參附注射液治療急性心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

張紫嫣 韋岳昆 傅 永 李陳星 黃代政

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

急性心力衰竭（AHF）是指由心臟功能異常導(dǎo)致的心衰癥狀和體征突然發(fā)作或迅速加重的急性綜合征。因其起病急、可危及生命、預(yù)后差、住院病死率高等特點(diǎn)，已成為臨床最嚴(yán)重常見急癥之一［1］。目前，AHF的常規(guī)治療包括血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、利尿劑、血管緊張素受體腎上腺素抑制劑、洋地黃、β受體阻滯劑等。雖然這些藥物可取得一定的治療效果，但持續(xù)成本高、療效短，醫(yī)療負(fù)擔(dān)仍然不斷增加［2］。研究表明［3］，中西醫(yī)結(jié)合治療AHF具有良好的效果。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AHF的常見證型為陽(yáng)氣虛衰、血瘀水滯。參附注射液（參附注射液）具有回陽(yáng)救逆、益氣固脫的作用，能補(bǔ)陽(yáng)固氣，增強(qiáng)心肌收縮力，保護(hù)心肌，改善血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并調(diào)節(jié)心率［4］，常用于AHF的中西醫(yī)結(jié)合急救。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，分析參附注射液主要成分，找出參附注射液和AHF的共同靶點(diǎn)，從靶點(diǎn)、生物過(guò)程、通路的角度探究參附注射液治療AHF的作用機(jī)制，為臨床和科研提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別輸入?yún)⒏阶⑸湟旱闹饕煞帧凹t參”“附子”進(jìn)行搜索，根據(jù)TCMSP網(wǎng)站上提供的信息與已發(fā)表的文獻(xiàn)［5］，設(shè)置ADME屬性值“口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（Drug likeness，DL）≥0.18”為篩選條件，搜索這兩個(gè)藥物的有效化合物。鑒于以“紅參”“附子”進(jìn)行搜索得到的結(jié)果具有匹配靶點(diǎn)較少，與疾病靶點(diǎn)的相交部分僅有9項(xiàng)，且其間相關(guān)太低，不足以建立PPI網(wǎng)絡(luò)。故本研究考慮使用“人參”替代“紅參”進(jìn)行搜索，篩選條件仍同前。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取 以“Acute heart failure”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和Therapeutic Target Database藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD數(shù)據(jù)庫(kù)，http：//db.idrblab.net/ttd/）中進(jìn)行搜索。

1.3 疾病與藥物靶點(diǎn)交集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲取到的參附注射液靶點(diǎn)和AHF靶點(diǎn)分別經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）進(jìn)行統(tǒng)一，經(jīng)Excel整理刪除重復(fù)值，得到相應(yīng)靶點(diǎn)的基因名。使用R軟件（版本4.1.3）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，利用VennDiagram包對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，得到疾病與藥物的共同靶點(diǎn)和Venn圖。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入蛋白質(zhì)互作數(shù)據(jù)庫(kù)STRING（https：//string-db.org/）設(shè)置物種為“Homo sapiens”進(jìn)行分析，構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，系統(tǒng)分析靶點(diǎn)蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系，以期了解系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的工作原理、疾病等特殊生理狀態(tài)中生物信號(hào)和能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機(jī)制及蛋白之間的功能聯(lián)系。

1.4 富集分析及可視化 使用R軟件的Cluster Profiler包、org.Hs eg.db包等對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。篩選出P-value＜0.05的結(jié)果，并使用Ggplot2包對(duì)其結(jié)果進(jìn)行可視化。分別將GO富集分析結(jié)果，包括生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）繪制成柱狀圖，將KEGG通路富集分析結(jié)果繪制成氣泡圖，以期了解參附注射液治療AHF的機(jī)制。

2 結(jié) 果

2.1 參附注射液有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)獲取 本研究在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置ADME屬性值“OB值≥30%和DL值≥0.18”為篩選條件，以“人參”和“附子”為搜索關(guān)鍵詞，篩選有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化合物后，得到有效成分24個(gè)，如表1所示。包括水黃皮素（Karanjin）、人參皂苷Rh2（Ginsenoside Rh2）、人參皂苷Rh4_qt（Ginsenoside Rh4_qt）、谷甾醇（Sitosterol）等。對(duì)應(yīng)到共計(jì)281個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化、刪除重復(fù)值等處理后得到共104個(gè)基因。

表1 參附注射液中有效成分

2.2 AHF疾病靶點(diǎn)和藥物-疾病共同靶點(diǎn)的獲取 整合在Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Acute Heart Failure”為關(guān)鍵詞搜索到的內(nèi)容，得到10 110個(gè)靶點(diǎn)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，篩選Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)中Relation score大于等于中位數(shù)的值為異常潛在靶點(diǎn)，得到5 056個(gè)靶點(diǎn)。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化后得到相應(yīng)基因共4 818個(gè)，以“Reviewed”和 Popular organisms-“Human”為篩選條件過(guò)濾掉未認(rèn)證的和非人源的基因，得到基因共4 790個(gè)。經(jīng)過(guò)Excel“刪除重復(fù)值處理”后，得到基因共4 744個(gè)。通過(guò)R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化，得到參附注射液-AHF共同靶點(diǎn)81個(gè)，如圖1所示。

圖1 參附注射液-AHF共同靶點(diǎn)Venn圖

2.3 疾病與藥物靶點(diǎn)交集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“2.2”中得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING網(wǎng)站，得到參附注射液-AHF的PPI圖，如圖2所示。圖中含有80個(gè)靶點(diǎn)，和502條互作邊。其中1個(gè)節(jié)點(diǎn)表示1個(gè)共同靶點(diǎn)即蛋白，互作邊表示靶點(diǎn)間的作用關(guān)系。鑒于真核生物的可變剪切與轉(zhuǎn)錄后修飾，1個(gè)蛋白編碼基因可能會(huì)產(chǎn)生出多個(gè)蛋白，PPI圖上將由同一個(gè)基因產(chǎn)生的不同isoform進(jìn)行了合并，在節(jié)點(diǎn)上標(biāo)記的字母實(shí)際為編碼該蛋白的基因名。PPI圖上互作邊中，各色連線分別表示連接的兩者關(guān)系如下：綠色——在彼此的基因組鄰域中經(jīng)常觀察到的關(guān)系；紅色——融合關(guān)系；藍(lán)色——同現(xiàn)關(guān)系；黃色——文本挖掘關(guān)系；黑色——共表達(dá)關(guān)系；紫色——同源蛋白質(zhì)；湖藍(lán)色連線——來(lái)自精選數(shù)據(jù)庫(kù)的關(guān)系；粉紫色——經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的關(guān)系。越是處在PPI中心區(qū)域、與其他節(jié)點(diǎn)互作邊越多的靶點(diǎn)，其在疾病中的重要性越高。導(dǎo)出結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各個(gè)靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)數(shù)，得到連接節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的前10位是AKT1（與44個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、TNF（與41個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、IL-1β（與36個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、PTGS2（與34個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、PPARG（與33個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、CASP3（與30個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、NOS3（與26個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、HMOX1（與25個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、ICAM1（與24個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）、RELA（與23個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)）。筆者推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是參附注射液治療AHF的核心靶點(diǎn)。

圖2 參附注射液-AHF PPI圖

2.4 富集分析結(jié)果及可視化 使用R軟件的clusterprofiler包和org.Hs.eg.db包，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。刪除結(jié)果中P值＞0.05的部分，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果BP 315個(gè)，CC 46個(gè)，MF 76個(gè)，KEGG 118條通路。根據(jù)GO分析的結(jié)果中富集到的基因數(shù)（Counts）從大到小排序，選擇BP、CC、MF各組的前10個(gè)結(jié)果，使用Ggplot2包進(jìn)行可視化作柱狀圖，如圖3所示。其中與AHF最為相關(guān)的生物過(guò)程為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、RNA聚合酶IF啟動(dòng)子（RNA polymerase if promoter）、正向調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄（Positive regulation，of transcription from）、藥物反應(yīng)（Response to drug）；最為相關(guān)的細(xì)胞成分為質(zhì)膜（Plasma membrane）、胞漿（Cytosol）、胞質(zhì)（Cytoplasm）、膜整體組分（Integral component of membrane）；最為相關(guān)的分子功能為蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（Identical protein binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）、蛋白質(zhì)同聚活性（Protein homodimerization activity）。

圖3 GO富集分析結(jié)果

在KEGG分析的結(jié)果中，篩選出P值＜0.05的結(jié)果，并按照P值從小到大排序，選擇前20的值進(jìn)行可視化作氣泡圖，如圖4所示。共同靶點(diǎn)主要富集于腫瘤通路（Pathways in cancer）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、cGMP-PKG信號(hào)通路（cGMP-PKG sig-naling pathway）、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、C型凝集素受體信號(hào)通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、NF-κB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）等相關(guān)信號(hào)通路，同時(shí)與脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis）、甲型流感（Influenza A）、弓形蟲?。═oxoplasmosis）、肺結(jié)核（Tuberculosis）、麻疹（Measles）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）、小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer）、化學(xué)致癌-受體激活（Chemical carcinogenesisreceptor activation）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）等疾病存在關(guān)系。

圖4 KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討 論

AHF為臨床最常見的急危重癥之一，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重危害生命安全，其主要病因和致病機(jī)制為血流動(dòng)力學(xué)障礙。本癥急救藥物應(yīng)用以強(qiáng)心、利尿、糾正血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài)、針對(duì)病因治療為主，中西醫(yī)結(jié)合有更好的療效。中藥注射劑與傳統(tǒng)中藥湯劑相比，其有效成分可以通過(guò)靜脈注射的方式直接注入血液，藥物不會(huì)被消化系統(tǒng)代謝，從而保證有足夠的有效成分發(fā)揮作用。研究表明，參附注射液主要有效成分為烏頭類生物堿和人參皂苷［6-8］，具有強(qiáng)心作用，可增加心排出量、改善心肌缺血狀況；在提高平均動(dòng)脈血壓、正?；穆省⑶宄迦樗?、降低死亡率方面比傳統(tǒng)的治療方法更高效［9］。參附注射液還具有清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答等多種作用［10-11］。因此，參附注射液在20世紀(jì)90年代即被列為“全國(guó)中醫(yī)醫(yī)院急診科室必備中成藥”，在AHF的防治方面發(fā)揮了良好作用，進(jìn)一步探尋其作用機(jī)制很有必要。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究參附注射液對(duì)AHF的作用機(jī)制。通過(guò)TCMSP篩選出參附注射液對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的有效成分24個(gè)，包括穿心蓮內(nèi)酯、豆甾醇、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、人參二醇、人參皂苷-Rh4_qt等。藥理學(xué)研究［12-13］表明，人參皂苷的作用有：1）改善缺血心肌代謝、增強(qiáng)心肌收縮力、增加心排出量；2）清除自由基、保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)；3）阻滯細(xì)胞膜鈣離子通道，減少鈣離子超載，從而減輕心肌損傷；4）增強(qiáng)前列腺素的合成和釋放，改善微循環(huán)與冠脈血流。豆甾醇可以降低氧化應(yīng)激［14］。山柰酚可以導(dǎo)致膜超極化，達(dá)到擴(kuò)張血管的作用［15］。穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制糖酵解，恢復(fù)線粒體氧化磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞氧化供能［16］。β-谷甾醇具有較強(qiáng)的清除活性氧自由基能力［17］。這些藥物有效成分的生物功能均與AHF機(jī)制相關(guān)，筆者由此推斷這些有效成分可以共同作用于AHF，起到治療作用。

通過(guò)對(duì)參附注射液的24個(gè)有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)和AHF的靶點(diǎn)取交集和篩選處理后，得到81個(gè)參附注射液-AHF共同靶點(diǎn)。利用STRING工具構(gòu)造PPI圖，得到與其他蛋白互作最多的前10位是Akt1、TNF、IL1B、PTGS2、PPARG、CASP3、NOS3、HMOX1、ICAM1、RELA。將以上結(jié)果在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)網(wǎng)（https：//www.360zhyx.com/）上進(jìn)行搜索，得到結(jié)果如下：AKT1調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程，包括代謝、增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和抗細(xì)胞凋亡；同樣參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的還有CASP3、PTGS2、RELA、IL-1β；參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的還有TNF、NOS3；參與氧化還原的還有PPARG、HMOX1、PTGS2。這些靶點(diǎn)所參與心肌活動(dòng)關(guān)系密切，由此筆者推測(cè)參附注射液通過(guò)作用于以上靶點(diǎn)，達(dá)到對(duì)AHF的治療作用。

通過(guò)對(duì)GO富集結(jié)果分析，可知“2.4”所得到的生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能結(jié)果均與心肌做功相關(guān)，筆者推測(cè)這些結(jié)果可能會(huì)對(duì)血流動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生影響，與AHF的疾病機(jī)制密切相關(guān)。通過(guò)分析KEGG結(jié)果，可知共同靶點(diǎn)主要富集于鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等相關(guān)信號(hào)通路。心肌屬于平滑肌，鈣是影響平滑肌收縮功能的重要因素，由此可知鈣信號(hào)通路與AHF密切相關(guān)。研究表明，cGMP-PKG信號(hào)通路在臨床上是保留射血分?jǐn)?shù)心衰的一個(gè)治療靶點(diǎn)，激活cGMP-PKG轉(zhuǎn)導(dǎo)在動(dòng)物模型中有心臟保護(hù)作用［18］。TNF信號(hào)通路受競(jìng)爭(zhēng)性的泛素結(jié)合和去泛素化控制，從而控制蛋白酶體降解和去泛素化［19］。C型凝集素受體信號(hào)通路參與免疫應(yīng)答［20］。NF-κB通路對(duì)涉及的各種外部刺激作出炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和生存活動(dòng)［21］。IL-17信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用［22］。筆者推測(cè)參附注射液通過(guò)對(duì)以上通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高AHF心肌做功，從而改善患者的血流動(dòng)力，以達(dá)到對(duì)AHF的臨床救治效果。

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討參附注射液治療AHF的作用機(jī)制，認(rèn)為參附注射液的有效成分可對(duì)AHF疾病靶點(diǎn)進(jìn)行代謝、增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和抗細(xì)胞凋亡生理活動(dòng)調(diào)節(jié)，具有改善缺血心肌代謝、增強(qiáng)心肌收縮力、增加心排出量、清除自由基、保護(hù)心肌超微結(jié)構(gòu)、減輕心肌損傷、改善微循環(huán)與冠脈血流、降低氧化應(yīng)激、擴(kuò)張血管作用、促進(jìn)細(xì)胞氧化供能、清除活性氧自由基等能力。綜上所述，參附注射液對(duì)AHF的治療有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特征。

本研究的不足之處是，鑒于臨床上AHF主要表現(xiàn)為中醫(yī)學(xué)之“陽(yáng)氣虛衰、血瘀水?！弊C，其他證型不多，故僅從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度整體探尋參附注射液對(duì)AHF的作用機(jī)制，未對(duì)AHF進(jìn)行辨證分型、討論。為了更深入研究參附注射液對(duì)AHF的作用機(jī)制，筆者考慮下一步將對(duì)AHF進(jìn)行辨證論治，使用的不同藥物進(jìn)行中醫(yī)復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，為臨床工作和科學(xué)研究提供參考。