(guò)程可以發(fā)現(xiàn)人源化小鼠具有如下特征：①遺傳背景清晰；②成本較低且易獲得；③具備人的部分免疫功能，可模擬病原體自然感染人的過(guò)程和產(chǎn)生的病理變化。目前，人源化小鼠模型在DF中已有應(yīng)用[27]。為了更加真實(shí)地模擬人體VHFs的病理特征，提高發(fā)病機(jī)制研究的準(zhǔn)確性，增強(qiáng)治療措施的針對(duì)性，在未來(lái)建立更多VHFs的人源化免疫系統(tǒng)或人源化器官動(dòng)物模型很有必要。同時(shí)，不同動(dòng)物模型具有各自的優(yōu)勢(shì)和局限性，建立包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、大動(dòng)物、媒介動(dòng)物等在內(nèi)的多樣化的動(dòng)物模型體系，才能更加有效地支撐各種VHFs的發(fā)病機(jī)制、抗病毒藥物和疫苗臨床前評(píng)價(jià)等研究，從而為未來(lái)應(yīng)對(duì)各種新發(fā)突發(fā)傳染病做好充足準(zhǔn)備。