Rho/ROCK信號通路在腫瘤中的研究進展

陳敬廉 韋昕捷 唐衛(wèi)中

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科；廣西結(jié)直腸癌臨床研究中心

Rho是Rho GTP酶主要的成員之一［1］，在肌動蛋白細胞骨架組織調(diào)節(jié)、微管動力學調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄、腫瘤轉(zhuǎn)化、細胞周期進展等生物學過程中發(fā)揮著關鍵作用［2］。Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AGC家族，是經(jīng)典的Rho下游效應分子，主要參與肌動蛋白-肌球蛋白的收縮和肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)調(diào)節(jié)［3］。活化的Rho通過結(jié)合并激活ROCK參與細胞形態(tài)發(fā)生、運動、分裂、極性、增殖、遷移和黏附等生命活動，同時在多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要影響，包括心血管疾?。?］、呼吸系統(tǒng)疾病［5］、腎臟疾?。?］、血液系統(tǒng)疾?。?］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］及自身免疫性疾病［9］等。目前越來越多的研究指出，Rho/ROCK信號通路也積極參與腫瘤惡性生物學行為的調(diào)節(jié)和腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的塑造［10-11］。本文就Rho/ROCK信號通路在腫瘤及腫瘤微環(huán)境中的相關研究進展作一綜述，為后續(xù)作用機制的挖掘及腫瘤治療新靶點的開發(fā)提供思路。

1 Rho/ROCK信號通路概述

Rho GTP酶是Ras超家族中的重要組成部分，目前主要包括3個亞家族，即Rho（RhoA、RhoB和RhoC）、Rac（Rac1、Rac2和Rac3）和Cdc42（Cdc42Hs和G25K）［12］。Rho可與GTP結(jié)合后活化，繼而活化下游分子，當結(jié)合的GTP水解成為GDP時，則重新成為非活化狀態(tài)，這種動態(tài)平衡受鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）、GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，GAP）和鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑（guanine nucleotide dissociation inhibitor，GDI）調(diào)節(jié)［13］。此外，Rho也受翻譯后修飾的調(diào)控，如磷酸化、泛素化和SUMO化［14］。ROCK包含ROCK1（又稱為ROCKβ或p160-ROCK）和ROCK2（又稱為ROCKα或p164-ROCK）兩種亞型，分別位于18號染色體（18q11.1）和2號染色體（2p24）。ROCK蛋白結(jié)構(gòu)包括5個結(jié)構(gòu)域，其中1個含有激酶結(jié)構(gòu)域、1個含有Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、1個含有富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域（CBD）的PH（pleckstrin-homology）結(jié)構(gòu)域［15］。Rho GTP與RBD的結(jié)合改變了抑制性折疊結(jié)構(gòu)，有助于釋放激酶結(jié)構(gòu)域，導致ROCK的激活［16］。ROCK在多種組織中表達，包括肺、肝、脾、腎、腦、心臟和睪丸等［17］，并在不同的亞細胞結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用［18-19］。除了作用于細胞骨架和細胞調(diào)亡、生長、遷移、代謝等細胞生物學行為，ROCK本身作為激酶還可以通過磷酸化下游分子來調(diào)節(jié)細胞功能［20-21］。Rho/ROCK信號通路積極參與生理和病理過程，在腫瘤中的作用主要體現(xiàn)在對腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、遷移及TME的塑造方面，其在腫瘤中的調(diào)控作用及相關機制見圖1。

圖1 Rho/ROCK信號通路在腫瘤中的調(diào)控作用及機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the regulatory role and mechanism of Rho/ROCK signaling pathway in tumors

2 Rho/ROCK信號通路調(diào)控腫瘤

2.1 Rho/ROCK信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控

Rho/ROCK信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是學界關注的焦點之一。有充分證據(jù)表明，正常細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞歸根結(jié)底是細胞信號調(diào)控機制發(fā)生紊亂造成。腫瘤在形成的過程中存在異常的信號轉(zhuǎn)導，且信號轉(zhuǎn)導異常對腫瘤的發(fā)生是必要的。目前研究顯示腫瘤中存在Rho/ROCK的過度表達和過度激活，而近年來不少研究聚焦Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導異常如何調(diào)控腫瘤進展。例如，ROCK1蛋白在乳腺癌［22］、小細胞肺癌［23］、骨肉瘤［24］等腫瘤中的表達水平較癌旁組織異常增高，在肝細胞癌［25］、結(jié)腸癌［26］、膀胱癌［11］等腫瘤中ROCK2表達水平較正常組織增高，其功能是產(chǎn)生及維持腫瘤的惡性表型。ROCK蛋白在腫瘤組織中高表達可導致ROCK信號在腫瘤中過度激活，進而活化下游的信號級聯(lián)通路，從而作用于靶細胞，促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。腫瘤組織中ROCK異常表達也與腫瘤的不良預后密切相關，如乳腺癌中ROCK1過度表達與腫瘤分級的提高和總生存率的降低有關［22］；骨肉瘤中ROCK1過表達與總生存率降低有關［24］；膀胱癌中ROCK1過表達與患者不良預后相關［27］。由此可見，干預腫瘤組織中ROCK蛋白的表達或可在改善不良預后方面提供新思路。

激活Rho/ROCK往往是上游信號級聯(lián)的一部分，上游信號分子又可以導致Rho/ROCK信號異常激活，進而介導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白 4（chromodomain helicase DNA binding protein 4，CHD4）通過激活RhoA/ROCK信號通路調(diào)控非小細胞肺癌細胞增殖［28］；轉(zhuǎn)膠蛋白（transgelin，TAGLN）通過RhoA/ROCK信號通路介導了卵巢癌的進展［29］；成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）融合和突變通過激活Rho/ROCK途徑而不是傳統(tǒng)的絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途徑促進肝內(nèi)膽管細胞癌的發(fā)生［30］；在彌漫性胃癌（diffuse gastric cancer，DGC）中15%～25%發(fā)現(xiàn)了RhoA突變，但這種突變對酶活性以及信號傳導的影響，在后續(xù)的機制及信號傳導研究中未得出一致看法［31］，因此該突變體參與腫瘤的具體機制仍需進一步研究。

2.2 Rho/ROCK信號通路在腫瘤侵襲和遷移中的調(diào)控

轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的主要原因之一，腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，需要細胞骨架重建的參與。研究表明，Rho/ROCK信號通路的激活在腫瘤細胞侵襲和遷移中有重要作用［17］。在多種腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等［32-38］均發(fā)現(xiàn)ROCK1高表達與其侵襲和遷移的生物學特性密切相關。CAMPBELL等［32］研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK可驅(qū)動白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）介導的肌動蛋白極化過程，并導致腫瘤轉(zhuǎn)移。TGF-β1可促進腫瘤遷移、侵襲和增殖等惡性生物學行為，而TGF-β1和ROCK1的結(jié)合可激活TGF-β1誘導的LIMK2/Cofilin磷酸化和下游應力纖維的形成［39］。在前列腺癌中，LIMK活性下調(diào)會減弱腫瘤侵襲能力，而LIMK活性增強則會導致更強的侵襲能力，從而促進細胞增殖和遷移［37］。在此基礎上，ZHANG等［40］研究發(fā)現(xiàn)ROCK1抑制劑Y-27632能通過影響上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，減少血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM），進而抑制TGF-β1誘導的腫瘤細胞遷移、侵襲和增殖能力，表明ROCK1在腫瘤侵襲和遷移中具有重要作用。除了誘導LIMK/Cofilin磷酸化外，活化的ROCK也可通過肌動蛋白細胞骨架重組發(fā)揮其在細胞遷移中的作用。在結(jié)腸癌中，肌球蛋白IB（myosin IB，MYO1B）通過激活RhoA/ROCK/FAK信號通路促進纖維肌動蛋白重排和焦點黏附增強細胞轉(zhuǎn)移能力［41］。在膠質(zhì)母細胞瘤中，芍藥苷通過降低RhoA的活性，減少ROCK1的激活，進而調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架重組，從而抑制細胞遷移和侵襲［42］。

此外，非編碼RNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但可作為信號分子在Rho/ROCK調(diào)控腫瘤侵襲、遷移過程中發(fā)揮重要作用。如CAI等［43］研究發(fā)現(xiàn)，敲除長鏈非編碼RNA（lncRNA）MALAT1顯著降低了RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白表達水平，抑制了骨肉瘤中肌動蛋白重排與細胞骨架的重塑，從而抑制了骨肉瘤細胞的遷移能力，表明MALAT1主要通過RhoA/ROCK途徑促進骨肉瘤轉(zhuǎn)移。在胃癌與膀胱癌研究中，miR-148a、miR-1280可直接靶向ROCK1的3′UTR，進而顯著抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力［44-45］。在結(jié)腸癌中，腸道微生物群代謝產(chǎn)物通過RhoA-ROCK-LIMK2途徑上調(diào)miR-192-5p從而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲［46］。綜上所述，Rho/ROCK信號通路的激活在腫瘤侵襲和遷移中的作用機制因細胞類型而不同，但其激活與腫瘤的惡性生物學行為密切相關，其作為腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點具有很好的前景。

2.3 Rho/ROCK信號通路調(diào)控TME

TME主要包括腫瘤細胞、腫瘤相關成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）、免疫細胞、周細胞、脂肪細胞、間充質(zhì)干細胞、內(nèi)皮細胞和脂肪細胞等細胞成分，以及由細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）、細胞因子、趨化因子等組成的非細胞成分。在健康狀態(tài)下，機體微環(huán)境維持正常組織的穩(wěn)態(tài)，可以抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［47-48］。在腫瘤中，微環(huán)境平衡被打破，形成的TME與癌細胞相互作用并影響疾病的進展和轉(zhuǎn)歸［49］。Rho/ROCK信號通路除了可影響腫瘤細胞的惡性生物學行為，對TME中其他細胞也有一定的調(diào)控作用。

2.3.1 Rho/ROCK信號在CAFs調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)中的作用 CAFs是一類高度異質(zhì)性的基質(zhì)細胞群，同時也是TME最重要的組成部分之一。CAFs能被腫瘤細胞分泌的因子如 TGFβ、CXCL12、IL-6、FGF-2等激活［50-53］。而活化的CAFs較正常組織成纖維細胞收縮性高，并能分泌出大量的生長因子和ECM成分，包括纖連蛋白、層黏連蛋白、骨膜蛋白、膠原蛋白、Tenascin C、Osteopontin、基質(zhì)金屬蛋白酶等［54］，從而促進腫瘤的惡性生物學行為和ECM重塑［55］。ECM的變化進一步激活CAFs，進而導致更多的ECM分泌，然后使ECM的機械剛度增強，從而形成一個正向反饋循環(huán)，最終促進腫瘤進展及致使基質(zhì)變硬。而基質(zhì)變硬可使整合素聚集，導致焦點黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和 Src激活［56］?；罨?Src又可激活ROCK1［57］，然后使肌動蛋白聚集和肌動蛋白收縮力增加，進而重塑細胞骨架，影響細胞周期、細胞極性，并進一步促進腫瘤的侵襲表型。在乳腺癌上皮細胞中，ROCK1選擇性激活蛋白激酶-R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶，進而使CAFs聚集并持續(xù)活化［58］。

2.3.2 Rho/ROCK信號通路調(diào)控TME中的免疫細胞Rho/ROCK信號通路對TME中的免疫細胞的調(diào)控主要是針對T細胞和巨噬細胞。在獲得性免疫中，T細胞是殺傷腫瘤的主要細胞。Rho/ROCK信號是T細胞通過LFA-1附著到細胞間黏附所必需的，而這是由ROCK1底物肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化和激活所介導的［59］。此外，RhoA在跨內(nèi)皮遷移中的重要作用也已被學者證實［60］。T細胞的功能受T細胞受體（T cell receptor，TCR）調(diào)節(jié)，而RhoA/ROCK信號可以影響TCR的功能。Rho功能對胸腺細胞的發(fā)育至關重要，可調(diào)節(jié)胸腺細胞的分化，進而影響T細胞的發(fā)育成熟［61］。RhoA位于前TCR復合體的下游，前TCR控制T細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn)導途徑涉及蛋白酪氨酸激酶，Rho被證實在Src激酶p56lck下游起作用，而且是激活的p56lck驅(qū)動前T細胞分化所必需的［62］。然而，對于RhoA/ROCK信號在將T細胞群極化為1型輔助性T細胞（Th1）或2型輔助性T細胞（Th2）中的作用，目前存在相互矛盾的報道。如有研究報道T細胞中RhoA的耗竭會抑制Th2分化，但不會影響Th1分化［62］。也有研究表明，RhoA可通過效應器ROCK激活TCR介導的Th1（IL-2和IFN-γ）和Th2（IL-33）細胞因子的產(chǎn)生［63］。總之，目前 RhoA/ROCK信號通路對TME中的Th1分化的影響尚未明確，因此仍需更多的研究進一步確認，這有助于闡明其是否誘導Th1分化后發(fā)揮抗腫瘤作用，并促使機體處于Th1細胞占優(yōu)勢的良好抗腫瘤狀態(tài)。

巨噬細胞是一種具有高度可塑性和多能性的免疫細胞，其根據(jù)微環(huán)境在促炎癥（M1）和抗炎癥（M2）表型之間轉(zhuǎn)化，其中在癌癥中慢性炎癥環(huán)境會引導巨噬細胞向抗炎的M2樣表型分化［64］。不同類型的腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）既能為機體提供保護，又能幫助腫瘤細胞免疫逃逸，抵抗T細胞的攻擊。如部分TAM亞群可以清除腫瘤細胞，而部分TAM則會釋放出支持腫瘤生長和誘導免疫抑制環(huán)境的介質(zhì)［65］。LITTLE 等［66］研究發(fā)現(xiàn)，M2a TAMs可協(xié)同利用VEGF和CCL-18促進乳腺癌細胞遷移和侵襲，而通過使用ROCK1抑制劑Y-27632或GSK42986A預處理可減弱VEGF/CCL-18和M2a誘導的遷移和侵襲能力。CHU等［67］研究發(fā)現(xiàn)，過表達KLF14的乳腺癌細胞中M2巨噬細胞的極化明顯減少，且KLF14可通過調(diào)節(jié)SOCS3/Rho/ROCK/STAT3信號通路抑制乳腺癌細胞的侵襲和M2巨噬細胞的極化，并減少IL-10和TGF-β等炎癥抑制因子分泌，從而減弱抗腫瘤免疫作用的抑制，進而抑制腫瘤進展。

3 Rho/ROCK信號通路在腫瘤治療中的應用

Rho/ROCK信號通路失調(diào)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲、遷移過程，在TME中也扮演著重要的角色，因此以Rho/ROCK為靶點或可為腫瘤預防、控制腫瘤進展及腫瘤治療藥物開發(fā)提供新的策略。既往研究已經(jīng)證實了Rho/ROCK抑制劑在體外和體內(nèi)癌癥模型中的治療效果，目前較為典型的ROCK抑制劑是Y-27632［68］。在體外模型中，Y-27632可抑制乳腺癌［69］、結(jié)直腸癌［70］、肝細胞癌［71］及非小細胞肺癌［72］細胞增殖，并降低乳腺癌和結(jié)直腸癌細胞的遷移能力［70，73］。在小鼠體內(nèi)模型中，Y-27632可抑制肝癌和乳腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,在小鼠肝癌模型中還可促進腫瘤細胞凋亡以及抑制MMP9的表達［71］；在乳腺腫瘤模型中也可抑制腫瘤進展，并增強CD4+和CD8+T細胞浸潤［73］。除了Y-27632，目前多種新型的高特異性小分子ROCK抑制劑也正在研發(fā)及驗證中。如體外實驗已證實法舒地爾可以有效地抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖［74］。RKI-1447可顯著抑制結(jié)直腸癌細胞生長并促進細胞凋亡，并通過細胞骨架相關的線粒體功能障礙及細胞生物能量破壞抑制結(jié)直腸癌進展；RKI-1447還可通過抑制ROCK并選擇性阻斷ROCK依賴信號傳導，抑制乳腺癌的生長、遷移和侵襲［75］。H-1152可以降低結(jié)直腸癌細胞中P38的磷酸化進而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［76］。然而，ROCK抑制劑靶向治療尚未被批準用于癌癥患者的治療，但相信在進行充分的臨床前試驗后，有望成為下一代靶向治療腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物。

4 小結(jié)與展望

Rho/ROCK信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展、腫瘤細胞的侵襲和遷移及TME的調(diào)控密切相關。目前研究顯示，腫瘤中存在Rho/ROCK過度表達和過度激活，且其異常高表達不僅可以促進腫瘤的發(fā)生，也可以調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白，重塑細胞骨架，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。除了影響腫瘤細胞的惡性生物學行為，Rho/ROCK信號通路在TME調(diào)控中也發(fā)揮著不可替代的作用，如通過在CAFs中調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)以及調(diào)控免疫細胞等促進腫瘤進展。此外，基于Rho/ROCK信號通路的作用，目前眾多學者研發(fā)了相應的靶向藥物，現(xiàn)有的ROCK抑制劑也對腫瘤進展表現(xiàn)出良好的改善作用，但這些藥物主要處于腫瘤的實驗研究階段，并未真正應用于臨床治療。因此，研發(fā)新型化合物阻斷Rho/ROCK通路中關鍵蛋白與蛋白之間的結(jié)合，或通過結(jié)構(gòu)生物學解析出ROCK蛋白關鍵結(jié)構(gòu)域并予以針對性阻斷，可能為腫瘤治療中靶向Rho/ROCK信號通路的新型抑制劑研發(fā)提供新的方案。