樺褐孔菌液體發(fā)酵研究進展

王維靜，朱紅薇，田建霞，包緣緣，朱長俊

（嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001）

樺褐孔菌（Inonontus obliquus）本身為藥食兩用真菌，是生長在寒帶，可使樺樹發(fā)生腐蝕的木腐菌[1-2]。因其野生資源匱乏，且液體發(fā)酵也是當下一種熱門的技術(shù)，所以液體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用在樺褐孔菌上的研究廣泛。發(fā)酵產(chǎn)物含有多糖、多酚、三萜類等，研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、免疫功能等生物活性[3]。本文綜述樺褐孔菌液體發(fā)酵的方法、產(chǎn)物活性、多糖提取、應(yīng)用等，旨在為樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的進一步研究提供可靠的參考依據(jù)。

1 樺褐孔菌液體發(fā)酵方法及優(yōu)化

1.1 液體發(fā)酵方法

一般的發(fā)酵方法是將菌種接種到綜合PDA培養(yǎng)基的平板上，待菌絲長滿后，將菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度和轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)7～12 d。梁家旗等[4]人發(fā)現(xiàn)在樺褐孔菌液體發(fā)酵過程中菌絲體多糖在第6 d時含量明顯上升，在第8 d后進入平穩(wěn)下降的狀態(tài)，推測是由于發(fā)酵時間的增加，營養(yǎng)成分缺乏，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。其實驗結(jié)果與張澤生等[5]人的發(fā)酵實驗結(jié)果相符，發(fā)酵過程中，菌絲體生物量及粗多糖含量表現(xiàn)出相似的先上升后平穩(wěn)下降的趨勢。調(diào)查發(fā)現(xiàn)在其液體發(fā)酵培養(yǎng)基的專利中，主要是改變碳源、氮源物質(zhì)以及培養(yǎng)條件。

1.2 優(yōu)化方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方方面

在研究樺褐孔菌生長方面，有研究表明，葡萄糖是最佳碳源，它利于菌絲體生長、胞內(nèi)粗多糖和甾醇類化合物合成，麥芽糖是胞外粗多糖合成的最佳碳源，最佳氮源是酵母膏和蛋白胨的混合物，起始pH為5.5最適合菌絲體生長，起始pH為6.5最有利于胞內(nèi)、外粗多糖和甾醇類化合物的合成[6]。史佳寧[7]根據(jù)其培養(yǎng)基配方，確定在培養(yǎng)溫度均為28℃時，生物量最佳積累時間為6 d，胞外多糖最佳積累時間為7 d，轉(zhuǎn)速均為130 r/min，接種量均為15%。閆舒雅[8]發(fā)現(xiàn)促進菌種發(fā)酵生長的最佳碳源、氮源分別為葡萄糖和牛肉膏，最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖30 g/L、蛋白胨4 g/L、牛肉膏8 g/L，pH為7，接種量15%，發(fā)酵時間12 d，裝液量90/250 mL。韓增華等[9]人發(fā)酵優(yōu)化后的高產(chǎn)配方為麥芽糖15 g/L、葡萄糖15 g/L、豆粉 0.6 g/L、酵母膏 2 g/L、KH2PO43 mg/L、MgSO41.5 mg/L、VB110 mg/L，起始 pH 為 4，培養(yǎng) 7 d，胞內(nèi)外多糖含量分別為132.2 mg/g和11.3 mg/mL。黃偉等[10]人優(yōu)化發(fā)酵條件提高了發(fā)酵產(chǎn)物中甾體類化合物含量，其培養(yǎng)基組分為葡萄糖30 g/L、黃豆粉2.5 g/L、蛋白胨2.5 g/L、KH2PO43.0 mg/L、MgSO40.8 mg/L、CaSO40.8 mg/L，溫度為28℃，初始pH為4，接種量為15%，裝液量為100/500 mL，培養(yǎng)11 d后，最終獲得112.44 mg/L的甾體類化合物。胡曉文[11]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵的最佳碳源為廢糖蜜236.4 mL/L，最佳氮源為黃豆餅粉98.6 g/L，初始pH為6.1，溫度為26℃，發(fā)酵時間12 d，生物量可達到9.7 g/L。

1.2.2 促進劑的添加

沈夢薇等[12]人在向培養(yǎng)基中添加不同有機溶劑探討有機溶劑對發(fā)酵多酚、多糖的影響時，發(fā)現(xiàn)添加丙酮、甲苯與乙醇可顯著提高生物量，能促進胞內(nèi)多糖生成，且乙醇作為最佳添加劑可有效提高胞內(nèi)多糖的產(chǎn)率，同時也有研究發(fā)現(xiàn)添加香葉醇后，發(fā)酵過程中樺褐孔菌醇產(chǎn)量顯著增加。全麗麗[13]研究發(fā)現(xiàn)，除有機溶劑外，如植物油、脂肪酸、木質(zhì)纖維素等促進劑均對發(fā)酵多糖的產(chǎn)生有一定促進作用。陳程[14]分析誘導(dǎo)劑對液體深層發(fā)酵制備三萜類化合物的影響，發(fā)現(xiàn)MeJA是促進三萜類化合物產(chǎn)量的最佳誘導(dǎo)劑。

2 發(fā)酵產(chǎn)物的活性成分

2.1 多糖

研究表明，真菌多糖可分為子實體多糖、胞內(nèi)多糖以及胞外多糖3種，樺褐孔菌多糖是至少由10個小分子單糖構(gòu)成的高分子質(zhì)量的糖類化合物，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種作用[3]。樺褐孔菌多糖由類單糖以不同的比例組成，主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和少量的木糖、阿拉伯糖等單糖組成。徐欣等[15]人通過對樺褐孔菌發(fā)酵菌粉進行成分分析，得知菌粉中多糖及蛋白質(zhì)含量較高。

2.2 多酚

植物多酚在自然界廣泛分布，酚類是食用菌具有抗氧化作用的主要物質(zhì)，如茶多酚、生育酚、類黃酮等。多酚可以影響生物體內(nèi)結(jié)腸菌群，具有抗炎、抗糖尿病、抗病毒等活性[16]。發(fā)酵多酚是重要次生代謝產(chǎn)物之一，具有較強的抗氧化能力，可以分胞內(nèi)多酚、胞外多酚。朱金衛(wèi)等[17]人發(fā)現(xiàn)無論是樺褐孔菌胞內(nèi)還是胞外多酚均具有較強的抗氧化活性，其中胞外多酚對羥基自由基清除效果更好。

2.3 三萜類化合物

三萜類化合物由30個或27個C原子組成，是羥基后的多個異戊二烯進行首尾相連的萜類化合物。三萜類化合物作為樺褐孔菌中的重要代謝產(chǎn)物，同樣具有抗腫瘤、抗氧化等作用，三萜類化合物可通過抗有絲分裂的方式影響癌細胞的生命周期從而實現(xiàn)抗腫瘤的效果[18]。黃盼盼等[19]人對樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中的三萜的氯仿可溶部分進行正向分離，其實驗證明菌粉中含有三萜類化合物能夠有效抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性。

3 多糖的提取

3.1 胞內(nèi)多糖提取

胞內(nèi)多糖的提取常采用溶劑浸提法，主要有熱水、酸水和堿水提取法。因為熱水浸提法相較于酸水及堿水提取法更具有簡單、安全、難度低的優(yōu)點，更適合提取胞內(nèi)多糖，所以常用熱水提取多糖。潘春麗[20]通過正交試驗優(yōu)化提取條件，即水料比40∶1，提取溫度80℃，提取時間2 h，提取2次，3倍體積的75%乙醇沉淀，醇沉溫度4℃時，此時胞內(nèi)多糖提取率為59.5 mg/g。周彬[21]通過酶解加超聲波提取胞內(nèi)多糖，提取條件為料液比1∶50，酶添加量3.0%，pH自然，酶解時間75 min，超聲功率300 W，超聲時間15 min，其多糖提取率不低于7.2%。許泓瑜等[22]人根據(jù)Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，在菌粉多糖提取時的理想工藝條件為溫度83℃，提取時間2.2 h，液料比33.3∶1時，菌粉多糖的提取率達到24.57%。

3.2 胞外多糖提取

胞外多糖的提取多用水溶醇沉法，即取發(fā)酵液真空抽濾，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再加入一定體積無水乙醇，低溫過夜，離心取沉淀部分烘干后即為胞外粗多糖。王鴻艷[23]通過水溶醇沉法從發(fā)酵液中成功提取出胞外粗多糖，其平均總糖含量達17.93%，多糖含量達10.67 mg/mL。另有劉琳[24]通過微波制備提取液，再由乙醇/K2CO3雙水相體系萃取，同時提取多糖和三萜類化合物，其中多糖提取率達91.73%。

4 應(yīng)用

目前的研究展示，樺褐孔菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有提高免疫力、抗炎抗病毒、抑菌、抗腫瘤等作用，其研究范圍主要集中于人和小鼠。近年來，發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用在家禽上的研究報道在增多。有研究表明，發(fā)酵產(chǎn)物對雞生長和免疫性能有良好的增強作用，提高養(yǎng)殖存活率，在雞的日糧中添加發(fā)酵產(chǎn)物能夠有效提升雞新城疫疫苗的免疫效果等[25]。在治療糖尿病方面，二肽基肽酶IV是治療的關(guān)鍵靶點，有研究表明其氯仿提取物具有較好的DPPIV體外抑制活性[26]。馬偉平[27]實驗結(jié)果表明樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物與其子實體相比，發(fā)酵樺褐孔菌誘導(dǎo)肝癌HepG-2細胞凋亡更顯著。

5 結(jié)論與展望

樺褐孔菌發(fā)酵多糖具有良好的抗腫瘤、抗氧化、增強免疫活性等功能，目前樺褐孔菌被證實有安全性高、低毒性的特點，所以在食品和醫(yī)藥保健品產(chǎn)業(yè)的市場上具有廣泛的應(yīng)用前景[28]。我國樺褐孔菌分布少，野生資源匱乏，價格昂貴，且質(zhì)量參差不齊。而其發(fā)酵產(chǎn)物中也具有類似的作用效果，所以通過發(fā)酵的方式發(fā)揮樺褐孔菌藥用價值是一種重要的手段。目前，大多數(shù)的研究主要停留在實驗方面和藥用機理方面，在未來還有待突破。通過對發(fā)酵產(chǎn)物的深入研究與開發(fā)，不斷明確其發(fā)酵產(chǎn)物的藥用機理。相信在不久的將來，隨著多學科的交融發(fā)展，食品和醫(yī)藥行業(yè)在開發(fā)相關(guān)的樺褐孔菌保健品、藥品上會實現(xiàn)重大的突破。