生物標志物與小兒燒傷膿毒癥的早期診斷*

朱悅悅，朱振洪

（蘇州大學附屬兒童醫(yī)院小兒燒傷整形外科，蘇州 215000）

膿毒癥被認為是由宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)導致的危及生命的器官功能障礙[1]。燒傷創(chuàng)面的持續(xù)開放，腸道屏障功能失調(diào)，重度燒傷患者所需的侵入性設(shè)備如中央靜脈和動脈導管，嚴重燒傷患者多處于代謝亢進及免疫抑制狀態(tài)等，這些都增加了燒傷患者潛在的感染和燒傷膿毒癥風險，小兒燒傷患者則因為代謝調(diào)節(jié)能力和免疫功能不成熟，更易受到燒傷膿毒癥的威脅[2]。隨著燒傷護理措施的改善，液體復(fù)蘇和營養(yǎng)支持水平的提高，燒傷患者的死亡原因已經(jīng)從休克轉(zhuǎn)變?yōu)槟摱景Y及其并發(fā)癥占主導地位[3]，燒傷膿毒癥的早期識別和積極干預(yù)顯得極為重要。

然而，長期暴露于炎癥介質(zhì)及亢進的代謝水平使許多膿毒癥診斷指標如發(fā)熱、心動過速、呼吸急促、白細胞增多等全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）癥狀成為燒傷群體的常見臨床表現(xiàn)，加之不同年齡段兒童生理特征的特殊性，這些傳統(tǒng)指標對小兒燒傷膿毒癥患者的早期診斷和嚴重性評估價值不高。采樣時間、方式、培養(yǎng)效率等使微生物培養(yǎng)在燒傷膿毒癥早期診斷的應(yīng)用也存在一定的局限性[4]。因此，膿毒癥標志物對于燒傷膿毒癥的早期診斷一直是國內(nèi)外研究的熱點。盡管小兒燒傷好發(fā)，但由于多為小面積燒傷，相關(guān)膿毒癥標志物對小兒燒傷患者的診斷和臨床應(yīng)用卻較為局限。

1 傳統(tǒng)膿毒癥標志物與小兒燒傷膿毒癥的早期診斷

1.1 C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）CRP 是由肝臟合成的急性時相蛋白，能結(jié)合病原體和受損細胞的磷脂成分，激活受體并活化補體系統(tǒng)發(fā)揮作用，是反映機體損傷和感染的敏感指標之一。燒傷后24 h內(nèi)患者血漿CRP 水平明顯升高，48 h 達到峰值，且CRP 水平與燒傷面積（burn surface area，BSA）呈正相關(guān)，其升高與燒傷患者感染及膿毒癥的發(fā)生有關(guān)。

B.GüLHAN 等[5]指出，火焰?zhèn)?、血漿CRP 水平＞60 mg/L 和BSA＞25%都是燒傷患兒發(fā)生膿毒癥的高危因素，與早先一項納入918 例燒傷兒童的隊列研究[6]一樣，CRP 水平與嚴重燒傷患兒BSA 呈正相關(guān)；燒傷后第2 天起，死亡組患兒血漿CRP 水平明顯高于膿毒癥存活組，即燒傷患兒血漿動態(tài)CRP 水平和死亡事件顯著相關(guān)。盡管如此，CRP 被證實在創(chuàng)傷、外科手術(shù)后、組織壞死、細菌感染及非細菌感染刺激下均可快速上升，其作為機體炎癥反應(yīng)水平指標固然有廣泛適用性，對膿毒癥的發(fā)生進行除外性診斷也有一定的可靠性，但對于燒傷患兒膿毒癥發(fā)生與非感染所致炎癥進行區(qū)分的特異性不高，且不能反映感染的嚴重程度，對燒傷膿毒癥患兒預(yù)后的判斷價值也十分有限[7]。

1.2 白細胞介素（interleukin，IL）IL-6 是一種由免疫細胞及多種相關(guān)細胞產(chǎn)生的具有多效性的細胞因子，是參與機體炎癥反應(yīng)細胞因子的核心成員，其血漿水平的急劇增高是一種危險的信號。血漿IL-6 水平在患兒燒傷發(fā)生后早期即可達到峰值，燒傷膿毒癥患兒血漿IL-6 水平明顯高于非膿毒癥燒傷患兒，此后緩慢下降至正常水平；燒傷死亡組IL-6 水平在燒傷后亦始終高于膿毒癥組，且在死亡事件發(fā)生前無下降趨勢[8-9]。表明血漿IL-6 水平對燒傷患兒膿毒癥及其嚴重性有較好的早期預(yù)警作用。

作為應(yīng)對損傷及感染的急性時相炎癥介質(zhì)，IL-8在機體受到損傷之后參與中性粒細胞的活化和組織修復(fù)機制（如細胞增殖和血管生成）以及炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。在燒傷患兒，高水平的IL-8 與燒傷膿毒癥、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）和死亡事件發(fā)生有高度相關(guān)性，許多研究[8，10]也證實了其對燒傷患兒感染的診斷效能。此外，一項納入468 例嚴重燒傷兒童60 d 內(nèi)血漿IL-8 水平走勢的前瞻性研究[11]甚至指出，血漿IL-8 水平達0.234 g/L 對燒傷患兒死亡事件預(yù)測具有最大的靈敏性和特異性。

燒傷使機體產(chǎn)生的大量細胞因子是燒傷患者SIRS 狀態(tài)產(chǎn)生的基礎(chǔ)[12]，故不少針對燒傷膿毒癥的治療如烏司他丁、血液凈化及創(chuàng)面負壓吸引和早期切痂等已經(jīng)將IL-4、IL-6、IL-8 等作為判定膿毒癥治療效果的依據(jù)。此外，血漿腫瘤壞死因子α、IL-10 等炎癥因子水平盡管在成人和小兒燒傷的不同時期均呈現(xiàn)出差異性，但對燒傷膿毒癥的早期診斷和預(yù)后評估價值尚頗有爭議[8，13]，需進一步探究。實際上，由于檢測試劑的價格較高，上述細胞因子主要用于研究，在燒傷膿毒癥早期診斷的臨床應(yīng)用尚未能普及。

1.3 降鈣素原（procalcitonin，PCT）PCT 是降鈣素的前體，生理狀態(tài)下是主要來源于甲狀腺濾泡旁細胞，由116 個氨基組成的多肽，其半衰期短（25～30 h），健康人群血清PCT 水平低。細菌感染刺激非內(nèi)分泌細胞中其編碼基因CALC-1 轉(zhuǎn)錄，從而導致PCT 產(chǎn)生增加。細菌感染事件3 h 內(nèi)PCT 水平即升高，發(fā)生膿毒癥起始的2～4 h 內(nèi)可增加甚至1 000 倍，20 h 左右達到峰值。感染得到控制后，血漿PCT 水平每天下降約50%，是目前較為經(jīng)典的膿毒癥標志物[14-15]。

由于診斷標準不統(tǒng)一，成人燒傷群體發(fā)生膿毒癥的PCT 臨界值為0.5～3 ng/mL[16-17]，近年來血漿PCT 水平在兒童燒傷群體已經(jīng)有一定的研究。入院時PCT 水平在非感染性燒傷患兒與燒傷膿毒癥患兒中存在明顯差異，且與患兒燒傷總面積大小、血培養(yǎng)陽性率、抗生素的依賴程度及重癥監(jiān)護時間明顯呈正相關(guān)。死亡組患兒PCT 水平在燒傷后迅速升高，明顯高于燒傷膿毒癥存活組并始終保持較高水平，具有優(yōu)于CRP 等其他標志物的預(yù)測價值[18]。M.F.KUNDES 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PCT＞0.5 ng/dL 對燒傷膿毒癥患兒早期診斷具有100%的靈敏性和83%的特異性。此外，PCT 對細菌性膿毒癥的發(fā)生尤為敏感，對病原體具有區(qū)分意義，且PCT 動態(tài)水平被證實在燒傷感染的治療過程中展現(xiàn)出良好的抗生素指導作用[20]?？梢?，PCT 對燒傷患兒膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及臨床治療具有良好的臨床指導意義。

2 兒童燒傷群體具有探索價值的蛋白類燒傷膿毒癥早期標志物

由于燒傷患者病理生理的復(fù)雜性，單一生物標志物難以盡早而精確判斷燒傷膿毒癥的發(fā)生及其預(yù)后，膿毒癥標志物聯(lián)合診斷能提高早期診斷的靈敏性和特異性[21]。近年研究[22]表明，下述標志物在成人燒傷群體顯示出一定的燒傷膿毒癥早期診斷和嚴重性評估價值，但在小兒燒傷群體中的研究報道尚少，進一步展開研究實屬必要。

2.1 腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM）及其前體中間片段（mid-regional proADM，MR-proADM）ADM是具有52 個氨基酸的肽，胚胎發(fā)育時期和成年時期的大多數(shù)器官、組織均表達ADM，尤其在內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞和白細胞等表達量較高，此外，在血供豐富的器官或組織，如胎盤、肺、心臟、腎上腺髓質(zhì)和脂肪組織也少量表達。但ADM 半衰期只有20 min，其MR-proADM 因更穩(wěn)定、易測量而更多被用于間接反映其血漿水平。近年來研究[23]認為血漿ADM 及其前體對膿毒癥的早期診斷率及預(yù)后評估有極大幫助，且能對不同程度器官功能障礙進行預(yù)后風險分層。血漿MR-proADM 對膿毒癥診斷具有較好的靈敏性，聯(lián)合運用血漿PCT 則可以顯著提高膿毒癥的早期診斷率[24]。昆明醫(yī)科大學魏星等[25]最早指出，燒傷膿毒癥患兒血漿pro-ADM 含量早期上升，其含量與全身炎癥反應(yīng)、靶器官損傷程度高度一致，與燒傷患兒序貫性器官衰竭估計（sequential organ failure assessment，SOFA）評分極大相關(guān)，其對于輕癥膿毒癥及部分病原體的鑒別可能要優(yōu)于PCT。由于報道尚少，ADM 及其前體在燒傷感染早期診斷的價值還有待研究證實。

2.2 CD64 中性粒細胞（neutrophil CD64，nCD64）CD64是IgG 的FC 受體之一，屬免疫球蛋白超家族成員，主要分布于單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面。nCD64 上調(diào)也一直被認為是對感染免疫反應(yīng)的早期步驟。nCD64 在燒傷患者膿毒癥組、局部感染組和非細菌感染對照組中表達依次降低且有明顯差異性，被證實比CRP 和中性粒細胞、血小板等其他血液學檢測方法具有更高的靈敏性[26-27]，表明nCD64 有望成為燒傷膿毒癥新的早期診斷標志物。盡管中性粒細胞數(shù)量和功能在不同年齡段小兒略有差異，nCD64在感染發(fā)生時的表達尚未發(fā)現(xiàn)有年齡差異性，故而在小兒燒傷患者中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

2.3 CD14 亞 型（sCD14-ST，presepsin）CD14 是脂多糖（lipopolylysaccharides，LPS）-脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）復(fù)合物的受體，可以激活炎癥級聯(lián)反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導途徑，在LPS引起的全身性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起到重要作用?？扇苄訡D14 的蛋白酶切割的產(chǎn)物sCD14-ST（soluble CD14 subtype），后來命名為presepsin，同樣被發(fā)現(xiàn)對SIRS 和膿毒癥的鑒別診斷中比CRP、PCT 等展現(xiàn)出更好的特異性和靈敏性，對革蘭陰性菌感染具有獨到的優(yōu)勢，尤其對早產(chǎn)兒膿毒癥發(fā)生的早期診斷作用已得到肯定[28-29]。已經(jīng)證實presepsin 對燒傷膿毒癥的診斷價值，在燒傷感染病原體的鑒別和抗生素使用方面也有一定的幫助，對燒傷患兒發(fā)生感染的早期診斷具有可行性。

2.4 高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）作為一類非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，高遷移率族蛋白（high mobility group protein，HMG）廣泛分布于真核生物細胞核內(nèi)，對轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA修復(fù)和核小體形成等一系列過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。內(nèi)毒素刺激等病理情況下，HMGB1 由胞核主動或被動分泌至胞外與Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 及TLR4 等結(jié)合發(fā)揮其炎癥介質(zhì)作用，在自身免疫性疾病、肝癌、膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要地位[30]。成人燒傷后7～21 d 膿毒癥組患者外周血HMGB1 水平顯著高于未并發(fā)膿毒癥組，且在傷后3～21 d，膿毒癥存活組的HMGB1 水平顯著低于死亡組[31]。除了誘導膿毒癥和MODS 的發(fā)生，HMGB1趨化中性粒細胞和單核巨噬細胞向炎癥向創(chuàng)面的遷移，有助于吞噬和清潔燒傷組織釋放的壞死組織和毒素、激活人微血管內(nèi)皮細胞，與創(chuàng)面愈合及瘢痕形成相關(guān)[32]。故盡管HMGB1 是晚期炎癥介質(zhì)，生物學功能作用機制多樣復(fù)雜，其表達量卻與燒傷膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后以及治療顯著相關(guān)，不失為一個良好的燒傷感染標志物研究方向。

3 分子類膿毒癥診斷標志物及蛋白質(zhì)和代謝組學在燒傷領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景

3.1 分子類膿毒癥標志物與燒傷膿毒癥的早期診斷 基于對膿毒癥病理生理的進一步認識和相關(guān)技術(shù)的提高，尋找更為敏感和特異的生物標志物在分子生物學領(lǐng)域取得較多發(fā)展，并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）自上世紀40 年代被發(fā)現(xiàn)可存在于機體外周血以來，后續(xù)研究[33]表明人體處于特殊狀態(tài)（如炎癥、腫瘤、妊娠等）時，外周血中cfDNA 含量急劇上升并存在點突變、DNA 甲基化及微衛(wèi)星不穩(wěn)定等基因改變。目前已廣泛應(yīng)用于腫瘤監(jiān)測、炎癥、創(chuàng)傷性、自身免疫性疾病及產(chǎn)前診斷等的病理生理評估。劉瀟等[34]證實燒傷患者cfDNA 與MODS 評分及凝血功能等生化指標顯著相關(guān)，可對燒傷患者嚴重程度及預(yù)后進行評估。

在基因組學方面，研究[35]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種與感染易感性和膿毒癥有聯(lián)系的基因組變異，大多是涉及病原菌檢測及炎癥介質(zhì)相關(guān)物質(zhì)如TLR4、TLR2及CD14 的基因多態(tài)性。其中，血漿纖溶酶原激活物抑制劑1 及CD14-159C/T 等位基因等與燒傷患者較高的膿毒癥及死亡風險有關(guān)[36-37]。

單個炎癥因子的基因表達分析在燒傷膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中受到一定的研究，IL1、IL-6、IL-8、IL-10等的基因表達被證實在燒傷膿毒癥的早期診斷及嚴重性評估方面展現(xiàn)出應(yīng)用前景[38]。此外，除DNA甲基化外，非編碼RNA 的失調(diào)、基因沉默和增強等表觀遺傳學改變也均與嚴重的炎癥和膿毒癥密切相關(guān)[39]。

3.2 蛋白質(zhì)和代謝組學的應(yīng)用價值 嚴重燒傷使機體產(chǎn)生復(fù)雜的病理生理過程，導致體液中蛋白質(zhì)和酶水平的多種變化。蛋白質(zhì)組學和代謝組學能進行高通量和大規(guī)模的蛋白質(zhì)及其他代謝物質(zhì)分析。基于高效液相色譜分離及質(zhì)譜分析等方法發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血清多種蛋白質(zhì)及其他代謝物水平的上升及下調(diào)[40]；研究[41-42]也表明蛋白質(zhì)和代謝組學相關(guān)數(shù)據(jù)可以用來區(qū)別感染性休克患者與沒有感染的SIRS反應(yīng)。故繼基因和轉(zhuǎn)錄組學之后，蛋白質(zhì)和代謝組學的興起為更具靈敏性和特異性膿毒癥標志物的鑒定提供了幫助，可能是將來開發(fā)更好的新型燒傷生物標志物的關(guān)鍵。

眾所周知，對臨床癥狀不典型、病情進展迅速急需早期診斷和干預(yù)的小兒燒傷膿毒癥群體來說，因為家長的疼惜，檢驗標本常難以獲取，更具靈敏性和特異性的診斷標志物能顯示出絕對的優(yōu)越性和適用性。盡管已經(jīng)取得長足進步，上述分子類及蛋白質(zhì)和代謝組學標志物診斷方法在小兒燒傷群體中的應(yīng)用涉足尚少，在感染和膿毒癥早期診斷的深層次機制和可行性也需要更多的探索。