北京市密云某私采金礦礦洞廢水對大型溞的急性毒性研究

李珊，王瀟逸，劉軍，張雅楠，王元鳳,2,*

1. 中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)研究院，北京 100191 2. 法庭毒物學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

冶金工業(yè)作為一項(xiàng)重要的重金屬工業(yè)項(xiàng)目，生產(chǎn)流程各成系列，產(chǎn)生的大量廢水中含有重金屬離子、劇毒氰化物、硫化物和酚等污染物質(zhì)，是污染環(huán)境的主要廢水之一。已有研究表明工業(yè)廢水和城市廢水現(xiàn)已成為了環(huán)境水體中內(nèi)分泌干擾物（EDC）的主要來源[1-3]。

根據(jù)冶金工藝的不同，冶金工業(yè)被分為鋼鐵工業(yè)和有色冶金工業(yè)。鋼鐵工業(yè)廢水中主要含有酸、堿、酚、重金屬及氰化物等有害物質(zhì)。有色冶金工業(yè)又分為火法冶金和濕法冶金2種。相對而言，濕法冶金所排放的廢水成分更為復(fù)雜且含量更高[4]，其中很多物質(zhì)的含量明顯超過了標(biāo)準(zhǔn)和工藝要求。冶金廢水中含有的氰化物、重金屬和酚等有毒物質(zhì)，會(huì)對接觸的生物造成嚴(yán)重危害，也會(huì)對環(huán)境造成不可估量的損害。廢水中的某些物質(zhì)雖無毒，但大量積聚就會(huì)對水體有害，如排入水體的有機(jī)物和無機(jī)物。有機(jī)物超標(biāo)，水體會(huì)出現(xiàn)厭氧腐??；無機(jī)物含量過高，會(huì)對水中生物有嚴(yán)重影響，含有氮磷等物質(zhì)則使水體富營養(yǎng)化，破壞生態(tài)平衡。

為了減少冶金廢水對生態(tài)環(huán)境的污染和破壞，廢水處理部門和研究人員針對不同成分的冶金廢水采用不同方法進(jìn)行處理。黃龍等[5]提出使用低溫?zé)岱ǘ塘鞒堂摪奔夹g(shù)處理氨氮廢水，并將此方法應(yīng)用到實(shí)際廢水處理環(huán)節(jié)中。此方法氨氮去除率高且能耗低，沒有二次污染，可實(shí)現(xiàn)資源循環(huán)利用。薛柯等[6]用斑馬魚胚胎、發(fā)光細(xì)菌和小鼠L929細(xì)胞3種模式生物進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，檢測了厭氧-缺氧-好氧（A2/O）處理工藝對4種行業(yè)（生活廢水、綜合廢水、化工廢水和制藥廢水）、6家廢水處理廠的總進(jìn)水和總出水的毒性效應(yīng)及毒性削減情況。結(jié)果顯示經(jīng)過處理后的總出水仍具有一定的綜合生物毒性；斑馬魚胚胎的毒性敏感程度整體最高。

大型溞（Daphniamagna）是一種常見的實(shí)驗(yàn)室模式生物，因具有對水質(zhì)敏感、個(gè)體小、生活周期短、生長快等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境中各類毒害物質(zhì)的監(jiān)測。大型溞已被證明對重金屬[7-9]、有機(jī)物[10-11]和農(nóng)藥[12-13]等多種毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏，可表征急性毒性。謝希琳[14]等通過使用脈沖暴露方式來模擬大型溞在自然環(huán)境中的暴露方式，研究了三價(jià)砷和五價(jià)砷對大型溞的急性毒性。結(jié)果顯示在多種暴露方式中，三價(jià)砷的毒性效應(yīng)均遠(yuǎn)高于五價(jià)砷；在不同脈沖暴露模式下，脈沖暴露的時(shí)間間隔越長，大型溞對砷的耐受性越強(qiáng)。楊京亞等[15]研究了大型溞及斑馬魚在含腈綸廢水中的急性毒性和遺傳毒性，并對厭氧-好氧工藝對廢水毒性的削減能力進(jìn)行了評價(jià)，發(fā)現(xiàn)腈綸廢水能使斑馬魚肝細(xì)胞中的彗星尾矩顯著性變長，造成肝細(xì)胞DNA損傷。腈綸廢水對大型溞也有明顯的急性毒性。此外，經(jīng)處理后廢水的遺傳毒性仍顯著高于陰性對照組。

本研究基于真實(shí)環(huán)境損害案件，實(shí)驗(yàn)中使用大型溞作為指示生物，對北京密云某私采金礦礦洞中發(fā)現(xiàn)的廢水進(jìn)行生物急性毒性檢測，目的是為相應(yīng)的案件審判提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 實(shí)驗(yàn)水樣

廢水樣品瓶為1 L藍(lán)色廣口玻璃瓶。樣品瓶使用前用重鉻酸鉀溶液浸泡過夜，再用自來水、蒸餾水反復(fù)沖洗，倒置晾干。為全面檢測礦洞中廢水的生物毒性，實(shí)驗(yàn)人員在礦洞廢水池中設(shè)置了5個(gè)不同位置的取樣點(diǎn)（圖1），實(shí)驗(yàn)人員于2020年11月9日進(jìn)入礦洞進(jìn)行水樣采集，將采集的水樣裝入樣品瓶，廢水應(yīng)充滿樣品瓶，防止可能含有的揮發(fā)性污染物損失。分別標(biāo)注為水樣1～5，封口膜密封后放入4 ℃車載冰箱帶回實(shí)驗(yàn)室后立即放入4 ℃冰箱備用。

圖1 水樣采集位置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of sample collection location

實(shí)驗(yàn)水樣無味，呈黃色透明狀，取回后在實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行酸堿性檢測，結(jié)果顯示上述5個(gè)水樣全部為弱堿性（pH約為9.5）。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)稀釋的水樣中含有具有揮發(fā)性的物質(zhì)，且揮發(fā)性物質(zhì)可導(dǎo)致大型溞死亡。由本實(shí)驗(yàn)背景案件信息可知，廢水由氰化法私采金礦產(chǎn)生，根據(jù)其開采工藝推斷廢水中應(yīng)含有氰根離子和金屬元素，因此依據(jù)《水質(zhì)氰化物的測定容量法和分光光度法 第二部分 異煙酸-吡唑啉酮分光光度法》（HJ 484—2009），開展了廢水中總氰化物的檢測，檢測結(jié)果如表1所示；依據(jù)《水質(zhì)65種元素的測定 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（HJ 700—2014），使用ICP-MS方法進(jìn)行金屬元素檢測，水樣中的主要金屬成分及含量如表2所示。

1.2 受試生物與培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)選用的大型溞已在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過50代以上的單克隆培養(yǎng)及馴化。大型溞以小球藻為食，實(shí)驗(yàn)過程中，每2天喂食一次，喂食濃度約為1.5～3.6×106cell·mL-1，急性活動(dòng)抑制實(shí)驗(yàn)過程中不喂食，培養(yǎng)過程中每天對新生幼溞進(jìn)行一次篩選，以保證幼溞的一致性，實(shí)驗(yàn)時(shí)在顯微鏡下挑選體型飽滿，身體健康的大型溞所產(chǎn)的出生24 h內(nèi)的幼溞進(jìn)行毒性試驗(yàn)。

大型溞在人工智能光照培養(yǎng)箱（Percival-DR-36VL, PERCIVAL科技公司，美國）中培養(yǎng)，溫度為（23±1） ℃，光暗周期為16 h L: 8 h D。大型溞養(yǎng)殖水為曝氣的自來水（曝氣時(shí)間>96 h），經(jīng)測定，該水的pH為8.0±0.2，氧氣含量≥4 mg·L-1；總有機(jī)碳<2 mg·L-1；游離氨<1 μg·L-1；游離氯<10 μg·L-1；硬度為（210±22） mg·L-1（以CaCO3計(jì)），電導(dǎo)率<4×10-2S·m-1。

表1 廢水水樣中總氰化物檢測結(jié)果Table 1 Detection results of total cyanide in sewage samples

表2 廢水水樣部分金屬元素的檢測結(jié)果Table 2 Detection results of metal elements in sewage samples （mg·L-1）

1.3 實(shí)驗(yàn)條件及方法

急性毒性實(shí)驗(yàn)參考《化學(xué)品 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)》（GB/T 21830—2008）[16]和《水質(zhì) 物質(zhì)對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—1991）[17]。

實(shí)驗(yàn)中所用養(yǎng)溞容器均為250 mL玻璃燒杯，每次使用前用洗衣粉、自來水和蒸餾水依次沖洗并經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。在每個(gè)處理后的燒杯中放置200 mL培養(yǎng)液，飼養(yǎng)20只大型溞。

將每個(gè)水樣設(shè)置8個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，對照組內(nèi)不添加水樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)組為水樣稀釋液，稀釋倍數(shù)分別為原濃度的50倍、100倍、200倍、400倍、800倍、1 600倍、3 200倍、6 400倍和12 800倍，濃度公比為2，稀釋方式為梯度稀釋。

重鉻酸鉀設(shè)置了7個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組，實(shí)驗(yàn)組濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.6和3.2 mg·L-1，濃度公比為2，這些濃度由1 g·L-1的母液稀釋為100 mg·L-1后配制而成。所有濃度均設(shè)置3個(gè)平行。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)人員需及時(shí)觀察并記錄大型溞的運(yùn)動(dòng)與死亡情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

設(shè)置了對照組，用未添加水樣的飼養(yǎng)水作為對照，此外還設(shè)置了重鉻酸鉀溶液組來驗(yàn)證大型溞的敏感性。每組實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)期間都進(jìn)行水質(zhì)測定，以分析實(shí)驗(yàn)過程中溫度、pH和溶解氧結(jié)果與實(shí)驗(yàn)前相比有無明顯差異。

2 結(jié)果（Results）

2.1 大型溞形態(tài)變化

在大型溞培養(yǎng)24 h時(shí)，對各實(shí)驗(yàn)組和對照組的形態(tài)進(jìn)行觀察并記錄。通過觀察發(fā)現(xiàn)，對照組中的大型溞能正常生長，肢體完好（圖2（a））；使用1～5號水樣直接培養(yǎng)大型溞24 h后，實(shí)驗(yàn)組的大型溞均出現(xiàn)心跳緩慢、肢體殘缺、腐爛嚴(yán)重且眼部彌散，胸肢出現(xiàn)間歇式抽動(dòng)、缺損，尾刺彎曲，較為嚴(yán)重的身體還會(huì)發(fā)生形變，發(fā)生較大的畸形變化；重鉻酸鉀溶液中培養(yǎng)24 h后，大型溞身體發(fā)生形變，但尾刺未發(fā)生彎曲，部分溞體內(nèi)有氣泡狀組織或潰爛，生命狀態(tài)與水樣處理組比相對較好，心跳頻率較快，但胸肢擺動(dòng)仍然不規(guī)律。圖2（b）～（d）展示了部分畸形或形態(tài)嚴(yán)重改變的大型溞。

圖2 對照組大型溞（a）和畸形或形態(tài)嚴(yán)重改變的大型溞（b）～（d）注：（b）大型溞的眼部彌散；（c）大型溞產(chǎn)生了嚴(yán)重形變；（d）大型溞胸肢變形嚴(yán)重，尾刺彎曲，體內(nèi)有氣泡狀組織。Fig. 2 Normal Daphnia magna in control group （a）, deformed or severe morphological changed Daphnia magna （b）～（d）Note: （b） Daphnia magna’s eyes are diffused; （c） Daphnia magna is severely deformed; （d） Daphnia magna’s thoracic limbs are severely deformed, its tail spines are bent, and there are bubble like tissues in its body.

2.2 大型溞活動(dòng)受抑制數(shù)量

對各實(shí)驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)24 h及48 h后活動(dòng)受抑制的大型溞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，5個(gè)水樣的大型溞活動(dòng)受抑制率如表3和表4所示。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大型溞在稀釋50倍的水樣中培養(yǎng)24 h時(shí)，已開始全部受抑制。當(dāng)水樣濃度稀釋倍數(shù)達(dá)到12 800時(shí)，水樣1、2、3中的大型溞完全不受抑制。

培養(yǎng)48 h后，當(dāng)水樣濃度稀釋100倍時(shí)，水樣3和水樣5中的大型溞有少部分未受抑制，隨著水樣稀釋倍數(shù)的不斷增大，抑制率明顯降低，當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到12 800時(shí)，水樣1、3、5中的大型溞完全不受抑制，能夠生存并自由活動(dòng)。

對比培養(yǎng)24 h和48 h各濃度水樣中的大型溞活動(dòng)受抑制率數(shù)據(jù)可知，水樣為同一稀釋倍數(shù)時(shí)，培養(yǎng)48 h時(shí)大型溞的活動(dòng)受抑制更明顯。

2.3 廢水水樣對大型溞的急性毒性

5個(gè)水樣的劑量-效應(yīng)曲線如圖3，經(jīng)計(jì)算可得大型溞培養(yǎng)24 h和48 h后半數(shù)被抑制時(shí)水樣的稀釋倍數(shù)，如表5所示。

表3 培養(yǎng)24 h后大型溞活動(dòng)受抑制率Table 3 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 24 h culture （%）

表4 培養(yǎng)48 h后大型溞活動(dòng)受抑制率Table 4 Inhibition rate of Daphnia magna activity after 48 h culture （%）

對比實(shí)驗(yàn)24 h和48 h數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)水樣1的稀釋倍數(shù)都相對較大，這說明水樣1的毒性相比其他4個(gè)水樣更大。培養(yǎng)48 h的稀釋倍數(shù)均大于培養(yǎng)24 h的稀釋倍數(shù)，說明隨著培養(yǎng)時(shí)間變長，廢水的毒性有不斷變大的趨勢。

表5 大型溞培養(yǎng)24 h和48 h后半數(shù)抑制時(shí)水樣稀釋倍數(shù)Table 5 Dilution ratio of sample at 50% inhibition after 24 h and 48 h culture of Daphnia magna

根據(jù)《化學(xué)品分類和標(biāo)簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》（GB 30000.28—2013）[18]中危害水生環(huán)境物質(zhì)的分類標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，48 h的甲殼綱類生物動(dòng)物的LC50≤1 mg·L-1，可認(rèn)定為急性類別Ⅰ。培養(yǎng)48 h時(shí)，1號廢水水樣中總氰化物EC50為0.07 mg·L-1，2號水樣中總氰化物EC50為0.07 mg·L-1，3號水樣中總氰化物EC50為0.59 mg·L-1，4號水樣中總氰化物EC50為0.18 mg·L-1，5號水樣中總氰化物EC50為0.45 mg·L-1，均<1 mg·L-1，故本案所有廢水水樣的急性毒性類別均為急性類別Ⅰ。

3 討論（Discussion）

筆者研究了密云某私采金礦礦洞中廢水對大型溞的急性毒性，以48 h-EC50作為判定指標(biāo)，5處水樣按毒性強(qiáng)弱排序?yàn)椋核畼?、水樣1、水樣2、水樣5和水樣3。根據(jù)取樣點(diǎn)位置，3～5號水樣均為廢水池右側(cè)區(qū)域采取，急性毒性應(yīng)相近，但結(jié)果顯示水樣4毒性差異較大，猜測這是由于廢水長時(shí)間放置，經(jīng)過了沉淀和分層過程，導(dǎo)致毒性物質(zhì)分布不均勻。

圖3 5個(gè)水樣的劑量-效應(yīng)曲線注：EC50（24 h）指培養(yǎng)24 h的大型溞半數(shù)抑制時(shí)水樣稀釋倍數(shù)；EC50（48 h）指培養(yǎng)48 h的大型溞半數(shù)抑制時(shí)水樣稀釋倍數(shù)。Fig. 3 Dose-effect curve of five samplesNote: EC50（24 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 24 h；EC50（48 h） refers to the dilution ratio of sample when half of Daphnia magna is inhibited after culture for 48 h.

水樣1取自廢水池左側(cè)較淺的區(qū)域，該位置水面面積大且深度較淺，猜測在長期放置過程中廢水中的水分蒸發(fā)較其他區(qū)域明顯，因此水樣1毒性略大。

目前關(guān)于大型溞急性毒性的研究大多以大型溞的死亡作為評價(jià)依據(jù)[19-22]，但有研究表明LC50不能有效反映環(huán)境中的污染物真實(shí)含量和毒性[10]。因此，本研究選擇了活動(dòng)抑制率和形態(tài)行為觀察2個(gè)指標(biāo)，能更直觀更靈敏地反饋水樣的生物急性毒性情況。

本研究實(shí)驗(yàn)方法參考了《化學(xué)品 溞類急性活動(dòng)抑制試驗(yàn)》（GB/T 21830—2008）和《水質(zhì) 物質(zhì)對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—91）2個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)。雖后者適用范圍中包括工業(yè)廢水，但發(fā)布日期為1991年，目前尚無更新版本；且5個(gè)廢水水樣雖成分復(fù)雜，但均為冶金過程中產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)。因此，研究人員綜合參考了上述2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)背景案件信息，實(shí)驗(yàn)中的廢水水樣為金礦采礦后的廢液，應(yīng)為多種物質(zhì)的混合物，根據(jù)工藝推斷其中應(yīng)含有大量的氰根離子和金屬元素，生物急性毒性應(yīng)為多種毒性物質(zhì)的混合效應(yīng)。最終結(jié)果無法單獨(dú)使用其中某一種物質(zhì)的EC50表示，因此采用了稀釋倍數(shù)作為替代，表示相對毒性的高低。當(dāng)大型溞半數(shù)抑制時(shí)，水樣的稀釋倍數(shù)越大，原水樣的生物毒性越大。

在《水質(zhì) 物質(zhì)對溞類急性毒性測定方法》（GB/T 13266—91）中，廢水也是經(jīng)過了與蒸餾水配比后才進(jìn)行毒性試驗(yàn)，即同樣對原水樣進(jìn)行了稀釋。為更加全面地證明本研究中廢水水樣的生物毒性，研究人員對水樣中的主要毒性物質(zhì)——總氰化物和重金屬進(jìn)行了檢測，并增加了培養(yǎng)24 h的結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

廢水中的總氰化物和金屬元素定量檢測結(jié)果顯示，廢水中除含有較高的總氰化物外，還有含量較高的Ag、Au、Cu、Co、Fe、K、Mg和Zn等主要金屬元素。國內(nèi)研究較多的為Zn[23-24]、Cu[24]元素對大型溞的影響，陳麗萍等[23]通過實(shí)驗(yàn)得出Cu和Zn對大型溞的48 h-EC50值分別為0.0356 mg·L-1和0.218 mg·L-1。本研究檢測結(jié)果中Cu和Zn的含量均明顯高于上述值，因此水樣中除總氰化物外其他金屬也會(huì)對大型溞的生存有影響，多種金屬的混合溶液對大型溞的毒性作用與各種金屬各自對大型溞的毒性作用之間的關(guān)系尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察對照組及重鉻酸鉀組中大型溞的活動(dòng)情況，對照組中大型溞的活動(dòng)抑制率<10%，重鉻酸鉀組的24 h-EC50值在0.6～2.1 mg·L-1范圍內(nèi)，符合規(guī)范要求，大型溞對化學(xué)品的敏感性能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)期間的水質(zhì)測定結(jié)果顯示，溫度變化<1 ℃，溶解氧結(jié)果與實(shí)驗(yàn)開始相比無明顯差異，>3 mg·L-1。因此檢測及分析結(jié)果有效可信。

本實(shí)驗(yàn)基于真實(shí)刑事案例，對于案件中的證據(jù)提供有較為嚴(yán)苛的時(shí)間要求，若采用大型溞的慢性毒性實(shí)驗(yàn)，則會(huì)延誤后續(xù)的執(zhí)法與審判。同時(shí)，本研究中急性毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已滿足相關(guān)委托部門要求，故未開展大型溞的慢性毒性實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，本研究從形態(tài)行為、活動(dòng)抑制率2個(gè)個(gè)體層次對密云私采金礦礦洞中廢水的生物急性毒性進(jìn)行了檢測。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5個(gè)采樣點(diǎn)采集的水樣均嚴(yán)重抑制了大型溞的生存及活動(dòng)，由此可知，私采金礦的行為會(huì)對自然環(huán)境產(chǎn)生極其惡劣的影響。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對金礦開采后產(chǎn)生廢水的加工和處理并嚴(yán)格管控工業(yè)廢水的私自排放。