冬凌草重金屬·冬凌草甲素及浸出物的時(shí)空動(dòng)態(tài)分布研究

馬宏亮，黃燕俊，王吉文，胡倩倩，楊聯(lián)林

(1.中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東中山 528437；2.中藥破壁飲片國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東中山 528437)

冬凌草為唇形科植物碎米椏[Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara]的干燥地上部分，分布于我國(guó)黃河、長(zhǎng)江流域，其味苦、甘，性微寒，具有清熱解毒、活血止痛的功效[1-2]，用于治療咽喉腫痛、癥瘕痞塊等。冬凌草的主要藥效成分之一是冬凌草甲素，現(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明冬凌草甲素具有明顯的抗癌抗腫瘤作用[3-4]。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)藥材的安全性越來(lái)越關(guān)注，特別是外源性重金屬超標(biāo)問(wèn)題，葉國(guó)華[5]研究指出重金屬超標(biāo)已經(jīng)成為制約進(jìn)出口的主要因素。目前文獻(xiàn)研究[6]及調(diào)查檢測(cè)發(fā)現(xiàn)冬凌草重金屬鉛含量超過(guò)5 mg/kg的現(xiàn)象比較多，因此，研究解決重金屬含量較高的問(wèn)題是保證冬凌草質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)之一。采收期是影響中藥質(zhì)量的重要因素之一，其對(duì)藥用植物重金屬的吸收富集也有重要影響[7]。但目前的文獻(xiàn)都是以研究采收期對(duì)冬凌草主要化學(xué)成分的影響為主[8-11]，而采收期對(duì)冬凌草重金屬的動(dòng)態(tài)富集規(guī)律研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者研究重金屬鉛(Pb)、鎘(Cd)、冬凌草甲素、浸出物在不同采收時(shí)間及不同部位的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，以期為確定冬凌草的最佳采收期、保證冬凌草質(zhì)量的安全性與有效性提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣品新鮮冬凌草供試品均采自位于河南省的中智冬凌草種植基地試驗(yàn)田，于2018年采集不同生長(zhǎng)期的冬凌草樣品，采摘時(shí)間分別為7月12日、8月15日、9月22日、10月25日、11月15日。所有樣品均在09：00—11：00采收，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別采集3個(gè)平行樣品，采集時(shí)多點(diǎn)隨機(jī)割取植株，每個(gè)平行樣品采集量約為3 kg。采集后趁鮮將每份樣品快速分成3等份，1份為全株，其他2份進(jìn)行莖葉分開(kāi)(分成葉片部位和莖枝部位)，稱鮮重。然后在65 ℃烘干至恒重，再分別稱量干重。所有樣品經(jīng)由中山市中智藥業(yè)集團(tuán)有限公司馬宏亮高級(jí)工程師鑒定為唇形科植物冬凌草[Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara]。

1.2 儀器iCAP-Q 型電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Mars6型微波消解儀(美國(guó)CEM公司)；BHW-09C 型恒溫加熱器(北京恒奧德儀器儀表有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)技術(shù)儀器有限公司)；電子分析天平(美國(guó)METTLER TOLEDO公司)；超高效液相色譜儀(ACQUITY，美國(guó)Waters公司)；色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×10.0 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；超聲波清洗器(KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 藥品及試劑鎘、鉛的1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；65%硝酸(分析純，德國(guó)默克公司)；冬凌草甲素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111721-201704，純度99.7%)；乙腈(色譜純，美國(guó)賽默飛世爾公司)；無(wú)水甲醇(分析純，北京化工廠)；乙醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 重金屬Cd、Pb富集量測(cè)定

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。將原始質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL的鎘、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液臨用前稀釋為所需濃度，保證待測(cè)樣品質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，具體見(jiàn)表1。

表1 鎘、鉛的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2供試品溶液的制備。取干燥的冬凌草樣品，打粉，過(guò)四號(hào)篩，準(zhǔn)確稱取0.5 g冬凌草各部位樣品粉末，放入聚四氟乙烯消解罐中，精確加入8 mL 濃硫酸，放入恒溫加熱器中120 ℃預(yù)加熱20 min，再放入微波消解儀中，按以下程序進(jìn)行消解：10 min升至130 ℃，維持3 min；隨后3 min 升至150 ℃，維持3 min；隨后4 min升至190 ℃，維持20 min 消解。完畢后冷卻至室溫，取出放置通風(fēng)櫥內(nèi)將酸揮發(fā)盡，用超純水定容至50 mL。

2.1.3ICP-MS 條件。工作參數(shù)為正向功率1 548.6 W，冷卻氣(Ar)流量 13.86 L/min，輔助氣(Ar)流量 0.79 L/min，霧化器氣體流量 1.0 L/min；采集條件為運(yùn)行時(shí)間16 s，駐留時(shí)間 0.02 s，重復(fù)次數(shù) 3 次。

2.1.4方法學(xué)考察。冬凌草中重金屬鎘、鉛的方法學(xué)考察結(jié)果顯示，其精密度、24 h穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率的 RSD 均小于5.0%。

2.1.5樣品重金屬檢測(cè)。由圖1可知，隨著采收月份的變化，重金屬Pb、Cd的富集量也隨之變化。Pb和Cd在冬凌草不同發(fā)育時(shí)期的富集量均呈先降低后增加再隨之降低的變化趨勢(shì)。莖、葉、全株的Pb含量在8月份最低，分別為1.20、1.65、1.46 mg/kg，而在9月份含量最高，分別為2.11、3.67、3.22 mg/kg，分別是最低值的1.76、2.22、2.21倍；方差分析結(jié)果表明，9月份不同部位Pb含量與8月份比較，均存在顯著差異。同樣，莖、葉和全株Cd在8月份含量最低，分別為0.04、0.05、0.05 mg/kg，而在9月份含量最高，其最高值均為0.20 mg/kg，分別是最低值的5、4、4倍；方差分析結(jié)果表明，不同部位Cd含量在9月份與8月份之間存在顯著差異。

注：不同小寫(xiě)字母表示相同采收時(shí)間不同部位間差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示相同部位不同采收時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)

從冬凌草不同部位的分布分析，重金屬Pb含量在同一時(shí)期均呈現(xiàn)葉片>全株>莖的分布規(guī)律，其中葉片的平均富集量是莖的1.7倍；方差分析表明，在7、9、10月，葉和全株的Pb含量之間無(wú)顯著差異，但兩者都與莖的含量之間存在顯著差異；而在8、11月，Pb在各部位的含量差異都不顯著。而相同時(shí)期Cd在冬凌草不同部位的富集量無(wú)顯著差異。以上結(jié)果說(shuō)明，重金屬Pb主要富集在冬凌草葉片部位，從重金屬外源安全性角度出發(fā)，選擇在8月份采收冬凌草其安全性最高。

2.2 冬凌草甲素的含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備。取冬凌草甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含60 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備。取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，放置30 min，超聲處理(功率250 W、頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.22 μm的有機(jī)微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3HPLC檢測(cè)條件。按照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定。色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(55∶45，v∶v)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為239 nm。理論板數(shù)按冬凌草甲素峰計(jì)算不低于4 000。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2.4方法學(xué)考察。冬凌草中冬凌草甲素的方法學(xué)考察結(jié)果顯示，其精密度、24 h穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率的RSD均小于5.0%。

2.2.5冬凌草甲素的檢測(cè)。冬凌草甲素是評(píng)價(jià)冬凌草品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。由圖2可知，不同部位冬凌草甲素在不同月份的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律基本均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，但最高值和最低值出現(xiàn)的時(shí)間存在差異。在葉中，冬凌草甲素含量最高值為8月份的0.88%，最低值為7月份的0.51%，兩者差異顯著；10月份含量比9月份略上升，之后11月份又下降，但3個(gè)月份之間差異不顯著。在莖中，冬凌草甲素含量最高值為9月份的0.07%，最低為10月份的0.02%，兩者差異顯著，其他月份含量之間差異不顯著。在全株中，冬凌草甲素含量最高值出現(xiàn)在9月份，最低值出現(xiàn)在11月份，分別為0.58%、0.28%，最高值9月份與其他月份含量之間存在顯著差異，7、8、10月份的含量之間差異不顯著，7、8月份的含量均與11月份最低值差異顯著。從不同部位的分布分析結(jié)果可知，冬凌草甲素主要分布在葉上，其平均含量為0.71%，是莖中含量(0.04%)的17.75倍。方差分析表明，除7月份冬凌草甲素在葉和全株的含量之間無(wú)顯著差異外，在其他相同月份，冬凌草甲素含量在不同部位之間都存在顯著差異。

注：不同小寫(xiě)字母表示相同采收時(shí)間不同部位間差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示相同部位不同采收時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)

2.3 冬凌草浸出物的測(cè)定與分析按照醇溶性浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定，用乙醇作溶劑，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，浸出物在葉及全株中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律一致，為高—低—高—低—高的變化趨勢(shì)，而在莖中的變化趨勢(shì)為高—低—高。在葉中，浸出物在7、9和11月出現(xiàn)3個(gè)幾乎相同的峰值，其含量分別為17.3%、16.7%、17.2%，差異不顯著；而在8和10月出現(xiàn)2個(gè)幾乎相同的谷值，分別為13.0%、13.2%。在全株中，浸出物含量最高值為7月的15.4%，其次為9月的13.4%，兩者差異不顯著，最低為10月的9.5%，其與前兩者存在顯著差異。在莖中，浸出物含量最高值為7月的7.9%，但其與8、10和11月的浸出物含量差異不顯著；最低值為9月的5.1%，其與最高值之間差異顯著。浸出物同樣在葉中含量最高，其平均值為15.5%，是莖(6.8%)的2.28倍；方差分析表明，7、8月的浸出物含量在葉與全株之間無(wú)顯著差異，但兩者與莖的含量差異顯著；而在其他相同月份，浸出物含量在不同部位之間都存在顯著差異。

注：不同小寫(xiě)字母表示相同采收時(shí)間不同部位間差異顯著(P<0.05)；不同大寫(xiě)字母表示相同部位不同采收時(shí)間之間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

以全株為分析對(duì)象，通過(guò)對(duì)重金屬、冬凌草甲素、浸出物指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重金屬Pb和Cd在8月份富集量最低，而且與9月份的最高值存在顯著差異；冬凌草甲素在9月的含量最高，與8月份第二高值存在顯著差異；浸出物最高含量為7月份，其次為9月份，但兩者差異不顯著；葉中冬凌草甲素與浸出物的含量均顯著高于莖。綜合以上結(jié)果，建議冬凌草的最佳采收期為8—9月，如果產(chǎn)地環(huán)境容易造成重金屬超標(biāo)，則建議在8月份采收比較合理，可以最大程度降低重金屬污染對(duì)冬凌草造成的安全性問(wèn)題；而對(duì)于重金屬含量比較低的產(chǎn)區(qū)，建議在9月份采收，可以在保證安全的基礎(chǔ)上最大程度提高冬凌草甲素含量，保證質(zhì)量。葉片在干燥、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中極易破碎、脫落及損耗，故應(yīng)注意葉片損耗造成的品質(zhì)下降問(wèn)題，此外建議在制定冬凌草商品規(guī)格等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)控制葉的比重，以及在檢測(cè)時(shí)抽樣必須有代表性。

綜上所述，該研究首次以重金屬Pb與Cd、冬凌草甲素及浸出物為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，闡明了各項(xiàng)指標(biāo)在冬凌草不同部位、不同采收期的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，為指導(dǎo)合理采收冬凌草、保障其安全性和有效性提供科學(xué)依據(jù)。