金水六君煎含藥血清對(duì)香煙煙霧及脂多糖誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞COPD黏液高分泌的影響*

張 鈺 李福星 柳 卓 劉 雨△ 譚光波△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 412000；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 412000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種常見(jiàn)的、可預(yù)防的疾病。據(jù)WHO預(yù)計(jì)，COPD將在2030年排名全球第3位死因［1］。慢性氣道黏液高分泌（CMH）是COPD的重要病理生理特征和臨床表現(xiàn)，近年來(lái)研究報(bào)道存在CMH的COPD患者在相同支氣管擴(kuò)張等藥物維持下較其他類型患者急性加重更加頻繁，肺功能下降更嚴(yán)重，生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，病死率更高［2-3］。

金水六君煎出自《景岳全書(shū)》，臨床上治療慢性支氣管炎及COPD咳喘痰療效滿意，藥效學(xué)研究證明能明顯增加氣管液體分泌量，促進(jìn)痰液排出［4］。COPD黏液高分泌除黏蛋白的絕對(duì)量增多外，還與黏蛋白/水鹽比例失衡有關(guān)［5-6］。前期研究表明，金水六君煎能通過(guò)下調(diào)黏蛋白MUC5AC抑制氣道黏液高分泌［7］，然而對(duì)MUC5AC蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚未進(jìn)一步探究。前期文獻(xiàn)報(bào)道EFGR、VEGF蛋白可調(diào)控MUC5AC蛋白，從而改善COPD氣道黏液高分泌［8-9］。本研究通過(guò)觀察金水六君煎對(duì)體外人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞黏蛋白MUC5AC、EGFR、VEGF表達(dá)的影響，探討金水六君煎通過(guò)調(diào)控EGFR、VEGF蛋白治療COPD氣道黏液高分泌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為BEAS-2B人支氣管上皮細(xì)胞，購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥研究院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)箱條件為37℃，二氧化碳（CO2）濃度為5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量（250±50）g，湖南省湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SYXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于溫度23～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)換氣8～12次/h的環(huán)境。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

金水六君煎，藥物組成：熟地黃15 g，當(dāng)歸6 g，半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜5片。中藥飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，加水煎煮制得生藥質(zhì)量濃度為1.5 g/mL的藥液備用。

1.4 試劑及儀器

阿奇霉素（輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10960112）；脂多糖（LPS）（碧云天，ST1470-10 mg）；常規(guī)化學(xué)試劑（上海國(guó)藥）；還原型5XSDS上樣緩沖液、1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）、10%APS、10%SDS、TEMED、PBST 緩沖液、30%Acr/Bic、電泳液緩沖液、轉(zhuǎn)膜緩沖液、10X麗春紅染液、脫脂奶粉（Abiowell，貨號(hào)AWB0004）；BSA（鹽城賽寶）；RIPA裂解液（Abiowell，貨號(hào)AWB0136）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)，貨號(hào)583794）；搖床；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；電泳儀（北京六一）；電泳槽（北京六一）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）；旋渦混合器（江蘇其林貝爾）；磁力攪拌器（雷磁）；普通冰箱（奧克斯）；電磁爐（荷蘭飛利浦）；精密pH計(jì)（雷磁）；電子天平（美國(guó)雙杰）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（勤翔）。

1.5 CSE和LPS的制備

1支香煙燃燒5 min的煙霧在注射器驅(qū)動(dòng)吸引下溶于10 mL 37℃預(yù)熱的PBS溶液中，調(diào)節(jié)pH至7.4左右，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后作為100%CSE原液，用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋成不同濃度。CSE濃度（%）=CSE原液體積÷總體積×100%。LPS用PBS溶液進(jìn)行溶解后，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后4℃?zhèn)溆?。將脂多糖溶液按?0 ng/mL濃度配制，配制完成后攪拌搖動(dòng)使液體均勻混合，過(guò)濾除菌并分裝密封放置在-20℃條件下保存?zhèn)溆?。使用前根?jù)所需濃度用高糖型DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋。

1.6 含藥血清的制備

將SD大鼠隨機(jī)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后隨機(jī)分為空白組、金水六君煎低劑量組、金水六君煎中劑量組、金水六君煎高劑量組，各6只。金水六君煎方臨床用量60 kg成人每日服用50.5 g生藥，按臨床等效量為中劑量，0.5倍等效量為低劑量，4倍等效量為高劑量。按體表面積轉(zhuǎn)換為大鼠低、中、高劑量分別為2.63、5.26、21.04g/kg，即每日灌胃給藥分別為1.75、3.5、14.03mL/kg，每天1次，灌胃前空腹6 h，連續(xù)5 d。無(wú)藥血清組大鼠每日以3.5 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)用生理鹽水灌胃。于第5日最后1次灌胃后1 h，以3%戊巴比妥鈉對(duì)SD大鼠腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，靜置2 h凝固后，以2 000 r/min離心10 min，用移液槍吸取上層清液即血清，合并同組血清，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，無(wú)菌試管分裝，置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫苊夥磸?fù)凍融。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)

人支氣管上皮細(xì)胞（BEAS-2B）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1日換液1次，按1∶2比例傳代。

1.8 細(xì)胞分組及干預(yù)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在T25培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。去原培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)24 h。去原培養(yǎng)基，以培養(yǎng)瓶為單位，分為正常對(duì)照組（加入15%空白組大鼠血清）、模型組（加入15%空白組大鼠血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、金水六君煎組（加入10%、15%、20%金水六君煎含藥血清、10%CSE和20 ng/mL LPS）、阿奇霉素組（25 mg/L阿奇霉素、10%CSE和20 ng/mL LPS），37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.8.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BEAS-2B細(xì)胞稀釋吹打成濃度為5×103/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液量為100 μL，設(shè)立空白對(duì)照孔（加培養(yǎng)基100 μL），實(shí)驗(yàn)分正常組、模型組、金水六君煎組（10%、15%、20%）、阿奇霉素組，每組復(fù)孔數(shù)為6，各組細(xì)胞均在37℃，5%CO2環(huán)境下共同孵育24 h，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔加CCK-8溶液10 μL，溫育2.5 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率=100-（正常細(xì)胞組吸光值-加藥組吸光值）÷（正常細(xì)胞組吸光值）×100%。顯微鏡下觀察各組的細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)。

1.8.2 Western blotting檢測(cè)蛋白 將2～10代的人支氣管上皮細(xì)胞分為正常組、模型組、金水六君煎組和阿奇霉素組，培養(yǎng)細(xì)胞覆蓋T25培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模型組、金水六君煎組和阿奇霉素組給予含有LPS 20 ng/mL、10%CSE的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，正常組給予正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。干預(yù)12 h后，金水六君煎組給予15%含金水六君煎大鼠血清，阿奇霉素組予阿奇霉素25 mg/L。12 h后進(jìn)行蛋白表達(dá)測(cè)定。分別將4組細(xì)胞置于RIPA裂解緩沖液中裂解，于12 000×g（4℃）離心15 min，收集上清，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，后電泳轉(zhuǎn)膜到NC膜上，封閉，孵育一抗和二抗。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組BEAS-2B細(xì)胞活性的比較

見(jiàn)圖1，表1。與正常組比較，模型組細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，含藥血清組、阿奇霉素組細(xì)胞活性顯著上升（P＜0.05）。3組含藥血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中15%含藥血清組較10%、20%含藥血清組細(xì)胞活性顯著上升（P＜0.05）。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)：正常組貼壁后形態(tài)為梭形，細(xì)胞數(shù)目較多。模型組相較于正常組數(shù)目減少，形態(tài)大多數(shù)不規(guī)則。而3組含藥血清組和阿奇霉素組相較于模型組，細(xì)胞數(shù)目多，且形態(tài)基本規(guī)則，其中15%含藥血清組細(xì)胞數(shù)目最多，且形態(tài)較為規(guī)則。阿奇霉素組細(xì)胞數(shù)量雖較15%含藥血清組多，但形態(tài)較為不規(guī)則。

表1 各組細(xì)胞活性比較（±s）

表1 各組細(xì)胞活性比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，△P＜0.05；與15%含藥血清組比較，#P＜0.05。下同。

存活率（%）2.56±0.26 1.54±0.16△2.09±0.19*#2.69±0.22*1.80±0.21*#1.80±0.23*組別正常組模型組10%含藥血清組15%含藥血清組20%含藥血清組阿奇霉素組n 6 6 6 6 6 6

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)

2.2 各組BEAS-2B細(xì)胞MUC5AC蛋白表達(dá)的比較

見(jiàn)表2，圖2。與正常組相比，模型組的MUC5AC蛋白水平顯著升高（P＜0.05），提示模型造模成功。與模型組相比，金水六君煎組、阿奇霉素組可顯著下調(diào)MUC5AC蛋白水平（P＜0.05）。與阿奇霉素組相比，金水六君煎組MUC5A蛋白水平相當(dāng)（P＞0.05）。

表2 各組BEAS-2B細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)比較（±s）

表2 各組BEAS-2B細(xì)胞黏蛋白MUC5AC表達(dá)比較（±s）

組 別n MUC5A蛋白量相對(duì)表達(dá)正常組模型組金水六君煎組阿奇霉素組6 6 6 6 0.18±0.10 0.44±0.01△0.31±0.07*0.30±0.01*

圖2 各組MUC5AC蛋白電泳條帶

2.3 各組BEAS-2B細(xì)胞EGFR、VEGF蛋白表達(dá)的比較

見(jiàn)表3，圖3。與正常組相比，模型組的EGFR、VEGF蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，金水六君煎組、阿奇霉素組可顯著下調(diào)EGFR、VEGF蛋白水平（P＜0.05）。與阿奇霉素組相比，金水六君煎組EGFR、VEGF蛋白水平相當(dāng)（P＞0.05）。

圖3 各組EGFR、VEGF蛋白電泳條帶

表3 各組BEAS-2B細(xì)胞黏蛋白EGFR、VEGF表達(dá)比較（±s）

表3 各組BEAS-2B細(xì)胞黏蛋白EGFR、VEGF表達(dá)比較（±s）

組別正常組模型組金水六君煎組阿奇霉素組n 6 6 6 6 VEGFA（45 kDa）0.17±0.04 0.39±0.08△0.24±0.04*0.25±0.01*VEGFA（25 kDa）0.16±0.01 0.37±0.04△0.23±0.01*0.26±0.01*EGFR 0.15±0.02 0.39±0.04△0.28±0.05*0.25±0.04*

3 討論

近年研究認(rèn)為氣道黏液高分泌是影響COPD病情進(jìn)展和病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［10］。近期有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，COPD臨床表型為急性加重慢支氣管炎型患者受氣道黏液分泌增加影響更嚴(yán)重，使用常規(guī)藥物維持后不能緩解［11］。中醫(yī)學(xué)多將COPD歸屬為“肺脹”“喘證”范疇?！疤?、痰、瘀”貫穿于COPD疾病始終。COPD氣道黏液高分泌的中醫(yī)藥治療以“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”理論為指導(dǎo)。金水六君煎出自《景岳全書(shū)》，主治肺腎虛寒，水泛為痰，或外受風(fēng)寒，咳嗽嘔惡多痰，喘急等證，其中二陳湯理氣燥濕化痰，當(dāng)歸、熟地黃滋肺腎陰血以治本［4，12-13］。藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)半夏提取物β-谷甾醇及金水六君煎可促進(jìn)氣管分泌，使痰液稀釋有利于痰液排出［14］。前期研究發(fā)現(xiàn)金水六君煎明顯提高COPD氣道黏液高分泌大鼠模型CAMP含量及Na-KATP酶活性，抑制氣道黏液高分泌［15］。

相關(guān)研究表明黏液糖蛋白是氣道黏液的主要成分，主要由MUC基因編碼，其中MUC5AC是氣道上皮最重要的分泌型黏蛋白，其分泌機(jī)制涉及多個(gè)信號(hào)通路［16-18］。研究表明EGFR是受體酪氨酸激酶EerbB家族成員［5，19］，能夠介導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生以及當(dāng)氣道受到IL-17、TNF-α炎性細(xì)胞刺激后，活化的EGFR將細(xì)胞外信號(hào)傳到下游信號(hào)分子，導(dǎo)致MUC合成、分泌增加。且有研究發(fā)現(xiàn)選擇性EGFR酪氨酸激酶抑制劑可以抑制杯狀細(xì)胞增生，下調(diào)MUC5AC的表達(dá)［20］。VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，相關(guān)研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可使MUC5AC上調(diào)［21］。

目前國(guó)內(nèi)外同于構(gòu)建體外COPD氣道黏液高分泌的細(xì)胞模型主要人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B、癌細(xì)胞株NCI-H292、肺腺癌細(xì)胞株A549［22-23］。研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建COPD氣道黏液高分泌細(xì)模型，人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B具有特異性［24］。香煙煙霧和脂多糖可誘導(dǎo)氣道黏液高分泌，同時(shí)可使MUC5AC表達(dá)增高［25-26］。因此本研究采用香煙煙霧和脂多糖誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞建立體外COPD氣道黏液高分泌模型。采用10%CSE和20 ng/mL誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞，同時(shí)用正常大鼠及含藥血清干預(yù)24 h，結(jié)果模型組細(xì)胞活性較正常組顯著降低，金水六君煎能夠提升細(xì)胞活性。提示香煙煙霧以及LPS構(gòu)建的模型細(xì)胞活性受損，金水六君煎可減少細(xì)胞損害。模型組MUC5AC蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高，提示香煙煙霧以及LPS誘導(dǎo)可成功建立COPD氣道黏液高分泌細(xì)胞模型。與模型組比較，金水六君煎組能顯著降低MUC5AC表達(dá)，提示金水六君煎在翻譯水平抑制黏蛋白MUC5AC。模型組EGFR、VEGF蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高，與模型組比較，金水六君煎組能顯著降低EGFR、VEGF蛋白表達(dá)，提示金水六君煎在翻譯水平抑制EGFR、VEGF蛋白表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，COPD氣道黏液高分泌會(huì)出現(xiàn)EGFR、VEGF蛋白的高表達(dá)，而金水六君煎能夠抑制EGFR、VEGF蛋白的表達(dá)［12-13］。

綜上所述，金水六君煎可通過(guò)抑制MUC5AC、EGFR、VEGF蛋白表達(dá)改善香煙煙霧及脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞的COPD黏液高分泌。由此推測(cè)，金水六君煎對(duì)MUC5AC蛋白的調(diào)控以及EGFR、VEGF蛋白調(diào)控呈正相關(guān)，為臨床金水六君煎治療COPD氣道黏液高分泌提供了新的理論基礎(chǔ)和思路。但金水六君煎調(diào)控黏蛋白MUC5AC與EGFR、VEGF蛋白的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。