線粒體DNA基因組不穩(wěn)定性在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展

劉秋龍 邢金良 高一釗 王珍妮 周凱翔 張召輝 周峰 郭旭

作者單位：712000 咸陽 1陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院；710032 西安 2空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理教研室；221000 徐州 3中國(guó)人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其高危人群主要為病毒性肝炎、慢性肝病和肝硬化患者，嚴(yán)重威脅人類生命健康［1］。目前，HCC的防治形勢(shì)仍然嚴(yán)峻，因此亟需尋找高效、靈敏的標(biāo)志物用于其早期篩查及臨床診斷。近年有研究顯示，線粒體DNA基因組不穩(wěn)定性（mitochondrial genome instability，mtGI）在HCC的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［2］。mtGI是腫瘤細(xì)胞的主要特征，主要表現(xiàn)為各種類型的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）變異。mtDNA變異可分為“質(zhì)變”和“量變”兩大類，其中“質(zhì)變”包括單堿基替換（點(diǎn)突變）、片段插入缺失等突變，“量變”主要指拷貝數(shù)變異。既往研究多在組織水平層面探索mtDNA變異［3］。然而，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織或轉(zhuǎn)移灶中的mtDNA可釋放到外周血循環(huán)中，因此檢測(cè)腫瘤來源的mtDNA變異在腫瘤早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估等方面具有巨大的應(yīng)用前景。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿及外泌體中存在多種類型mtDNA變異［4-5］。本文就HCC中的mtDNA變異及其在液體活檢中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為HCC防治提供新的借鑒。

1 mtDNA“質(zhì)變”與HCC

1.1 單堿基替換

腫瘤細(xì)胞中存在多種mtDNA突變類型，其中單堿基替換又稱點(diǎn)突變，是mtDNA最常見的突變類型，從來源上可分為體細(xì)胞突變和遺傳突變。細(xì)胞中的mtDNA具有多拷貝特性，因此mtDNA體細(xì)胞突變常呈現(xiàn)“異質(zhì)性”，即細(xì)胞中野生型和突變型mtDNA共存。而mtDNA遺傳突變往往是“同質(zhì)性”的，即細(xì)胞中突變型mtDNA占比為100%。目前已有多項(xiàng)研究分析了HCC患者mtDNA點(diǎn)突變的特征，如本課題組對(duì)156例乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)HCC（HBV-HCC）患者的mtDNA進(jìn)行深度測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組織中mtDNA點(diǎn)突變類型主要為C-T替換與T-C替換兩種形式，其中C-T替換所占比例在HCC組織中高于癌旁組織，而T-C替換趨勢(shì)則相反［6］。線粒體基因組由16 569 bp組成，分為編碼區(qū)與非編碼區(qū)，其中非編碼區(qū)是點(diǎn)突變發(fā)生頻率最高的區(qū)域，主要由D-loop區(qū)組成［6］。D-loop區(qū)由1 122 bp序列組成，包含mtDNA轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的起始位點(diǎn)，因此D-loop區(qū)在mtDNA突變研究中備受關(guān)注。本課題組還分析了156例HCC組織樣本mtDNA，發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁炎癥組織中均存在大量mtDNA異質(zhì)性體細(xì)胞突變，且在癌組織和癌旁炎癥組織中D-loop區(qū)的突變密度（突變數(shù)量/突變區(qū)域長(zhǎng)度）遠(yuǎn)高于mtDNA的其他區(qū)域［6］。但在整個(gè)線粒體基因組層面，癌組織mtDNA突變密度明顯少于炎癥組織。然而，在癌組織中會(huì)積累更多的高致病性突變，且其突變平均異質(zhì)性水平明顯高于與炎癥組織，提示這些異質(zhì)性突變?cè)谕苿?dòng)HCC發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

mtDNA點(diǎn)突變與HCC惡性進(jìn)展以及患者預(yù)后也密切相關(guān)，有望成為HCC新型預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物。LIN等［7］通過一代測(cè)序鑒定了25例HCC患者癌組織mtDNA D-loop區(qū)多個(gè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)12S rRNA（MT-RNR1）基因709位堿基基因型與患者不良預(yù)后相關(guān)，當(dāng)709位為A堿基時(shí)，其基因編碼的小功能肽MOTS-c表達(dá)量明顯較709位為G堿基時(shí)低，而MOTS-c低表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致患者不良預(yù)后。WANG等［8］對(duì)59例HCC患者的92個(gè)mtDNA單核苷酸多態(tài)性（SNPs）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)位于D-loop區(qū)146位的T-C遺傳突變可能是HCC患者獨(dú)立的生存預(yù)測(cè)因子，146位等位基因?yàn)镃堿基的HCC患者術(shù)后累積存活率顯著低于146位為T堿基的患者（P=0.047）。本課題組也發(fā)現(xiàn)根據(jù)D-loop區(qū)是否包含mtDNA體細(xì)胞突變可有效預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后［6］。

1.2 片段插入缺失

除點(diǎn)突變外，mtDNA片段插入缺失也是腫瘤細(xì)胞常見的突變方式。目前已在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)超過100個(gè)mtDNA區(qū)域存在片段插入缺失，其中關(guān)于HCC片段插入的研究也不斷深入。LI等［9］通過對(duì)140例接受手術(shù)治療的HCC患者腫瘤組織mtDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，315N和315C的患者中位無腫瘤生存時(shí)間分別為12個(gè)月和15個(gè)月（P=0.016）。HCC組織細(xì)胞中常發(fā)生的短片段缺失主要為348～356位和298～306位重復(fù)序列之間的50 bp片段缺失，而這種缺失在多種類型癌組織中也同樣存在［3］。除此之外，mtDNA的4 977 bp長(zhǎng)片段缺失也是癌癥常見的突變［10］，其缺失主要發(fā)生在8 470～8 482位和13 447～13 459位兩個(gè)重復(fù)序列之間，包含了7個(gè)氧化磷酸化亞基編碼基因（ATP6、ATP8、COXIII、ND3、ND4L、ND4、ND5）和 5 個(gè) mtRNA編碼基因，因此該片段的缺失會(huì)嚴(yán)重影響線粒體的正常功能。在HCC中，近年已有研究報(bào)道，與正常人相比HCC患者的4 977 bp缺失發(fā)生頻率明顯增高（P＜0.05）［11］。但是，YIN等［12］在檢測(cè)18例HCC患者癌組織及其癌旁組織D-loop區(qū)序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)癌旁組織中4 977 bp缺失的比例遠(yuǎn)高于HCC組織，且認(rèn)為這可能是由于腫瘤細(xì)胞大量擴(kuò)增時(shí)，帶有mtDNA缺失的細(xì)胞可能存在代謝異常引起。還有研究報(bào)道，當(dāng)細(xì)胞中發(fā)生4 977 bp缺失的mtDNA比例超過一定范圍，線粒體的跨膜電位、ATP合成、線粒體呼吸鏈中多種酶的合成及氧化磷酸化過程將受嚴(yán)重影響，甚至造成呼吸鏈中斷，因此惡性腫瘤細(xì)胞在大幅度增殖過程中可能通過凋亡將這些異常細(xì)胞淘汰，從而致使發(fā)生缺失的細(xì)胞所占比例減少［13］。mtDNA片段插入缺失尤其是4 977 bp長(zhǎng)片段缺失是HCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究中的重要內(nèi)容。

2 mtDNA“量變”與HCC

2.1 腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)

線粒體基因組與核基因組不同，每個(gè)細(xì)胞中包含多個(gè)mtDNA拷貝［12］。mtDNA作為電子傳遞鏈的必要模板，其拷貝數(shù)在一定程度上決定了線粒體的氧化還原能力，因此mtDNA拷貝數(shù)與線粒體功能密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝臟組織細(xì)胞中平均含有500～2 000個(gè)mtDNA拷貝［14］。正常情況下，mtDNA拷貝數(shù)往往保持在恒定范圍內(nèi)，以維持細(xì)胞能量水平和基本功能，而在HCC患者癌細(xì)胞中常發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)變異。目前研究普遍認(rèn)為mtDNA拷貝數(shù)變異與線粒體內(nèi)膜活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多引起mtDNA氧化損傷有關(guān)。當(dāng)輕度氧化損傷時(shí)，為了代償減弱的氧化磷酸化及其他線粒體功能，mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)活性增強(qiáng)，從而引起拷貝數(shù)增加。而當(dāng)氧化損傷超過mtDNA損傷修復(fù)系統(tǒng)代償能力時(shí)，mtDNA嚴(yán)重?fù)p傷而發(fā)生廣泛突變，為了清除功能障礙的線粒體，最終觸發(fā)線粒體自噬機(jī)制，從而導(dǎo)致拷貝數(shù)減少［15］。有研究［16］發(fā)現(xiàn)HCC患者癌組織mtDNA拷貝數(shù)降低與患者預(yù)后密切相關(guān)。該研究通過分析71例HCC患者癌組織和癌旁組織mtDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67%的HCC患者癌組織mtDNA拷貝數(shù)顯著低于癌旁組織；進(jìn)一步根據(jù)癌組織與癌旁組織mtDNA拷貝數(shù)比值（≥1或＜1）分組，發(fā)現(xiàn)與高mtDNA拷貝數(shù)HCC患者相比，低mtDNA拷貝數(shù)患者更易出現(xiàn)腫瘤包膜不完整和微血管侵犯，5年生存率也更低。考慮到D-loop區(qū)域在mtDNA復(fù)制調(diào)控中的關(guān)鍵作用，本課題組［6］通過檢測(cè)156例HCC患者癌組織mtDNA，證實(shí)其mtDNA拷貝數(shù)減少與患者不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)在HCC細(xì)胞系中探索D-loop突變與mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與D-loop未突變的HCC細(xì)胞系相比，D-loop突變的HCC細(xì)胞系具有更強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力；進(jìn)一步通過過表達(dá)或敲除線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）成功建立mtDNA拷貝數(shù)增高和降低的HCC細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)mtDNA拷貝數(shù)增高的HCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力減弱，而mtDNA拷貝數(shù)降低的HCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力則增強(qiáng)。提示腫瘤組織D-loop區(qū)突變可能通過減少mtDNA拷貝數(shù)影響HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響HCC患者的預(yù)后［6］。此外，HCC患者癌組織mtDNA的D-loop區(qū)突變和mtDNA拷貝數(shù)變異往往同時(shí)發(fā)生，由此判斷D-loop區(qū)突變可能是引起mtDNA拷貝數(shù)降低的原因之一［3］。由于D-loop區(qū)作為mtDNA復(fù)制起始區(qū)域，而TFAM是維持mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)鍵物質(zhì)，因此D-loop區(qū)突變會(huì)影響TFAM對(duì)mtDNA的結(jié)合以及隨后的復(fù)制，從而導(dǎo)致mtDNA數(shù)量降低。

2.2 外周血mtDNA拷貝數(shù)

如前所述，腫瘤組織mtDNA拷貝數(shù)變異與HCC患者預(yù)后密切相關(guān)，目前越來越多的研究也證實(shí)外周血白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)具有作為HCC預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估生物標(biāo)志物的潛力。HOSSAIN等［17］發(fā)現(xiàn)，與慢性肝病患者和健康受試者相比，HCC患者外周血白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)顯著降低，而慢性肝病患者與健康受試者的白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)差異并不顯著。此外，本課題組研究［18］檢測(cè)618例HCC患者術(shù)前外周血白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)較高的患者更易復(fù)發(fā)；同時(shí)評(píng)估白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)與總生存率和無復(fù)發(fā)生存期的關(guān)系，根據(jù)mtDNA拷貝數(shù)構(gòu)建了ROC曲線，結(jié)果顯示mtDNA拷貝數(shù)值為0.98，是OS和RFS的最佳截?cái)嘀担慌c白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)低的HCC患者相比，白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)高的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分別增加約1.89倍和約1.86倍。此外，通過過表達(dá)TAFM因子誘導(dǎo)T淋巴母細(xì)胞系Jurkat和H9細(xì)胞mtDNA增高，發(fā)現(xiàn)更高的mtDNA拷貝數(shù)可通過增加ROS介導(dǎo)TGF-β1分泌，從而誘導(dǎo)Treg和NK細(xì)胞數(shù)量降低，最后導(dǎo)致HCC的預(yù)后不良。同時(shí)，聯(lián)合白細(xì)胞mtDNA含量和TNM分期預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后，發(fā)現(xiàn)TNM Ⅲ/Ⅳ期且具有高mtDNA含量的患者OS和RFS較差，而TNM Ⅰ/Ⅱ期且mtDNA含量低的患者OS和RFS較好。因此，白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)能作為TNM分期補(bǔ)充而用于評(píng)估HCC進(jìn)展。

3 mtDNA在HCC液體活檢中的應(yīng)用

液體活檢是近年來新出現(xiàn)的一種檢測(cè)技術(shù)，主要圍繞體液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)游離核酸（cfDNA和cfRNA）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白質(zhì)以及腫瘤代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)［19］。與組織活檢相比，液體活檢在無創(chuàng)、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、克服腫瘤異質(zhì)性等方面具有巨大優(yōu)勢(shì)。其中cfDNA可以分為兩大類，即游離核DNA（cfnDNA）和游離線粒體DNA（cfmtDNA）［20］。既往研究發(fā)現(xiàn)cfmtDNA在血漿中的穩(wěn)定性高于cfnDNA，因此更有利于作為生物標(biāo)志物進(jìn)行癌癥診斷與監(jiān)測(cè)［21］。也有研究報(bào)道，與乙型肝炎、丙型肝炎在內(nèi)的肝炎患者及健康人相比較，HCC對(duì)應(yīng)肝炎患者血漿中的cfmtDNA拷貝數(shù)均顯著降低。本課題組通過對(duì)HCC患者、肝炎患者以及健康人血漿cfmtDNA檢測(cè)，觀察到HCC患者血漿cfmtDNA的拷貝數(shù)明顯低于健康人和肝炎患者（P＜0.001）［5］；同時(shí)本課題組分別檢測(cè)了116例HBV-HCC患者及232例HBV肝炎患者血漿cfmtDNA，發(fā)現(xiàn)HBV-HCC組血漿cfmtDNA含量顯著低于HBV肝炎組（P=1.7×10-5）［22］；HASHAD等［23］檢測(cè)了丙型肝炎病毒相關(guān)HCC（HCV-HCC）患者、HCV相關(guān)肝硬化患者及健康人血漿cfmtDNA各45例，發(fā)現(xiàn)與HCV肝炎組和健康對(duì)照組相比，HCV-HCC組的血漿cfmtDNA含量最低（P＜0.001），HCV肝炎組和健康對(duì)照組之間無顯著差異（P=0.177）。以上研究結(jié)果顯示HCC中的mtDNA常以低拷貝數(shù)形式存在，提示血漿cfmtDNA拷貝數(shù)有望成為診斷HCC的一種潛在的新型非侵入性生物標(biāo)志物。

除血漿cfmtDNA拷貝數(shù)外，血漿cfmtDNA體細(xì)胞突變也是HCC液體活檢的重要研究方向，但如何準(zhǔn)確識(shí)別血漿中腫瘤來源的DNA突變?nèi)允茄獫{游離DNA突變應(yīng)用于腫瘤液體活檢的難點(diǎn)。本課題組［5］通過優(yōu)化的二代測(cè)序技術(shù)對(duì)5例HCC患者和10例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織、癌旁正常組織、外周血白細(xì)胞及血漿cfmtDNA進(jìn)行深度測(cè)序，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)血漿cfmtDNA中存在與癌組織來源的腫瘤特異性突變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了血漿cfmtDNA的特有突變，但仍無法判斷其具體來源，有待進(jìn)一步深入研究。因此，血漿cfmtDNA可能是診斷HCC潛在的新型非侵入性生物標(biāo)志物。

片段組學(xué)是近期液體活檢領(lǐng)域新的發(fā)展方向，主要圍繞體液中游離DNA特征進(jìn)行系統(tǒng)性檢測(cè)，包括游離DNA片段長(zhǎng)度、分布及DNA片段末端的核苷酸基序等。mtDNA片段組學(xué)的研究主要包括cfmtDNA和EV mtDNA。AN等［24］分析了16例HCC患者以及32例健康人的血漿cfmtDNA，發(fā)現(xiàn)HCC患者平均cfmtDNA長(zhǎng)度分布在109 bp左右，較健康人（142 bp）短；在HCC患者中，血漿cfmtDNA片段大小與患者的腫瘤負(fù)荷以及cfDNA濃度呈負(fù)相關(guān)。既往研究也發(fā)現(xiàn)EVs中包含游離mtDNA，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列可覆蓋整個(gè)線粒體基因組［4］。EVs是指從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑在40～1 000 nm之間。本課題組［4］利用HCC患者、肝炎患者和健康人全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行片段大小分析，發(fā)現(xiàn)以下特征：cfmtDNA的片段長(zhǎng)度集中在80 bp，而EV mtDNA的片段長(zhǎng)度集中在130 bp左右；肝炎患者EV mtDNA＞300 bp的比例顯著高于HCC患者和健康人，而HCC患者與健康人之間沒有顯著差異；與健康對(duì)照組相比，HCC和肝炎患者的EV mtDNA拷貝數(shù)顯著降低，但HCC和肝炎患者EV mtDNA拷貝數(shù)無明顯差異，這些研究結(jié)果顯示了EV mtDNA拷貝數(shù)作為HCC診斷生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。但是，目前關(guān)于HCC患者體液中的mtDNA標(biāo)志物研究仍有限，有待進(jìn)一步挖掘更具特異性的標(biāo)志物。

4 小結(jié)與展望

近年來，液體活檢技術(shù)在新型腫瘤標(biāo)志物臨床應(yīng)用中取得突破性進(jìn)展，其中圍繞體液中的核基因組ctDNA檢測(cè)發(fā)展最為迅猛，但因其在外周血中豐度低，檢測(cè)技術(shù)要求高，目前仍未有理想的臨床轉(zhuǎn)化產(chǎn)品。液體活檢正指向mtDNA的拷貝數(shù)、突變及片段組學(xué)等方面的研究，不斷為mtDNA作為HCC液體活檢腫瘤標(biāo)志物提供有力證據(jù)，使得具有高突變率、多拷貝數(shù)和檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)的mtDNA有望成為HCC更理想的液體活檢新型標(biāo)志物。因此，圍繞外周血mtDNA拷貝數(shù)變異、突變和片段組進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，可能是尋找更有效的HCC診斷、監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估新方法及新策略的重要方向。相信隨著更為精準(zhǔn)的針對(duì)mtDNA的二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的應(yīng)用，mtDNA變異在HCC中的研究將不斷深入，mtGI相關(guān)標(biāo)志物用于HCC的臨床診斷、治療評(píng)估、預(yù)后預(yù)測(cè)將成為可能。