大連近岸海域表層海水中典型人工甜味劑的濃度分布及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

岳揚(yáng)，李莉，王炫凱，王侯宇，張玉鳳，張倩，劉鷹，曲寶成,*

1. 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（大連海洋大學(xué)），大連 116023 2. 大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，大連 116023

人工甜味劑是世界上使用最廣泛的食品添加劑之一，廣泛應(yīng)用于飲料、制藥配方、動(dòng)物飼料添加劑和牙膏等領(lǐng)域[1]。我國是全球最大的人工甜味劑生產(chǎn)國及出口國，僅2018年，人工甜味劑產(chǎn)量合計(jì)約16.0萬t，其中糖精鈉（SAC）產(chǎn)量4.5萬t、甜蜜素（CYC）7.0萬t、阿斯巴甜（ASP）2.0萬t、安賽蜜（ACE）1.4萬t、三氯蔗糖（SUC）0.7萬t和紐甜（NEO）0.4萬t[2]。長(zhǎng)期以來，食用人工甜味劑被認(rèn)為是安全有益的。然而近年來的研究顯示，關(guān)于人工甜味劑的安全性和其對(duì)健康不良影響的爭(zhēng)議越來越大。Zeynep和Sifa[3]發(fā)現(xiàn)一定濃度的ACE（2.5 mg·L-1和5 mg·L-1）、ASP（2.5 mg·L-1）和SAC（1.5、2.5和5 mg·L-1）會(huì)增加人外周血淋巴細(xì)胞DNA的損傷，Soffritti等[4]通過對(duì)大鼠喂食16 000 mg·kg-1和32 000 mg·kg-1（以濕質(zhì)量計(jì)）的ASP，發(fā)現(xiàn)會(huì)增加患肺癌和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，Schiffman和Rother[5]發(fā)現(xiàn)對(duì)大鼠喂食3.3～1 mg·kg-1·d-1的SUC會(huì)改變胃腸道中的微生物組成，減少有益細(xì)菌。如今，人工甜味劑已被認(rèn)為是一種環(huán)境新污染物，所引發(fā)的生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)問題正在引起人們的關(guān)注[6]。這其中人工甜味劑的環(huán)境污染狀況始終是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)問題之一[7]。

研究表明，大多數(shù)人工甜味劑經(jīng)人體攝入后通常不參與轉(zhuǎn)化和代謝，會(huì)直接通過尿液或糞便排出體外，使其不可避免地釋放到環(huán)境中。由于該類化合物具有一定的極性，通常易溶于水，污水處理廠（WWTP）廢水、湖泊和河流等地表水及地下水中常會(huì)有典型人工甜味劑檢出[1,8-12]。瑞典環(huán)境研究署開展WWTP及相關(guān)水體中SUC污染篩查，并首次報(bào)道了WWTP和水環(huán)境中檢出的SUC，濃度范圍為1.8～10.8 μg·L-1，附近地表水中濃度范圍為0.052～3.6 μg·L-1[8]；Subedi和Kannan[9]調(diào)查了美國奧爾巴尼亞地區(qū)4種人工甜味劑在WWTP的污染狀況，發(fā)現(xiàn)ASP和SAC的去除率較高（68%和90%），而SUC和ACE的去除率較低（<2%）；Gan等[10]在中國天津自來水體中發(fā)現(xiàn)SUC、ACE、SAC和CYC的濃度分別高達(dá)0.12 μg·L-1、0.68 μg·L-1、0.10 μg·L-1和36 ng·L-1；Loos等[11]在歐洲27個(gè)國家的河流中發(fā)現(xiàn)從英國、比利時(shí)、荷蘭、法國、瑞士、西班牙和意大利采集的樣品中SUC的濃度達(dá)到1 μg·L-1，德國和東歐樣品中SUC濃度較低（<100 ng·L-1）；Morlock等[12]調(diào)查了瑞士蘇黎世地區(qū)的地下水樣品中人工甜味劑濃度，發(fā)現(xiàn)有ACE被檢出且濃度高達(dá)4.71 μg·L-1，在近年來的研究中發(fā)現(xiàn)除陸地淡水中常有人工甜味劑的污染外，來自美洲[13-14]、歐洲[15-17]和亞洲[18-19]的近岸海域中也都有多種人工甜味劑的存在，其中在美國紐約港SUC的含量高達(dá)16.2 μg·L-1[14]。盡管針對(duì)海洋環(huán)境人工甜味劑污染的研究相對(duì)較少，但這些已有的研究暗示人工甜味劑存在全球污染的可能，然而當(dāng)前針對(duì)人工甜味劑的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究卻較少。

大連位于遼寧省遼東半島南端，地處黃海、渤海之濱，是中國東部沿海重要的經(jīng)濟(jì)、貿(mào)易、港口、工業(yè)和旅游城市。本研究以大連近岸海域（黃海）作為研究區(qū)域，開展8種典型人工甜味劑的污染特征研究，以期了解人工甜味劑在大連近岸海域的發(fā)生和分布，并基于風(fēng)險(xiǎn)商（RQ）方法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境保護(hù)和生態(tài)安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑與材料

ACE、ASP、NEO、CYC、SAC、SUC、阿力甜（ALI）標(biāo)準(zhǔn)品（>98%，阿拉?。┖蛺鄣氯f甜（ADV）標(biāo)準(zhǔn)品（≥95%，Sigma-Aldrich），其相關(guān)理化性質(zhì)見表1；內(nèi)標(biāo)物SUC-d6和ACE-d4（>98%，Toronto Research Chemicals）；甲醇和乙腈（HPLC級(jí)，Spectrum）；甲酸（HPLC級(jí)，DIKMA）。

1.2 樣品采集

于2021年5月在大連近岸黃海海域采集海水樣品，采樣地點(diǎn)如圖1所示，涵蓋大連城區(qū)的海水浴場(chǎng)、海洋公園、港灣港口及市政污水排放口等地區(qū)，平均離岸距離約為300 m，主要采集表層海水（深度約50 cm），每個(gè)采樣點(diǎn)采集3份平行樣品。采集樣品儲(chǔ)存于琥珀色的聚丙乙烯瓶中，4 ℃下保存。采集的樣品使用Orion Star A329多參數(shù)分析儀（Thermo Scientific）原位測(cè)量溫度、pH、鹽度和溶解氧等參數(shù)。

1.3 樣品前處理

量取50 mL待處理的水樣，加入50 μL 1 μg·mL-1的同位素內(nèi)標(biāo)SUC-d6和ACE-d4，混勻。固相萃取小柱（200 mg，6 mL，Waters HLB，美國）先用6 mL甲醇和6 mL超純水（pH=3）進(jìn)行活化，然后將加有內(nèi)標(biāo)的待處理的水樣上樣，用6 mL超純水（pH=3）淋洗固相萃取柱，真空抽干20 min后，用6 mL的甲醇溶液洗脫分析物，并將萃取液在溫和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)至干。將干燥的殘留物用甲醇/水（V∶V=40∶60）定容至1 mL，最終提取液通過0.22 μm濾膜過濾并進(jìn)行樣品分析。

表1 8種人工甜味劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical structure and physicochemical properties of 8 kinds of artificial sweeteners

圖1 中國大連地區(qū)近海水域采樣分布圖Fig. 1 Sampling distribution map of coastal waters in Dalian, China

1.4 樣品分析

使用HPLC-MS/MS分析目標(biāo)提取物。通過Sciex QTRIP 6500+（SCIEX，美國）系統(tǒng)分離分析物。色譜柱為Waters Atlantis T3（4.6 mm×50 mm，2.7 μm，Waters，美國）；流動(dòng)相分別為0.1%甲酸水溶液（A相）和0.1%甲酸乙腈（B相），流速為0.35 mL·min-1，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。梯度洗脫程序從7% B相開始，保持0.5 min，5.5 min升至35% B相，7 min時(shí)達(dá)到95% B相，保持1 min，再用0.1 min回到初始7% B相，分析時(shí)間為12 min。串聯(lián)質(zhì)譜儀器參數(shù)：氣簾氣為241.325 kPa，碰撞氣為62.055 kPa，霧化溫度為50 ℃，霧化氣為55，輔助氣為60；噴霧電壓為-4 500 V，采用電噴霧電離源，掃描方式為正負(fù)離子掃描模式，檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)；脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)狻?/p>

1.5 質(zhì)量控制

所有玻璃器皿用自來水超聲清洗30 min，再用超純水洗3次，烘干后用二氯甲烷、丙酮和甲醇各洗2次，待溶劑揮發(fā)完全后，置于馬弗爐中于450 ℃下燒3 h，自然冷卻后取出待用。

樣品在提取前添加回收率指示物標(biāo)樣，以控制整個(gè)樣品前處理過程的回收率。同時(shí)進(jìn)行方法空白、基質(zhì)加標(biāo)、基質(zhì)加標(biāo)平行樣及樣品平行樣的測(cè)定，以進(jìn)行質(zhì)量控制與質(zhì)量保證。8種人工甜味劑通過內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，用50 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)混合物從0.5至100 ng·mL-1（SUC為2～400 ng·mL-1）進(jìn)行6點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，結(jié)果顯示出良好的線性（r2≥0.99）。目標(biāo)化合物的回收率為83.8%～109.8%。目標(biāo)化合物的線性范圍、檢出限和定量限詳細(xì)記錄在表2中。

表2 目標(biāo)化合物檢測(cè)的線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear range, limits of detection （LOD） and limits of quantification （LOQ） of target compounds

1.6 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

使用風(fēng)險(xiǎn)商（risk quotient, RQ）方法評(píng)估了檢測(cè)到的人工甜味劑構(gòu)成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[18]。將RQ計(jì)算為測(cè)得的環(huán)境污染物的濃度（measured environment concentration, MEC）除以預(yù)測(cè)的無效應(yīng)濃度（predicted no effect concentration, PNEC）的商（公式（1））。PNEC值是急性或短期毒性數(shù)據(jù)（LC50或EC50）除以評(píng)估系數(shù)（assessment factor, AF）的商（公式（2））。

（1）

（2）

式中：LC50為通過生物毒性試驗(yàn)獲得的半數(shù)致死濃度，EC50為半數(shù)效應(yīng)濃度，檢測(cè)到的化合物的LC50或EC50值是從美國環(huán)境保護(hù)局（ecological structure activity relationship，ECOSAR v2.0模型）獲得，AF取1 000[20]。風(fēng)險(xiǎn)分類基于風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中RQ<0.01：“不太可能帶來風(fēng)險(xiǎn)”；0.011：“高風(fēng)險(xiǎn)”。

此外，為了評(píng)估人工甜味劑的綜合毒性，使用濃度加成模型來計(jì)算綜合風(fēng)險(xiǎn)商（MRQ）（公式（3）和（4））。

MRQ=max（STU1, STU2, ……STUm）×AF

（3）

（4）

式中：STU是毒性單位值之和；m是水生生物的類型，這里選擇了3種不同營養(yǎng)水平（綠藻、水蚤和魚類）的水生生物為代表；n是人工甜味劑的數(shù)量（n=8）[21]。如果MRQ的值>1，則認(rèn)為對(duì)水生生物或環(huán)境存在潛在風(fēng)險(xiǎn)[21]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2017、Origin Pro 2019b software （Origin Lab Corporation）和ArcGIS 10.2進(jìn)行整理、分析及作圖。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 人工甜味劑在大連近岸海域中的污染水平

大連近岸海域人工甜味劑的污染水平，如表3所示，在12個(gè)采樣點(diǎn)收集的海水樣品中都檢測(cè)到了人工甜味劑。共檢測(cè)到6種人工甜味劑，濃度范圍為2（ASP）～766（SUC） ng·L-1。ACE和SUC是主要檢出的人工甜味劑，如圖2所示，平均污染水平ACE>SUC>CYC>SAC>NEO>ASP。ALI和ADV在所有采樣點(diǎn)均未檢出，表明ALI和ADV在當(dāng)?shù)乜赡軜O少使用。

表3 人工甜味劑的預(yù)測(cè)的無效應(yīng)濃度（PNEC）值及在各站點(diǎn)的濃度Table 3 The predicted no effect concentration （PNEC） values and concentrations of artificial sweeteners at each site （ng·L-1）

圖2 不同采樣點(diǎn)人工甜味劑的污染水平Fig. 2 Accumulation levels of artificial sweeteners at different sampling points

目前國內(nèi)外針對(duì)沿海近岸水域人工甜味劑污染水平的報(bào)道相對(duì)較少，本研究同現(xiàn)有的研究進(jìn)行了比較（表4）。比較分析顯示，大連近岸海域的人工甜味劑總體濃度水平（按檢測(cè)最大濃度計(jì)）要高于北海（North Sea）[15]，顯著低于加的斯灣（Bay of Cadiz）[17]的污染水平。國內(nèi)的研究顯示，人工甜味劑總體濃度水平略高于中國香港維多利亞港[19]，但顯著低于中國天津渤海[10]的污染水平。不同國家及中國不同地區(qū)近岸海域中人工甜味劑的污染水平差異，可能來源于所研究地區(qū)的人口密度、飲食習(xí)慣及人工甜味劑的生產(chǎn)和消費(fèi)的差異。特別的，中國天津渤海[10]中人工甜味劑的總濃度比大連近岸海域的人工甜味劑總體濃度水平要高約60倍。在其他環(huán)境污染物檢測(cè)中，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，例如抗生素[22]、有機(jī)磷酸酯[23]和鄰苯二甲酸酯[24]等，均表現(xiàn)出渤海的污染水平要高于黃海，這可能與環(huán)渤海地區(qū)的城市貢獻(xiàn)及主要河流匯集相關(guān)。

2.2 人工甜味劑在大連近岸海域中的污染分布

大連近岸海域人工甜味劑的污染分布，如圖3所示。監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，大連近岸海域普遍存在人工甜味劑的污染。與其他站點(diǎn)相比，站點(diǎn)S1及站點(diǎn)S2的人工甜味劑總體濃度水平較高，原因可能是該站點(diǎn)位于入海排污口和大連灣港口附近，WWTP的污水排放及港口區(qū)域其他污染排放綜合作用導(dǎo)致。在本研究中，站點(diǎn)S1和S2的SUC濃度要遠(yuǎn)高于其他站點(diǎn)，平均濃度分別為764 ng·L-1和760 ng·L-1，除站點(diǎn)S1和S2外，其余站點(diǎn)的SUC濃度水平則相對(duì)較低（32～177 ng·L-1），與Xie等[18]報(bào)道的中國遼東半島地區(qū)SUC濃度水平相似。站點(diǎn)S12的人工甜味劑總體濃度水平最低，該站點(diǎn)位于海帶養(yǎng)殖區(qū)，人們活動(dòng)相對(duì)較少。站點(diǎn)S6的總體濃度水平要高于S7，表明人工甜味劑的濃度水平可能受到離岸距離的影響，這一結(jié)果也與Xie等[18]的研究結(jié)果一致。從功能區(qū)上來看，人工甜味劑濃度水平由大到小排列為：排污口、港口附近（S1～S4）>旅游景區(qū)（S6、S7、S9）>碼頭（S11）>濱海浴場(chǎng)、濱海公園（S5、S8、S10）>養(yǎng)殖區(qū)（S12），表明人工甜味劑的濃度水平可能與人們的活動(dòng)有關(guān)，WWTP的出水和近岸附近的其他污染排放是人工甜味劑進(jìn)入海洋的主要來源。

表4 人工甜味劑在不同地區(qū)近岸海域的污染水平Table 4 Pollution levels of artificial sweeteners in coastal water in different regions （ng·L-1）

圖3 人工甜味劑在大連近岸海域的污染分布Fig. 3 Pollution distribution of artificial sweeteners in coastal waters of Dalian

2.3 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

為評(píng)估人工甜味劑殘留對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境的不利影響，在RQ的基礎(chǔ)上對(duì)6種目標(biāo)人工甜味劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)估。本研究利用PNEC和MEC對(duì)影響綠藻、水蚤和魚類的目標(biāo)化合物進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。根據(jù)PNEC值和檢出最大的MEC值計(jì)算RQ。結(jié)果表明，大連近岸黃海海域中目標(biāo)人工甜味劑對(duì)綠藻、水蚤和魚類均不太可能帶來風(fēng)險(xiǎn)（RQ<0.01）。

單一化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，僅能提供海洋生態(tài)環(huán)境影響的部分信息。為此，進(jìn)一步進(jìn)行了累積風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果表明本研究中人工甜味劑混合風(fēng)險(xiǎn)商數(shù)值（MRQ）在0.002和0.004之間，其中SAC和NEO因其PNEC值較低，其貢獻(xiàn)占采樣點(diǎn)MRQ的94%以上（圖4）。本研究也對(duì)渤海灣（天津）的污染水平進(jìn)行了累積風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)果顯示其已對(duì)近岸海洋生態(tài)環(huán)境帶來低風(fēng)險(xiǎn)。Wiklund等[25]的研究已表明SUC對(duì)水體中水蚤行為會(huì)產(chǎn)生影響。盡管本研究的結(jié)果顯示現(xiàn)階段這些人工甜味劑對(duì)大連近岸黃海海域的水生生物不太可能構(gòu)成生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。但由于大連瀕臨黃海、渤海，且這些人工甜味劑在大連近海已表現(xiàn)出高頻檢出，因此有必要對(duì)大連近岸海域中的人工甜味劑進(jìn)行更密切的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

圖4 大連近岸海域中人工甜味劑綜合風(fēng)險(xiǎn)商（MRQ）的占比Fig. 4 Proportion of mixture risk quotient （MRQ） of artificial sweetener in Dalian coastal waters

本研究對(duì)大連近岸海域中表層海水8種典型人工甜味劑的污染水平進(jìn)行了研究，有6種人工甜味劑能夠被檢測(cè)到，其中SUC和ACE的環(huán)境污染濃度水平較高，濃度范圍分別為32～766 ng·L-1和103～557 ng·L-1。綜合污染水平顯示國內(nèi)外不同海域污染水平差異顯著，其中，大連黃海近岸海域人工甜味劑的污染水平低于渤海海域。污染分布顯示人工甜味劑的濃度水平排序?yàn)椋号盼劭?、港口附近（S1～S4）>旅游景區(qū)（S6、S7、S9）>碼頭（S11）>濱海浴場(chǎng)、濱海公園（S5、S8、S10）>養(yǎng)殖區(qū)（S12），表明人工甜味劑的濃度水平與人們的活動(dòng)有關(guān)。生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果表明，現(xiàn)階段目標(biāo)人工甜味劑對(duì)大連近岸水生生物不太可能產(chǎn)生生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。