膠質(zhì)細胞病
——伴皮層下囊腫的巨腦性腦白質(zhì)病致病機制研究進展*

石 真 王靜敏

（1）廣州市婦女兒童醫(yī)療中心，廣州 510000；2）北京大學(xué)第一醫(yī)院，北京 100034）

伴皮層下囊腫的巨腦性白質(zhì)腦?。╩egalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts，MLC）是一種罕見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘變性病，是由于MLC1或膠質(zhì)細胞黏附分子（glial cell adhesion molecule，GlialCAM）基因突變所導(dǎo)致的常染色體顯性或常染色體隱性遺傳病，其病理特征是星形膠質(zhì)細胞腫脹及髓鞘外層囊泡形成。MLC的典型臨床表現(xiàn)是出生后第1年內(nèi)出現(xiàn)巨顱畸形、中度至重度運動發(fā)育遲緩、智力正常或輕度智力發(fā)育遲緩，隨時間進展運動功能逐漸惡化，臨床出現(xiàn)共濟失調(diào)、癲癇發(fā)作、痙攣性截癱和錐體外系異常的表現(xiàn)［1-2］?；純猴B腦磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）顯示雙側(cè)大腦白質(zhì)對稱彌漫性異常高信號，伴或不伴前顳葉和額頂葉皮質(zhì)下囊腫［2］。MLC1（OMIM 605908）是由Van der Knaap等于2001年發(fā)現(xiàn)的MLC的第1個致病基因［3］，MLC1突變患兒臨床表現(xiàn)為經(jīng)典型MLC，即MLC1型（OMIM 604004），占MLC患者的75%。GlialCAM于2011年被確定為MLC的第2個致病基因［4］，與GlialCAM突變相關(guān)的疾病表型被命名為MLC2型。MLC2型按照遺傳方式的不同，可進一步分為2種，常染色體隱性遺傳的MLC2A型和常染色體顯性遺傳的MLC2B型，MLC2型的患者占MLC患者總數(shù)的20%。MLC2A和MLC2B呈現(xiàn)不同的臨床癥狀和預(yù)后，MLC2A型與MLC1型運動功能隨年齡增長逐漸惡化，而MLC2B型又稱為改善型，部分患者1歲以后出現(xiàn)臨床及頭顱MRI的改善，甚至完全恢復(fù)正常［4］。到目前為止，國際報道了約400例MLC患者，其中89例為MLC2型患者［5-7］。其中，北京大學(xué)第一醫(yī)院團隊報道了國內(nèi)首例MLC1及GlialCAM突變導(dǎo)致的MLC患者［8-9］，是目前國內(nèi)報道MLC患者最 多 的 單 中 心［5-6］，包 括MLC1型 患 兒24例、MLC2A型患兒1例、MLC2B型患兒5例?；純侯^顱MRI表現(xiàn)、腦組織病理切片及既往體內(nèi)和體外實驗表明，MLC發(fā)生的致病機制與水和離子穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)［10-11］。

1 MLC與GlialCAM的表達及結(jié)構(gòu)

MLC1所編碼的MLC1蛋白是一個由377個氨基酸組成的8次跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)［3］。MLC1在人腦組織中在位于血管周圍的星形膠質(zhì)細胞的遠端突起、室管膜下和軟腦膜下區(qū)域以及小腦的伯格曼膠質(zhì)細胞中表達［12］。MLC1作為跨膜蛋白，與細胞膜或基質(zhì)中蛋白質(zhì)有直接或間接相互作用，例如Na+/K+-ATP酶的β亞基、內(nèi)向整流鉀通道4.1（inward rectifier-type potassium 4.1，Kir 4.1）通道、水通道蛋白4（aquaporin protein-4，AQP4）、肌營養(yǎng)不良蛋白、小窩蛋白1和瞬時受體電位香草精4陽離子通道（transient receptor potential vanilloid-4 cation，TRPV4）［13］。MLC1突變后影響其他蛋白質(zhì)的活性，例如體積調(diào)節(jié)的陰離子通道（volume regulated anion channel，VRAC）［11］、LRRC8［14］，影響腫脹后星形膠質(zhì)細胞體積的恢復(fù)參與MLC的發(fā)生。GlialCAM編碼的GlialCAM蛋白是由416個氨基酸組成的跨膜蛋白，具有典型的免疫球蛋白樣細胞黏附分子結(jié)構(gòu)，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和富含脯氨酸的胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)含有1個信號肽和2個免疫球蛋白樣功能域［4］。CAM通過復(fù)雜的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對細胞的遷移、增殖、分化與凋亡存活起著重要作用。GlialCAM胞外區(qū)與臨近細胞胞膜上的黏附分子及胞外基質(zhì)相互作用，在胞內(nèi)與細胞肌動蛋白細胞骨架相互作用，肌動蛋白細胞骨架在維持細胞的完整性和形態(tài)上十分重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GlialCAM除了與MLC1共定位于星形膠質(zhì)細胞終足處外，還存在血腦屏障處、小腦伯格曼細胞及軸索中及髓鞘中。在髓鞘中，GlialCAM位于軸索與髓鞘的接觸面，以及形成髓鞘中，并與神經(jīng)絲蛋白重鏈共定位［4］。GlialCAM作為MLC1的分子伴侶，協(xié)助MLC1在細胞膜的正確定位，并將其集中 在 細 胞-細 胞 連 接 處［4，15］。目 前 已 發(fā) 現(xiàn) 的GlialCAM的大多數(shù)錯義突變位于第1個Ig結(jié)構(gòu)域（IgV型），并影響GlialCAM向細胞-細胞連接處的定位，同時影響突變的GlialCAM與正常GlialCAM蛋白之間的相互作用，而位于第2個Ig結(jié)構(gòu)域（IgC2型）的其余突變不影響GlialCAM在細胞-細胞連接處的定位。通過模型分析GlialCAM可通過第86~92個氨基酸殘基形成特定互相作用片段，從而在相鄰細胞間形成反式相互作用［16］。在IgV區(qū)的表現(xiàn)為，顯性遺傳突變的GlialCAM可以挽救不同位點顯性遺傳突變的GlialCAM，使其在細胞-細胞連接處的表達量增加，但是不能挽救隱性遺傳突變的GlialCAM在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，野生型GlialCAM不能起到挽救顯性遺傳突變GlialCAM細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的作用，從生物物理學(xué)層面解釋了GlialCAM突變會導(dǎo)致常染色體隱性遺傳（AR）和常染色體顯性遺傳（AD）兩種不同遺傳方式的基礎(chǔ)。

2 水離子穩(wěn)態(tài)與平衡

早期在對MLC1型患者尸檢腦組織病理學(xué)檢查顯示腦白質(zhì)中有大量空泡存在，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)髓鞘崩解及髓鞘內(nèi)空泡形成［12，17-18］，細胞學(xué)實驗觀察到的星形膠質(zhì)細胞空泡/腫脹以及在MLC疾病模型中報道的K+、Cl-等電流的變化、星形膠質(zhì)細胞自身調(diào)節(jié)能力障礙，導(dǎo)致水和離子穩(wěn)態(tài)失衡，引發(fā)MLC。調(diào) 節(jié) 性 容 積 減 少（regulated volume decrease，RVD）是動物細胞調(diào)節(jié)自身體積的基本能力，在低滲刺激時，星形膠質(zhì)細胞可以通過RVD機制，在瞬時滲透性腫脹后，通過K+、Cl-外流來實現(xiàn)重新調(diào)節(jié)其體積，以維持細胞形態(tài)和正常功能［19］。ClC-2是一種廣泛表達的細胞膜的氯離子通道，在超極化、細胞腫脹時緩慢激活［20］。ClC-2、GlialCAM及MLC1在星形膠質(zhì)細胞終足處共定位，形成三聚體結(jié)構(gòu)［21］，為ClC-2參與MLC的發(fā)生提供了空間上的可能。研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞MLC1敲除會導(dǎo)致GlialCAM和ClC-2在少突膠質(zhì)細胞中錯誤定位，而GlialCAM純合敲除或點突變后影響MLC1及ClC-2在細胞-細胞連接處的定位［22］，并影響ClC-2通道的電容傳導(dǎo)性。ClC-2的N端通過與GlialCAM細胞內(nèi)特定環(huán)狀結(jié)構(gòu)相互作用從而轉(zhuǎn)運至細胞膜處［22］。在細胞內(nèi)異源共表達后，GlialCAM增加ClC-2電流，而GlialCAM純合敲除及點突變小鼠中，ClC-2內(nèi)向整流電流減少［23］，但ClC-2敲除后并不影響GlialCAM和MLC1在細胞膜處的定位［22］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在GlialCAM純合敲除的小鼠模型中，通過與選擇性開放ClC-2通道的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交并不能挽救空泡表型［24］；在GlialCAM和ClC-2雙重敲除的小鼠腦組織，比僅敲除ClC-2的小鼠形成更嚴重的髓鞘空泡表型，均表明ClC-2功能障礙僅作為致病因素的一部分參與MLC的發(fā)生［22］，GlialCAM突變后影響其他過程共同參與致病仍需進一步研究。

3 細胞間通訊

MLC的最常見的致病基因為MLC1，在星形膠質(zhì)細胞中特異性表達，而異常的病理表型主要見于少突膠質(zhì)細胞形成的髓鞘［10，12］，既往研究發(fā)現(xiàn)星形細胞功能異常也可導(dǎo)致髓鞘結(jié)構(gòu)異常、巨顱及頭顱影像學(xué)的異常表現(xiàn)，如膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）基因突變導(dǎo)致亞歷山大?。?5］。此外，星形膠質(zhì)細胞通過分泌細胞因子和生長因子促進髓鞘的形成［26］，通過縫隙連接與少突膠質(zhì)細胞形成異源性相互作用［27］。結(jié)合患兒彌漫性腦水腫為特征的頭顱MRI表現(xiàn)、腦組織的切片及細胞學(xué)實驗觀察到的星形膠質(zhì)細胞空泡/腫脹以及在MLC疾病模型中報道的K+、Cl-和Ca2+電流的變化（圖1）［11，20，22，28］，提示MLC1突變可能直接或間接影響細胞間通訊和膠質(zhì)細胞合胞特性，最終導(dǎo)致MLC患者少突膠質(zhì)細胞的病理改變。

Fig.1 Putative model of the mechanism of formation of the ternary complex between GlialCAM,MLC1 and ClC-2,mutated GlialCAM leads to the reduced conductivity of ClC-2圖1 GlialCAM突變后通過MLC1/GlialCAM/ClC-2三聚體影響ClC-2通道效率導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞腫脹的可能機制示意圖

膠質(zhì)細胞的合胞體指膠質(zhì)細胞通過一系列細胞間連接蛋白形成廣泛耦合，允許水、離子和大分子進行快速空間再分配，使神經(jīng)系統(tǒng)在突觸活動后恢復(fù)穩(wěn)態(tài)狀態(tài)，這些分子蛋白包括縫隙連接蛋白、水和離子通道、膜轉(zhuǎn)運蛋白以及與其相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物［29］。細胞連接蛋白是一個由20多個蛋白質(zhì)組成的家族，構(gòu)成了細胞縫隙連接的通道［30］。這些通道直接連接相鄰細胞的細胞質(zhì)，可允許離子和一部分小分子物質(zhì)滲透通過。在神經(jīng)元中，它們參與構(gòu)成電突觸，而在膠質(zhì)細胞中，它們提供信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能［30］以及維持內(nèi)環(huán)境平衡［31］。有髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞上普遍表達多種連接蛋白，并且連接蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周正常髓鞘形成所必需的。其中，縫隙連接蛋白32（connexin32，Cx32）基因的部分突變可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘的疾病［32］。動物實驗表明，僅敲除少突膠質(zhì)細胞縫隙連接蛋白47（connexin47，Cx47）基因或Cx32基因的大鼠可以存活和繁殖，但是同時敲除Cx47或Cx32的大鼠會出現(xiàn)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘，并伴有震顫和強直性痙攣發(fā)作，提示少突膠質(zhì)細胞間通訊對維持髓鞘完整性及功能有重要作用。Lutz等［33］研究了星形膠質(zhì)細胞特異性敲除Cx43和縫隙連接蛋白30（connexin30，Cx30）基因?qū)ι偻荒z質(zhì)細胞成熟和髓鞘生成的影響，發(fā)現(xiàn)雙敲除小鼠顯示出水腫的星形膠質(zhì)細胞、空泡狀少突膠質(zhì)細胞和髓鞘腫脹，這種表型在出生后第23天開始出現(xiàn)并持續(xù)到成年。此外，星形膠質(zhì)細胞中缺乏Cx43和Cx30與髓鞘形成受損有關(guān)，如導(dǎo)致髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）表達減少。Cx32與Cx47在少突膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞間有共定位。因此，提出星形膠質(zhì)細胞特異性間隙連接的缺失會導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞和髓鞘病變［33］。Magnotti等［34］研究了星形膠質(zhì)細胞連接蛋白對少突膠質(zhì)細胞的影響，發(fā)現(xiàn)Cx43-/-/Cx32-/-小鼠呈現(xiàn)出髓鞘空泡形成的表型。與野生型相比，在這些小鼠中觀察到星形膠質(zhì)細胞數(shù)目顯著減少。這些研究提示了星形膠質(zhì)細胞之間、星形膠質(zhì)細胞與少突膠質(zhì)細胞之間連接異常，膠質(zhì)細胞合胞功能異常是導(dǎo)致水腫形成和髓鞘損傷的原因。既往研究發(fā)現(xiàn)，Cx43定位到星形膠質(zhì)細胞細胞膜需要GlialCAM的參與［35］。近期研究表明，GlialCAM誘導(dǎo)Cx43在細胞膜上的定位和穩(wěn)定后，MLC1通過抑制/降低ERK1/2激酶的Cx43磷酸化，從而促進Cx43在細胞膜上的穩(wěn)定性，阻礙Cx43的內(nèi)化和通道關(guān)閉，從而維持星形膠質(zhì)細胞間的縫隙連接通訊［36］，突變的MLC1通過ERK1/2的激活促進Cx43磷酸化，促進Cx43的內(nèi)化，減少在細胞膜處形成縫隙連接（圖2），同時細胞間通訊效率下降，表明星形膠質(zhì)細胞中Cx43受到MLC1調(diào)控以及Cx43參與MLC的發(fā)病機制，提示了潛在的治療干預(yù)的靶向途徑。

Fig.2 Putative model of the mechanism of mutated MLC1-mediated Cx43 recycling in astrocyte圖2星形膠質(zhì)細胞中MLC1突變介導(dǎo)的Cx43循環(huán)調(diào)節(jié)的可能機制示意圖

4 結(jié)語與展望

MLC是嬰兒期起病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘變性病，其致病基因為MLC1或GlialCAM。根據(jù)臨床表現(xiàn)分為MLC1及GlialCAMAR遺傳方式致病的經(jīng)典型（MLC1型及MLC2A型），該類分型運動功能逐漸惡化，最終至痙攣性癱瘓，而GlialCAM突變引起的AD遺傳方式致病的患兒為改善型（MLC2B型），部分患兒1歲以后出現(xiàn)臨床及頭顱影像學(xué)改善的情況，但有部分以AD遺傳方式致病的MLC患兒表現(xiàn)出孤獨癥樣改變，該類患兒臨床無改善出現(xiàn)的機制仍待進一步研究；AD突變的GlialCAM在細胞膜的定位可以被不同AD突變的GlialCAM所挽救，但不能被野生型蛋白所挽救［16］，是顯性副性效應(yīng)的體現(xiàn)，而既往推測改善型患者在1歲之后出現(xiàn)臨床好轉(zhuǎn)的原因可能是與MLC1與GlialCAM在發(fā)育過程中時空特異性的表達相關(guān)，最近在生物物理學(xué)層面針對突變及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析和預(yù)測，為發(fā)病機制的研究及明確GlialCAM不同突變位點遺傳方式的分類［16］提供了新的分析思路?；純侯^顱MRI表現(xiàn)出彌漫性腦水腫的特征，細胞學(xué)實驗觀察到的星形膠質(zhì)細胞空泡/腫脹、髓鞘崩解及囊泡形成，提示星形膠質(zhì)細胞功能障礙，水和離子轉(zhuǎn)運失衡，引起少突膠質(zhì)細胞功能障礙，導(dǎo)致MLC的發(fā)生；星形膠質(zhì)細胞之間、星形膠質(zhì)細胞與少突膠質(zhì)細胞之間通過縫隙連接形成合胞體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，提示MLC1/GlialCAM突變可能通過直接或間接作用，影響細胞間通訊和膠質(zhì)細胞合胞功能，最終導(dǎo)致MLC特征性病理改變的發(fā)生。MLC作為腦白質(zhì)病中患病率相對較高的罕見病，其致病機制的深入研究為其他以白質(zhì)腫脹為特征的腦白質(zhì)病，提供致病機制研究的可能思路，同時為將來的精準治療提供研究基礎(chǔ)。

綜上，MLC1/GlialCAM突變后，通過影響ClC-2通道、細胞連接蛋白Cx43，影響膠質(zhì)細胞合胞功能，導(dǎo)致水和離子穩(wěn)態(tài)失衡是MLC病理中星形膠質(zhì)細胞腫脹及髓鞘囊泡形成的重要原因，其具體機制仍有待實驗進一步研究證實。