海馬內(nèi)注射鳶尾素緩解小鼠抑郁樣行為

李 晶，黃炳軒，許 琪*

(1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系國家醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005；2.北京市第一六六中學(xué)，北京 100006)

抑郁癥 (depression) 是最常見的心境障礙，以顯著而持久的情緒低落為主要臨床特征。近年來，抑郁癥的發(fā)病率及患者自殺率呈現(xiàn)顯著增長態(tài)勢(shì)[1]，諸多生理及心理因素均可促使其發(fā)生，并且與多種慢性疾病存在共病的現(xiàn)象[2]。調(diào)查顯示，體育鍛煉可以減輕抑郁和焦慮癥狀。一項(xiàng)包含了 48 207名受試者的薈萃分析顯示，體育鍛煉可以顯著降低抑郁水平[3]。研究人員還提出了一些機(jī)制模型用于解釋運(yùn)動(dòng)如何緩解抑郁癥狀，包括改變血清素系統(tǒng)[4]、影響下丘腦-垂體-腎上腺軸[5]等。

近些年，有研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素 (irisin) 是一種在運(yùn)動(dòng)后高表達(dá)的激素[6]。鳶尾素是一種跨膜前體蛋白激素，從纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5) 中經(jīng)過剪切修飾而得到，高表達(dá)于肌肉和脂肪組織中，主要發(fā)揮調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用[7]。外周循環(huán)系統(tǒng)中的鳶尾素可以穿過血腦屏障，進(jìn)入腦脊液和腦實(shí)質(zhì)中[8]。有研究表明鳶尾素對(duì)腦疾病有積極作用，能夠挽救突觸連接衰竭及損傷，在阿爾茨海默病疾病模型中提供神經(jīng)保護(hù)效果。綜上所述，鑒于鳶尾素在運(yùn)動(dòng)后大量分泌且具有神經(jīng)保護(hù)效果，我們推測(cè)其可能和體育運(yùn)動(dòng)的抗抑郁機(jī)制有關(guān)。本研究探討了海馬內(nèi)注射鳶尾素對(duì)小鼠的抗抑郁效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：重組鳶尾素 (Sigma-Aldrich公司)；水合氯醛 (上海生工公司)；過氧化氫 (上海生工公司)；磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline, PBS) (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。

1.1.2 小鼠：8 周齡雄性 C57BL/6小鼠63只 (維通利華公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程及分組情況：在研究 OSFS 模型致抑郁作用的實(shí)驗(yàn)中，將 25 只小鼠隨機(jī)分為兩組，分別是：健康對(duì)照組(healthy)12只，不進(jìn)行任何處理；開放空間強(qiáng)迫游泳 (open-space forced swim, OSFS)模型組13只，進(jìn)行OSFS模型構(gòu)建。在研究腦內(nèi)注射鳶尾素的實(shí)驗(yàn)中，另取38只小鼠隨機(jī)分為4組，分別是：1)健康無壓力且注射 PBS(OSFS-、irisin-) 7 只；2)無壓力且注射鳶尾素 (OSFS-、irisin+) 7 只；3)OSFS模型且注射 PBS (OSFS+、irisin-)12 只；4)OSFS模型且注射鳶尾素(OSFS+、irisin+)12只。小鼠被籠養(yǎng)于12 h∶12 h 光-暗循環(huán) (光照07∶00至19∶00)、溫度 22～24 ℃、濕度 40%～60% 的環(huán)境中，自由飲食。所有成年動(dòng)物均按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院及北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)的條例進(jìn)行飼養(yǎng)和處理，并在北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦公室《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的規(guī)定范圍內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 OSFS動(dòng)物模型：本研究對(duì)OSFS急性抑郁模型[9]進(jìn)行了微小的改動(dòng)：使用28 cm×17 cm×16 cm長方形塑料容器，向其內(nèi)添加溫水，高度約11 cm，水溫在 32～34 ℃。將小鼠置于其中游泳， 計(jì)時(shí)15 min后取出，每天1次，持續(xù)4 d。

1.2.3 腦立體定位注射：使用 5% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，以體質(zhì)量為依據(jù)計(jì)算水合氯醛的用藥量(0.1 mL/10 g)。待小鼠完全麻醉后, 將小鼠固定到立體定位儀上，剃除小鼠頭部毛發(fā)，用解剖剪剪開小鼠頭皮，用 3% 過氧化氫去除顱骨上方的結(jié)締組織，暴露顱骨。以Bregma為原點(diǎn)，用手持式電動(dòng)微型顱鉆在海馬處[前后(AP)=2.0 mm, 左右(ML)=±1.8 mm]鉆孔，利用微量注射器在1 min 內(nèi)將0.1 μL重組鳶尾素(77 pmol)或PBS(作為對(duì)照)注射到海馬內(nèi)[背腹(DV)=2.0 mm]。注射后留針約2 min 以防止注射液倒流，最后緩慢拔出注射器。完成兩側(cè)海馬注射后縫合小鼠頭部皮膚，并將小鼠放置于37 ℃熱板上緩慢恢復(fù)30 min后放回籠中。

1.2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) (forced swim test, FST)：參照前人方案[10]進(jìn)行。在一個(gè) 3 L 的玻璃燒杯 (直徑 10 cm；高度 20 cm) 中加入 (24±1)℃自來水至15 cm高。將小鼠單獨(dú)放置在水中游泳6 min，同時(shí)進(jìn)行視頻記錄，后 4 min 納入分析，進(jìn)行雙盲評(píng)估。不動(dòng)時(shí)間定義為小鼠四肢都不動(dòng)、或偶有后肢踩水以保持懸浮狀態(tài)所持續(xù)的時(shí)間。

1.2.5 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST)[11]：懸尾實(shí)驗(yàn)使用 Noldus 公司 EthoVision XT 3.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，檢測(cè)開始前 1 h，將小鼠轉(zhuǎn)移到檢測(cè)環(huán)境中適應(yīng)。測(cè)試前用膠帶連接鼠尾及儀器檢測(cè)的金屬鉤，使小鼠倒掛于檢測(cè)箱內(nèi)，身體懸空不能觸碰到左右兩側(cè)及底側(cè)壁。測(cè)試持續(xù) 6 min，閾值設(shè)定為 2.5～60，低于2.5的時(shí)間被納入不動(dòng)時(shí)間，全部6 min都納入分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 開放空間游泳模型可誘導(dǎo)絕望樣抑郁行為

本研究首先建立了一種 OSFS 急性小鼠抑郁癥模型 (圖1A)。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，OSFS 模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著長于野生小鼠 (P<0.01) (圖1B)；在懸尾實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間也顯著提升 (P<0.05) (圖1C)。綜上，OSFS 可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生絕望樣抑郁行為，模型構(gòu)建成功。

2.2 雙側(cè)海馬注射鳶尾素能夠緩解 OSFS 所致的抑郁樣行為

為探究鳶尾素對(duì)抑郁狀態(tài)的影響，本研究利用構(gòu)建好的 OSFS 抑郁模型小鼠，通過腦內(nèi)海馬注射的方式給予鳶尾素，并通過行為學(xué)手段檢測(cè)其抗抑郁效果(圖2A)。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，健康小鼠在無壓力情況下(OSFS-) 注射鳶尾素未顯著改變小鼠的不動(dòng)時(shí)間。而與之相比，抑郁模型 (OSFS+, irisin-) 組小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著提升 (P<0.01)，出現(xiàn)抑郁樣行為；注射鳶尾素 (OSFS+, irisin+) 可以顯著降低小鼠的不動(dòng)時(shí)間 (P<0.001)，與健康小鼠無顯著區(qū)別 (圖2B)。在懸尾實(shí)驗(yàn)中，注射鳶尾素對(duì)健康小鼠 (OSFS-) 同樣沒有顯著影響，而對(duì)抑郁小鼠 (OSFS+) 的不動(dòng)時(shí)間顯著降低 (P<0.05) (圖2C)。綜上說明鳶尾素能夠緩解由 OSFS 抑郁模型所致的絕望樣行為。

3 討論

鳶尾素最初在體育運(yùn)動(dòng)[6]或寒冷環(huán)境[12]的刺激下被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于血清中，作用于白色脂肪細(xì)胞并促進(jìn)其棕色樣發(fā)育，以增加能量消耗，提升產(chǎn)熱效率，起到改善肥胖狀態(tài)與調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用；后來研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)或寒冷刺激產(chǎn)生肌肉震顫[13]，促使鳶尾素大量分泌。有研究發(fā)現(xiàn)鳶尾素在神經(jīng)系統(tǒng)中起到重要作用。鳶尾素在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 患者及小鼠模型中均有所降低，并且人為提升外周鳶尾素的水平可以有效改善AD相關(guān)的突觸丟失、突觸可塑性及記憶損傷，初步揭示了鳶尾素可能發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護(hù)作用[7]。

有研究報(bào)道鳶尾素在慢性不可預(yù)見性應(yīng)激(chronic unpredictable stress, CUS)模型的大鼠中具有抗抑郁效果[14]。CUS模型的建模周期長達(dá)4～6周，小鼠罹患?jí)毫Υ?，更好地模擬了重度抑郁癥的行為特征。本文是應(yīng)用小鼠的急性應(yīng)激抑郁模型(OSFS)證實(shí)鳶尾素的抗抑郁療效的研究，為鳶尾素抗抑郁這一結(jié)論提供了更堅(jiān)實(shí)的證據(jù)。OSFS模型周期短，壓力更小，很好地模擬了人類在一般壓力下的抑郁情緒，有望在后續(xù)對(duì)抑郁的相關(guān)研究中發(fā)揮作用。

目前關(guān)于鳶尾素調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的確切生理機(jī)制仍然不清楚。許多研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 及其相關(guān)通路與鳶尾素有密切的聯(lián)系[5, 15]，也有研究報(bào)道鳶尾素通過促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生等來改善認(rèn)知功能及精神狀態(tài)[16-17]。鳶尾素在骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞上的信號(hào)傳導(dǎo)可能經(jīng)由與integrin αV 受體的相互作用所介導(dǎo)[18]，然而其在神經(jīng)細(xì)胞上的受體或信號(hào)傳遞方式仍未明確。上述方面的深入研究對(duì)我們更深刻地理解鳶尾素復(fù)雜的生理效應(yīng)具有重要意義。

綜上所述，中樞鳶尾素水平的人為提升能夠有效挽救抑郁模型小鼠的行為絕望，初步證實(shí)了鳶尾素具有對(duì)抑郁行為的改善效果。前期報(bào)道證實(shí)了體育活動(dòng)[19]及日常鍛煉的生活方式[20]可以提高鳶尾素在腦組織中的表達(dá)。本研究進(jìn)一步揭示了鳶尾素可能介導(dǎo)了體育運(yùn)動(dòng)對(duì)精神狀態(tài)的積極調(diào)節(jié)作用，為臨床中對(duì)抑郁癥患者恰當(dāng)使用運(yùn)動(dòng)療法提供了初步的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，并展示出鳶尾素開發(fā)成為抗抑郁藥物的前景和應(yīng)用價(jià)值。