TLR3激活協(xié)同干擾素α抑制小鼠海馬神經(jīng)元DISC1表達(dá)

姚景宏，李加歡，劉子建

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 感染科， 湖北 武漢 430022；2.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)系，湖北 武漢 430030)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，約感染2.5%的人口，是造成肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌等肝臟相關(guān)疾病的主要原因[1]。干擾素是臨床上最常用的抗病毒藥物，但慢性丙型肝炎患者接受干擾素α(interferon α, IFNα)治療后有超過(guò)20%出現(xiàn)神經(jīng)精神綜合征，如抑郁癥，其機(jī)制仍未闡明[2]。DISC1(disrupted-in-schizophrenia 1)是一種多功能的神經(jīng)元突觸后致密物蛋白，與神經(jīng)元干細(xì)胞分化、遷移以及神經(jīng)元可塑性等關(guān)系密切，DISC1基因突變或功能異常與家族性精神分裂或抑郁癥等精神疾病的發(fā)生緊密相關(guān)[3]。慢性應(yīng)激和炎性反應(yīng)是精神疾病的重要致病因素，但炎性反應(yīng)對(duì)DISC1的表達(dá)及功能影響尚不清楚。TLR3(Toll-like receptor 3)受體屬于天然免疫受體，能感知病毒感染，啟動(dòng)抗病毒天然免疫反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多種細(xì)胞都表達(dá)TLR3，其中神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)的TLR3激活后可抑制神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、分化，影響神經(jīng)元突生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)[4]。聚肌胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, polyI:C)是人工合成的雙鏈RNA，能與TLR3特異性結(jié)合激活天然免疫，誘導(dǎo)合成、釋放炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素，模擬病毒感染[5]。IFNα是細(xì)胞感染病毒后首先產(chǎn)生的細(xì)胞因子之一，能通過(guò)JAK-STAT通路抑制病毒復(fù)制，并調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)[6]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，外源性IFNα可影響神經(jīng)內(nèi)分泌功能、睡眠-覺(jué)醒周期，增加神經(jīng)元興奮性等[7]。本文通過(guò)研究polyI:C與IFNα對(duì)神經(jīng)元DISC1表達(dá)的影響，探討病毒感染后IFNα治療誘導(dǎo)抑郁癥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)C57BL/6J孕鼠(同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SYXK2016-0057)。重組小鼠IFNα、鼠抗β-actin抗體(Sigma-Aldrich公司)；polyI:C(LMW)、B27、Neurobasal培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；兔抗DISC1多克隆抗體(Santa Cruz生物公司)；兔抗STAT1、磷酸化STAT1(p-STAT1)、兔抗MAPK p38和磷酸化MAPK p38(p-p38)抗體(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗PSD-95單克隆抗體(Synaptic System公司)；RNA提取試劑盒、real time PCR試劑盒及引物(Qiagen公司)；PCR引物信息(表1)。

表1 RT-qPCR引物Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)及分組處理：取C57BL/6J小鼠的E17-E18胚鼠，冰上取腦，解剖顯微鏡下取出海馬組織，0.125%胰蛋白酶37 ℃消化15 min，拋光的巴氏管機(jī)械分離細(xì)胞，以2×105/mL種植在24孔培養(yǎng)板，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，促使細(xì)胞貼壁后，改用含2% B-27的Neurobasal培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一半，第7天可見(jiàn)典型的神經(jīng)元，胞體折光性好，突起豐富。經(jīng)MAP-2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，神經(jīng)元純度≥95%。第9天將神經(jīng)元分為4組：1)對(duì)照組(control);2)polyI:C組;3)IFNα組;4)共刺激組(co-stimulation)，同時(shí)用polyI:C 和IFNα處理細(xì)胞。IFNα終濃度為1×108IU/L，polyI:C終濃度為1.0 g/L。對(duì)各組神經(jīng)元刺激24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)mRNA：提取細(xì)胞總RNA，取1 000 ng樣本總RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與管家基因β-actin拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，所有樣本均作復(fù)孔并重復(fù)3次，并用Bio-Rad CFX Manager處理結(jié)果。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)蛋白：將蓋玻片用0.01 mol/L PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，依次加入含0.125% Triton X-100的PBS液、1∶50的正常小牛血清中封閉30 min。加一抗于4 ℃濕盒內(nèi)孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，各步驟之間用PBS漂洗3次，Prolong Gold試劑封片。Carl Zeiss Apotome熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.4 Western blot檢測(cè)：用PBS緩沖液洗細(xì)胞3遍，加入細(xì)胞裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L sodium pyrophosphate，1 mmol/L beta-glycerophosphate，1 mmol/L Na3VO4，1 μg/mL leupeptin，100 μg/mL PMSF，pH 7.5)，冰上靜置20 min裂解細(xì)胞，裂解液在4 ℃ 12 000×g離心15 min，取上清。部分細(xì)胞裂解液中加入磷酸酶混合抑制劑。用BCA試劑盒進(jìn)行樣品蛋白濃度的測(cè)定。每組蛋白15 μg上樣以恒壓(110 V)電泳2.5 h；電轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)移電流300 mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間2 h；隨后將PVDF膜用含5% BSA的TBS封閉液于室溫封閉1 h，與一抗在雜交袋內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜，再與HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶12 000)在雜交袋內(nèi)37 ℃溫育1 h，ECL顯色，F(xiàn)usion FX拍照保存。圖像經(jīng)軟件Image J進(jìn)行相對(duì)吸光度測(cè)定，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR結(jié)果

干擾素刺激基因15(interferon stimulated gene, ISG15)是對(duì)IFNα刺激高反應(yīng)的基因，在IFNα組和共刺激組，ISG15 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.001)，但在共刺激組，經(jīng)polyI:C和IFNα共同處理24 h后，DISC1 mRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

培養(yǎng)至第9～11天的小鼠海馬神經(jīng)元突起豐富，胞體折光性好，進(jìn)一步行MAP2免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定表明：神經(jīng)元純度>90%。予以IFNα或polyI:C刺激24 h后，未見(jiàn)明顯細(xì)胞死亡。Tau-1和DISC1免疫雙標(biāo)結(jié)果顯示：對(duì)照組神經(jīng)元胞體和突起均有Tau-1和DISC1表達(dá)，而polyI:C組和IFNα組Tau-1和DISC1的表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。而共刺激組Tau-1表達(dá)無(wú)明顯變化，DISC1的定位雖無(wú)改變，但其表達(dá)明顯減弱(圖2)。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示TLR3激活和IFNα共刺激抑制神經(jīng)元表達(dá)DISC1

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，polyI:C組和IFNα組神經(jīng)元DISC1的表達(dá)無(wú)顯著差異，而共刺激組DISC1蛋白的表達(dá)明顯降低(F=24.99，P<0.01)(圖3A)。轉(zhuǎn)錄因子STAT的磷酸化在IFNα組和共刺激組顯著增加。p38 MAPK是TLR3介導(dǎo)抗病毒狀態(tài)的關(guān)鍵下游信號(hào)分子，其磷酸化水平在polyI:C組和共刺激組亦顯著增高。此外，各組之間GSK-3β與p-GSK-3β的表達(dá)并無(wú)改變(圖3B～C)。

A.the protein expression and statistical analysis of DISC1 in different groups;B.the protein expression and statistical analysis of p-STAT1 and STAT1 in different groups;C.the protein expression and statistical analysis of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-GSK-3β, GSK-3β in different groups; *P<0.05 compared with control group

3 討論

丙型肝炎患者接受IFNα、利巴韋林聯(lián)合治療后有超過(guò)20%出現(xiàn)抑郁癥表現(xiàn)，其分子機(jī)制尚不清楚[2]。DISC1基因是目前已知的與精神分裂癥、抑郁癥等精神疾病密切相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)基因之一，其發(fā)生點(diǎn)突變或表達(dá)異常與精神分裂癥患者的認(rèn)知功能損害存在一定關(guān)聯(lián)[3]，但其機(jī)制仍待闡明。

DISC1是一種多功能的突觸后腳手架蛋白，在神經(jīng)元的細(xì)胞核、胞質(zhì)、中心體、線粒體、細(xì)胞骨架、神經(jīng)突起以及突觸等部位廣泛表達(dá)[8]。在成年鼠，DISC1主要在海馬齒狀回、海馬下托、內(nèi)嗅皮層及嗅球高表達(dá)，以齒狀回表達(dá)最高[9]。研究表明DISC1參與調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和新生神經(jīng)元的遷移，并可通過(guò)調(diào)節(jié)GABA受體或NMDA受體信號(hào)影響神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)、突觸形成。腹腔注射N(xiāo)MDA受體拮抗劑鹽酸美金剛胺可降低成年小鼠海馬DISC1蛋白表達(dá)，并使齒狀回新生神經(jīng)元發(fā)生異位遷移[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在polyI:C和IFNα共同刺激下，培養(yǎng)神經(jīng)元DISC1 mRNA和蛋白水平均顯著下降，而單獨(dú)polyI:C或IFNα刺激，DISC1的表達(dá)無(wú)顯著變化，說(shuō)明只有天然免疫受體激活聯(lián)合IFNα刺激下才會(huì)影響DISC1的表達(dá)。

IFNα是一種抗病毒細(xì)胞因子，臨床常用于某些病毒感染(如HCV)或腫瘤治療。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IFNα與細(xì)胞表面的Ⅰ型IFN受體結(jié)合后，通過(guò)激活JAK/STAT信號(hào)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFNα和其他細(xì)胞因子，如IL-6、IL-1、TNFα等，抑制神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和興奮型突觸后電位[11]。polyI:C是天然免疫模式識(shí)別受體TLR3的合成配體，能激活TLR3受體及其下游信號(hào)通路，如NFκB、p38 MAPK和ERK信號(hào)，模擬病毒感染激活天然免疫[12]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR3激活參與神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化調(diào)節(jié)，影響神經(jīng)元可塑性[13]。本實(shí)驗(yàn)中，在polyI:C和IFNα共刺激組，神經(jīng)元內(nèi)p38 MAPK和STAT1磷酸化水平均顯著升高，提示p38 MAPK和JAK/STAT1信號(hào)通路激活參與了DISC1表達(dá)的調(diào)節(jié)。

GSK-3β是重要的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)功能和突觸可塑性，其功能失調(diào)與老年癡呆、精神分裂癥、抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生密切相關(guān)[14]。由DISC1的基因多態(tài)性產(chǎn)生的突變體可干擾Wnt/ GSK-3信號(hào)，進(jìn)而影響神經(jīng)發(fā)育[15]。DISC1蛋白通過(guò)GSK-3β相互作用可抑制其活性，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GSK-3β的表達(dá)及磷酸化水平在各組之間無(wú)顯著差異，提示在polyI:C和IFNα的炎性刺激下，神經(jīng)元的DISC1表達(dá)雖受到抑制，但GSK-3β表達(dá)及功能尚未受影響，說(shuō)明可能存在其他代償機(jī)制維持神經(jīng)元GSK-3β的功能。

綜上，本研究證實(shí)了TLR3激活聯(lián)合IFNα刺激可通過(guò)激活p38 MAPK和JAK/STAT1信號(hào)通路，抑制DISC1的表達(dá)，為闡明病毒感染和細(xì)胞因子在神經(jīng)精神疾病(如抑郁癥)發(fā)生中的分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。