羊肚菌細(xì)菌性病害病原菌的分離鑒定

張晨曉，趙書雪,2，曹田田，張燕嬌，郭立忠，于 浩*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266000；2.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266100)

羊肚菌(Morchellasp.)隸屬于子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Discomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。羊肚菌的菌蓋與羊肚相似，故得此名[2]。羊肚菌被視為一種營養(yǎng)價(jià)值較高的食藥用菌[3]，子實(shí)體除含有粗脂肪、粗纖維、粗蛋白及氨基酸外[4]，還包含多糖等成分，不僅可以抑制腫瘤生長、增強(qiáng)免疫力，還可以助消化[5-6]。羊肚菌越來越受人們喜愛，羊肚菌的市場需求越來越大，但羊肚菌與其他常見食用菌不同，羊肚菌作為子囊菌，因其生長環(huán)境要求嚴(yán)格，影響羊肚菌產(chǎn)量的因素諸多，目前研究者對羊肚菌的栽培了解尚不完全。Ower[7]發(fā)明了采用室內(nèi)栽培羊肚菌的專利，但2008年發(fā)現(xiàn)羊肚菌的產(chǎn)量降低，主要原因是菌種的退化及細(xì)菌的污染。

對食用菌危害較為常見的細(xì)菌種類有枯草桿菌黏液變種(Bacillussubitilisvar.mucoides)、蠟狀芽孢桿菌黏液變種(Bacilluscereusvar.mucoides)、假單孢桿菌(Pseudomonasspp.)、黃單孢桿菌(Xanthomonasspp.)和歐文氏桿菌(Erwinia.)等[8]。因室外栽培羊肚菌的環(huán)境難于控制，環(huán)境中存在多種細(xì)菌，這對羊肚菌的栽培存在威脅，對細(xì)菌而言，羊肚菌子實(shí)體生長條件溫濕度適宜，細(xì)菌可在整個(gè)羊肚菌生產(chǎn)環(huán)節(jié)影響羊肚菌的生產(chǎn)，尤其是出菇環(huán)節(jié)的細(xì)菌病害尤為明顯，直接影響羊肚菌品質(zhì)及產(chǎn)量。出菇時(shí)，羊肚菌細(xì)菌性病害主要是對子實(shí)體的侵襲，特別是遭遇高溫高濕天氣時(shí)，容易從羊肚菌子實(shí)體的菌柄與土壤交接的地方發(fā)生細(xì)菌性侵染及菌柄部位開始侵襲，被昆蟲嚼食過的受傷部位也是細(xì)菌性病害高發(fā)的地方。細(xì)菌侵染后的培養(yǎng)料和子實(shí)體會(huì)出現(xiàn)濕斑、濕腐、水漬、酸敗、黏液和腐爛等癥狀[8]。筆者從患病羊肚菌子實(shí)體中分離得到3種病原菌，通過侵染，發(fā)現(xiàn)菌株YDJ-1對羊肚菌子實(shí)體的生長存在威脅，對羊肚菌栽培過程中防御細(xì)菌性病害有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3由山東省應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室于羊肚菌患病處分離獲得，羊肚菌菌株G4由山東省應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室從甘肅省隴南市采集的野生羊肚菌菌株分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基羊肚菌G4等食用菌使用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1羊肚菌病原菌株的篩選采集及觀察。于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)羊肚菌栽培的大棚中篩選患病的羊肚菌，記錄羊肚菌的發(fā)病癥狀，收集羊肚菌患病子實(shí)體及周圍的土壤，作為樣本分離致病的病原菌。將采摘的患病羊肚菌子實(shí)體用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，用無菌水沖洗3次，剪切下大小0.5 mm2羊肚菌子實(shí)體患病部位，用顯微鏡觀察。

1.3.2羊肚菌患病部位細(xì)菌的分離純化。將羊肚菌子實(shí)體患病部位加入到離心管中，加入無菌水，振蕩培養(yǎng)30 min，稀釋涂布在LB培養(yǎng)基中，待菌落長出，觀察菌落形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等特征[9]，挑取不同菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組，擴(kuò)增16S rRNA鑒定菌株，共篩選得到3個(gè)菌株，分別標(biāo)記為YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3。

1.3.3YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3與羊肚菌G4的對峙研究。將過夜培養(yǎng)的YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3分別離心，收集菌體，將菌株的OD設(shè)定為OD6006.0，將羊肚菌G4打菌餅接種于平板中間，YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3放在與菌餅相距2 cm處，以不加細(xì)菌的為對照，觀察羊肚菌菌絲的生長狀態(tài)。

1.3.4YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3對羊肚菌G4的侵染。采摘新鮮無病害的羊肚菌子實(shí)體，在羊肚菌子實(shí)體的菌蓋、菌柄處用手術(shù)刀切割長度5 mm的傷口，取200 μL的菌液滴加在傷口處，以添加0.9%生理鹽水作為對照，每個(gè)3個(gè)重復(fù)[10-11]，將侵染后的子實(shí)體放回大棚內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每12 h觀察一次侵染結(jié)果，觀察6 d。

1.3.53株病原菌對羊肚菌不同方式的侵染。參考“1.3.4”方法將3個(gè)病原菌接種到正在生長的羊肚菌子實(shí)體上，采用2種方法進(jìn)行侵染，第一種將YDJ-1分別侵染到羊肚菌子實(shí)體菌蓋及菌柄處，第二種將YDJ-1滴加到羊肚菌子實(shí)體的周圍，觀察羊肚菌子實(shí)體的狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌患病菌株的采集與鑒定與正常生長的羊肚菌比較，發(fā)現(xiàn)一些羊肚菌菌柄發(fā)紅，不規(guī)則，輕輕捏菌柄觸感軟塌，有輕微出水現(xiàn)象，輕嗅有臭味，菌蓋較正常生長得小，采摘后，于實(shí)驗(yàn)室分離鑒定病原菌。輕捏菌柄觸感軟塌，有輕微出水現(xiàn)象，輕嗅有臭味(圖1a)，分離得到3株病原菌YDJ-1、YDJ-2、YDJ-3(圖1b)，菌株的形態(tài)特征見表1。通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)菌株YDJ-1和YDJ-2為革蘭氏陰性菌，YDJ-3為革蘭氏陽性菌。通過PCR鑒定，比對發(fā)現(xiàn)菌株YDJ-1屬于Pseudomonas(假單孢菌屬)；菌株YDJ-2屬于Buttiauxella(布丘氏菌屬)；菌株YDJ-3屬于Microbacterium(微細(xì)菌屬)。

注：a為患病羊肚菌的子實(shí)體；b為分離獲得的病原菌，1為YDJ-1菌株，2為YDJ-2菌株，3為YDJ-3菌株

表1 YDJ-1、YDJ-2和YDJ-3菌落形態(tài)特征

2.2 3株病原菌與羊肚菌的對峙情況待羊肚菌與3株病原菌共培養(yǎng)7 d后，觀察羊肚菌菌絲的生長狀況，發(fā)現(xiàn)菌株YDJ-1對羊肚菌菌絲生長有抑制作用，菌株YDJ-1與羊肚菌菌絲接觸之處，羊肚菌菌絲出現(xiàn)輕微發(fā)紅發(fā)褐的現(xiàn)象。菌株YDJ-2和YDJ-3對羊肚菌菌絲的生長無抑制作用(圖2)。

注：1為羊肚菌菌絲對照平板，2為羊肚菌菌絲與YDJ-1對峙平板，3為羊肚菌菌絲與YDJ-2對峙平板，4為羊肚菌菌絲與YDJ-3對峙平板

2.3 3株病原菌侵染羊肚菌新鮮子實(shí)體情況將3株病原菌分別接種到羊肚菌的子實(shí)體中，觀察病原菌對羊肚菌的侵染情況，發(fā)現(xiàn)菌株YDJ-1對離體羊肚菌子實(shí)體具有一定的侵染能力，被侵染的羊肚菌子實(shí)體菌柄變紅褐色，觸感發(fā)黏，輕嗅有細(xì)菌的臭味。另外2組細(xì)菌的侵染狀況與生理鹽水處理組相近(圖3)。

注：1為生理鹽水處理羊肚菌子實(shí)體，2為YDJ-1菌液處理羊肚菌子實(shí)體，3為YDJ-2菌液處理羊肚菌子實(shí)體，4為YDJ-3菌液處理羊肚菌子實(shí)體

2.4 YDJ-1菌株不同侵染方式對羊肚菌子實(shí)體的影響菌株YDJ-1對羊肚菌子實(shí)體存在致病性，采用2種方式對活體羊肚菌是否會(huì)患病進(jìn)行驗(yàn)證。采用第一種方式侵染，當(dāng)培養(yǎng)到第6天，發(fā)現(xiàn)被菌株YDJ-1的菌液侵染活體羊肚菌子實(shí)體菌蓋和菌柄的羊肚菌生長正常，未出現(xiàn)被侵染現(xiàn)象，推測可能是羊肚菌自身可以抵御外界的侵染。用YDJ-1菌液澆灌羊肚菌子實(shí)體周圍土壤，發(fā)現(xiàn)有10%羊肚菌子實(shí)體出現(xiàn)菌柄發(fā)紅、變軟等細(xì)菌病害的病癥，推測是YDJ-1侵染作用所致(圖4a-3)。繼續(xù)延長菌株的侵染時(shí)間，當(dāng)培養(yǎng)至14 d時(shí)，發(fā)現(xiàn)有40%的羊肚菌出現(xiàn)發(fā)病狀況，子實(shí)體菌柄呈紅褐色、有水漬，子實(shí)體基本不生長，均為羊肚菌幼菇；未發(fā)病的60%子實(shí)體，生長畸形、菌柄膨大(圖4b)，進(jìn)一步說明菌株YDJ-1可抑制羊肚菌的生長。

注：a-1為處理菌蓋的羊肚菌子實(shí)體，a-2為處理菌柄的羊肚菌子實(shí)體，a-3為處理菌根部土壤的羊肚菌子實(shí)體；b為培養(yǎng)14 d時(shí)處理菌根部土壤的羊肚菌子實(shí)體

3 結(jié)論

羊肚菌室外栽培受到環(huán)境中病蟲的污染，是羊肚菌減產(chǎn)的重要原因之一[12]，目前關(guān)于羊肚菌栽培過程中，真菌性病原菌報(bào)道較多，如He等[13]篩選羊肚菌白霉病的病原菌株長毛擬青霉(Paecilomycespenicillatus)，He等[14]篩選出羊肚菌蓋腐病的病原菌Diplo?sporalongispora，常見的羊肚菌重要病原菌還有鐮刀菌屬[15-16]，余苗等[10]報(bào)道了由曲霉屬真菌引起的羊肚菌白腐病，該研究通過對患病羊肚菌子實(shí)體的分離，篩選到3株細(xì)菌，通過培養(yǎng)時(shí)間及侵染方式，最終確定菌株YDJ-1(Pseudomonas)為羊肚菌的病原菌。