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    42℃熱療抑制U251細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡*

    2022-11-22 10:44:08吳聰英
    生物化學與生物物理進展 2022年11期
    關(guān)鍵詞:熱療星形膠質(zhì)

    吳聰英 周 翠 張 捷

    (1)北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 101121;2)北京大學第一醫(yī)院,北京 100034)

    艾灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的常用治療方法。其借灸火的熱力給人體以溫熱性刺激,通過經(jīng)絡(luò)腧穴的作用,以達到溫通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和氣血、扶正祛邪及防病保健的方法?!鹅`樞經(jīng)·官針》篇指出:“針所不為,灸之所宜”。隨著醫(yī)學的進步與科研技術(shù)的發(fā)展,艾灸對癌癥的治療作用也逐漸被揭示,如改善血液循環(huán)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能和機體代謝、減輕化療毒副反應(yīng),以及減少癌癥并發(fā)癥等[1]。所以有學者認為,艾灸的治療根本在于“扶正以抑瘤”。艾灸通過作用于人體氣血經(jīng)絡(luò),扶助人體正氣,改善全身整體功能,從而達到祛病抑癌的目的[2]。但也有實驗證明,艾灸對癌細胞有直接的抑制和殺傷作用[3],只是具體機制尚未得到闡明。

    艾灸是一種綜合性的療法,其中首要的作用是熱療。在腫瘤學中,熱療是目前國際上認可的一種抑制癌癥的物理治療方法(高于37℃,一般為40~43℃)。作為放療和化療的輔助手段,熱療已經(jīng)被用于多種癌癥的治療,例如頭頸癌、乳腺癌、宮頸癌、肉瘤和黑素瘤[3]。在癌癥治療中使用熱療是很有吸引力的,因為作為一種物理療法,熱療的副作用比化療和放療少得多,而且它可以與這些療法結(jié)合使用。然而,由于熱療臨床抑癌效果的機制尚未得到明確,應(yīng)用受到了限制[4]。

    本研究通過運用長時間的顯微縮時攝影技術(shù)、細胞計數(shù)以及凋亡標志物成像等細胞生物學技術(shù)研究42℃熱療對星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞系的作用,從而明確熱療對癌細胞增殖和凋亡的影響,以期從一個角度揭示艾灸治療癌癥的具體機制。

    1 材料與方法

    1.1 細胞培養(yǎng)和熱療處理

    U251星形膠質(zhì)細胞癌細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司(CL-0237,STR鑒定正確)。本研究的U251細胞在適宜的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)液的成分為:體積占比89%DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific),體積占比10%胎牛血清(Gibco)和體積占比1%青霉素鏈霉素抗生素混合溶液(Gibco)。正常的培養(yǎng)條件為在細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)中以5% CO2和37℃以及95%以上濕度進行培養(yǎng)。熱療的培養(yǎng)條件為在細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)中以5%CO2和42℃以及95%以上濕度進行培養(yǎng)。

    1.2 顯微縮時攝影

    長時間的顯微縮時攝影是應(yīng)用Olympus CKX41倒置熒光顯微鏡對細胞形態(tài)進行記錄,用INU二氧化碳培養(yǎng)小室(TOKAI HIT)對細胞培養(yǎng)的溫度、濕度和CO2濃度進行控制。本研究的觀測熱療對U251細胞的培養(yǎng)條件為:5%CO2和42℃以及95%以上濕度。

    1.3 細胞計數(shù)和統(tǒng)計方法

    將U251細胞傳代于24孔板,對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)3 d(72 h)后,輕柔吸盡培養(yǎng)液,每孔加入1 ml細胞消化液(0.25%胰酶-EDTA,Gibco),37℃消化10 min。吹打混勻后,取10ul與等體積的0.4%臺盼藍染色液(瑞沃德)進行混勻染色,然后取10 μl加入DS-50細胞計數(shù)板(瑞沃德),在C100自動細胞計數(shù)儀(瑞沃德)下計數(shù),記錄全細胞數(shù)、活細胞數(shù)和死細胞數(shù)。用非配對t檢驗進行統(tǒng)計學分析。

    1.4 核固縮觀測

    將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿(Nest),對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d(48 h)后,加入1 ml 4%多聚甲醛細胞固定液(雷根)固定細胞,室溫固定10 min。然后加入用PBS溶液配制的2 mg/L Hoechst33342(Invitrogen H3570)細胞核染色液,染色5 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡(FLUOVIEW FV10i)下觀測。

    1.5 細胞凋亡檢測

    將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿(Nest),對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d(48 h)后,應(yīng)用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S,碧云天)經(jīng)染色。每孔的玻片 小 室 內(nèi) 加 入210 μl染 色 液(195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液+5 μl Annexin V-FITC染色液+10 μl碘化丙啶(PI)染色液),室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡(FLUOVIEW FV10i)下觀測。

    1.6 活細胞Caspase-3活性檢測

    將U251細胞傳代于激光共聚焦培養(yǎng)皿(Nest),對照組和熱療組分別在37℃和42℃培養(yǎng)2 d(48 h)后,應(yīng) 用 活 細 胞Caspase-3活 性 與Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒(C1077S,碧云天)。每孔的玻片小室內(nèi)加入200 μl染色液(194 μl Annexin V-mCherry結(jié) 合 液+5 μl Annexin V-mCherry染色液+1 μl GreenNuc?Caspase-3染色液),室溫避光孵育20 min。在Olympus激光共聚焦顯微鏡(FLUOVIEW FV10i)下觀測。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 熱療對U251細胞影響的動態(tài)觀察

    為了細致觀測熱療對U251細胞的影響,進行長達108 h的動態(tài)觀察(圖1,視頻S1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在第1天(24 h)內(nèi),仍有一部分細胞進行了分裂增殖,說明在熱療初期并不能完全抑制細胞的增殖,在這一段時間內(nèi)大部分變圓的細胞是因為細胞分裂。然而在1 d后,就很少見到細胞分裂,變圓的細胞開始慢慢增多。隨著時間推移,細胞變圓的現(xiàn)象更加明顯,而變圓的細胞往往最后會死亡,而這種現(xiàn)象在48 h(第2天),變得比較明顯,后續(xù)將此事件節(jié)點作為檢測細胞凋亡的時間點。而在72 h(第3天),底層貼壁細胞變少變大,上層變圓和死亡的細胞明顯增多,后續(xù)將此時間節(jié)點作為細胞計數(shù)的時間點。

    2.2 42℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的凋亡

    2.2.142℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的核固縮

    通過動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),在42℃熱療處理2 d(48 h)后,細胞變圓和細胞死亡的現(xiàn)象變得比較明顯,首先觀測熱療對U251細胞胞核的影響。與對照組相比,有一部分42℃熱療的星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞(往往是變圓的細胞)的細胞核縮小、形態(tài)畸變、凝聚,即核固縮,提示其可能發(fā)生了凋亡(圖2)。

    2.2.242℃熱療引起星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的凋亡

    因為觀察到熱療可以引起U251細胞核的核聚縮,用凋亡的標記物Annexin V來驗證熱療是否引起了細胞凋亡。42℃熱療處理U251細胞2 d(48 h)后,與對照組相比發(fā)現(xiàn),凋亡的標志物Annexin V和細胞死亡的標志物PI陽性的細胞明顯增多。與此同時還發(fā)現(xiàn),有一部分Annexin V陽性的細胞也同時是PI陽性,而且PI陽性的細胞則往往是Annexin V陽性的,提示這些PI陽性的細胞為凋亡后期失去細胞膜完整性的細胞(圖3)。此實驗證明了42℃熱療可以導(dǎo)致U251細胞的死亡,且細胞死亡以凋亡為主。

    Fig.1 Hyperthermia affected the morphology of astroglioma U251 cells during 108 h

    Fig.2 Hyperthermia affected the nuclear pyknosis of astroglioma U251 cells

    2.2.3熱療通過Caspase途徑介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞凋亡

    在確定熱療可以引起U251細胞凋亡后,進一步明確凋亡的類型。在42℃熱療處理U251細胞2 d(48 h)后,較對照組相比發(fā)現(xiàn),收縮變圓的細胞往往顯示Caspase-3和Annexin V雙陽性(圖4),提示熱療引起的細胞凋亡是Caspase-3相關(guān)的細胞凋亡。

    2.3 42℃熱療抑制星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的增殖

    通過動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),在42℃熱療1 d后,U251細胞基本上處于不再增殖且不斷凋亡的狀態(tài)。在熱療3 d后進行細胞計數(shù),評價熱療對U251細胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)無論是對于全細胞數(shù)還是活細胞數(shù),42℃熱療組均明顯低于正常溫度(37℃)的對照組,且活細胞占比也明顯下降(圖5),這說明42℃熱療抑制了星形膠質(zhì)細胞瘤U251細胞的增殖。

    Fig.3 Hyperthermia induced the apoptosis of astroglioma U251 cells

    Fig.4 Hyperthermia might mediate apoptosis of glioma U251 cells via Caspase-3 pathway

    Fig.5 Hyperthermia inhibited the proliferation of glioma U251 cells

    3 討 論

    現(xiàn)在癌癥的發(fā)病率越來越高,已成為人類最常見的死亡原因之一。2020年全世界有大約1 930萬癌癥病例,估計到2040年這一數(shù)字可能增加到2 840萬[5]。國家癌癥中心最新發(fā)布的《2022年全國癌癥報告》顯示,中國2016年惡性腫瘤新發(fā)病例約406.4萬人,死亡約241.4萬人。平均每天超過1萬人被確診為癌癥。與歷史數(shù)據(jù)相比,癌癥負擔呈持續(xù)上升態(tài)勢。目前,中國惡性腫瘤發(fā)病、死亡數(shù)持續(xù)上升,每年惡性腫瘤所致的醫(yī)療花費超過2 200億[6]?,F(xiàn)有癌癥的治療方法效果有限,手術(shù)治療及放療、化療仍是當今腫瘤治療的主流方法。但放療、化療產(chǎn)生的胃腸道反應(yīng)、免疫力低下等副作用嚴重影響腫瘤的治療及效果。近年來,艾灸療法作為中國傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分,艾灸對腫瘤患者的細胞免疫、體液免疫及放、化療后不良反應(yīng)的改善都有顯著療效,在緩解腫瘤患者的癌痛、胃腸道反應(yīng)、機體免疫力低下和癌因性疲乏等方面都有顯著療效[7]。

    艾灸的第一個特點是熱。在18世紀,人們注意到發(fā)燒患者的腫瘤會縮小。從那時起,熱療作為一種潛在的癌癥治療方法被廣泛研究[8]。在20世紀70年代,體外和體內(nèi)研究表明,腫瘤細胞不能像健康細胞一樣耐受升高的溫度[9]。國內(nèi)外的多項研究表明,熱療的抑癌機制可能是多方面的,包括但不限于幫助克服耐藥性[10]、增加放療敏感性[11]、調(diào)節(jié)血流[12]和誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。盡管許多研究表明,熱療在癌癥治療中具有積極作用,但這種方法仍存在爭議,其主要問題是缺乏熱療的精確腫瘤學定義并難以標準化[14]。而本研究在42℃下用顯微縮時攝影技術(shù)長時長觀測熱療對U251細胞的作用,為建立標準化的熱療抑癌范式提供了實驗證據(jù)。

    熱療可以部分解釋艾灸的抑癌機制,然而這可能不是艾灸抑制癌癥的唯一原因。有學者認為,艾灸效應(yīng)的原理并不僅僅是溫熱效應(yīng),而是由輻射、藥化、創(chuàng)傷及綜合等效應(yīng)的綜合作用結(jié)果[1]。也有學者認為,艾灸的作用機理是由艾條燃燒時所產(chǎn)生的物理和化學因子作用于腧穴,將刺激信號傳入中樞,經(jīng)過整合作用后傳出信號,調(diào)控機體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等,從而調(diào)整機體的內(nèi)環(huán)境,以達到防病治病的功效[15]。國內(nèi)的學者研究發(fā)現(xiàn),艾灸能一定程度抑制胃荷瘤大鼠的瘤體增長,上調(diào)胃部瘤體內(nèi)HSP70 mRNA的表達,促進HSP70的生成及細胞外釋放,且艾灸相對于紅外線的作用更明顯[3],艾灸的第二個特點是艾草燃燒產(chǎn)生很多揮發(fā)油性的物質(zhì)。這些物質(zhì)的分子質(zhì)量和親脂性可以讓它們比較容易地進入人體細胞中發(fā)揮作用。桉葉油素(1,8-cineole,Eucalyptol)是艾煙的主要成分[16]。本課題組的另外一項研究證實了1,8-cineole可以調(diào)節(jié)U251細胞內(nèi)的多條癌癥相關(guān)通路從而起到抑制細胞增殖的作用。以上研究均說明艾灸的抑癌作用是一個綜合作用,而并不僅僅是熱療作用。

    癌癥目前來說是威脅人類健康的第一大疾病,且缺乏有效且安全的治療手段?,F(xiàn)階段西醫(yī)治療癌癥的放化療方法并不能有效控制癌癥的發(fā)展和提高病人的生存質(zhì)量。中醫(yī)有著悠久的歷史,在中國歷經(jīng)了幾千年的驗證和積累,形成了一整套有效的醫(yī)藥運用方法。艾灸是一種經(jīng)典的中醫(yī)治療手段,集合了物理療法和化學療法,對多種癌癥有抑制作用。本研究從熱療的角度揭示艾灸抑制癌癥細胞增殖的細胞機制,為臨床艾灸治療癌癥提供理論基礎(chǔ),具有一定的理論意義和應(yīng)用價值。

    4 結(jié) 論

    通過以上結(jié)果看到熱療明顯抑制細胞的增殖,細胞死亡明顯增加。熱療處理后的U251細胞較對照組存在明顯的核固縮,標志物Annexin V和PI明顯升高,PI陽性細胞均呈Annexin V陽性,說明熱療導(dǎo)致的細胞死亡以細胞凋亡為主;大部分收縮變圓的細胞Caspase-3和Annexin V呈共同陽性,說明熱療可能通過Caspase途徑介導(dǎo)細胞凋亡。從而得出本研究結(jié)論:熱療可以抑制星形膠質(zhì)細胞癌細胞系U251細胞的增殖并誘導(dǎo)Caspase途徑相關(guān)的凋亡。

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