慢性阻塞性肺疾病發(fā)病易感性與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)

夏岑峰，王 娜，張 鵬

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 心腦血管病醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 寧夏 銀川 750004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmori-ary disease, COPD，簡(jiǎn)稱慢阻肺)是一種常見(jiàn)的由有害氣體刺激所致的慢性肺部異常炎性疾病，一般以氣流受限且不完全可逆為特征。慢阻肺的發(fā)生表現(xiàn)出明顯的可遺傳特征[1]。目前，研究慢阻肺的候選基因有很多，主要集中在炎性相關(guān)基因：殼三糖苷酶/幾丁質(zhì)酶1(chitotriosidase/chitinase 1，CHIT1)水平在慢阻肺患者體內(nèi)明顯失調(diào)[2]，CHIT1的多態(tài)性對(duì)慢阻肺患者肺功能下降有顯著影響[3]；磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D，PDE4D)與多種炎性細(xì)胞的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)水解有關(guān)。PDE4D基因rs16878037位點(diǎn)的多態(tài)性被證明與COPD顯著相關(guān)，且存在種族間差異，在吸煙的慢阻肺病人中，PDE4D呈現(xiàn)出高表達(dá)[4]。由此說(shuō)明，CHIT1和PDE4D均與慢阻肺疾病相關(guān)。

本研究選取中國(guó)漢族和中國(guó)蒙古族CHIT1基因的4個(gè)位點(diǎn)rs771576027、rs1402870472、rs61745299、rs527497633和PDE4D基因的1個(gè)位點(diǎn)rs117292391，研究基因多態(tài)性與慢阻肺發(fā)病的關(guān)系，為早期診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2015年7月至2018年7月被診斷為慢阻肺的患者，隨機(jī)選取漢族患者237例和蒙古族患者207例，共444例歸為患病組。另外，隨機(jī)選擇同期體檢的健康漢族人215例和蒙古族人219例，共434名作為對(duì)照組。對(duì)所有來(lái)診人群均進(jìn)行了吸煙情況和幼兒時(shí)期呼吸病史等信息的記錄。本研究方案經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)；所有參與研究的志愿者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑： 蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP)、ddNTPs(Sigma公司)；其他試劑(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA的提取：采集外周血5 mL，EDTA抗凝后離心留取血細(xì)胞，依次加入細(xì)胞裂解液、核溶解液、蛋白沉淀液、異丙醇和75%乙醇處理后，加入ddH2O，65 ℃水浴2 h。利用nanodrop-2000儀器檢測(cè)提取出的DNA的濃度及純度。

1.2.2 基因型的檢測(cè)：對(duì)目的SNP序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)45次；72 ℃ 5 min。再加入SAP用于消除多余的dNTPs和引物，反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。之后加入單個(gè)ddNTP進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，循環(huán)45次；72 ℃ 3 min。將最終反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣于芯片上，通過(guò)Sequenom MassARRAY SNP檢測(cè)平臺(tái)，利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)PDE4D基因和CHIT1基因上的所有位點(diǎn)進(jìn)行基因分型檢測(cè)。其中每個(gè)位點(diǎn)的call rate參數(shù)值設(shè)置為>90%，最終得到基因位點(diǎn)的描述性統(tǒng)計(jì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS.19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Logistic回歸得出優(yōu)勢(shì)比(OR/Exp)和95%置信區(qū)間；校正吸煙情況和幼兒呼吸病史因素的影響后，對(duì)SNP位點(diǎn)與慢阻肺的易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。用卡方檢驗(yàn)方法對(duì)各基因型和等位基因頻率分布進(jìn)行分析。得到的數(shù)據(jù)計(jì)量以n(%)的形式表示。使用SPSS方差分析Bonferroni法兩兩比較校正P值作為顯著性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組的基本信息

將878份就診病例(其中對(duì)照組434例，患病組444例)的基本信息進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，吸煙與否及rs61745299(CHIT1)、rs117292391(PDE4D)的基因型分布頻率與患病存在顯著差異(P<0.05)(表1)。蒙族和漢族之間無(wú)顯著差異(表2)。

表1 患病組與對(duì)照組的基本信息

表2 不同民族人群基因型Table 2 Genotypes of different nationalities

2.2 Logistic回歸分析

吸煙能夠增加慢阻肺疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)；吸煙人群發(fā)生慢阻肺的風(fēng)險(xiǎn)比不吸煙人群高約1.4倍(Exp=1.401, 95%CI=1.074～1.827)。

2.3 CHIT1基因與慢阻肺易感性的關(guān)系

CHIT1位點(diǎn)rs61745299的基因型和等位基因在患病組和對(duì)照組中的分布顯示，基因型CC和CG、等位基因C均為慢阻肺發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其中基因型CG和等位基因C在兩組間差異顯著(P<0.05)(表3)。

表3 兩組中CHIT1的rs61745299位點(diǎn)基因型和等位基因分布Table 3 Genotype and allele distribution of rs61745299 in CHIT1 of the two groups[n(%)]

2.4 PDE4D基因與慢阻肺易感性的關(guān)系

PDE4D位點(diǎn)rs117292391的基因型和等位基因在患病組和對(duì)照組中的分布顯示，基因型AG和等位基因G為慢阻肺發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且都在兩組間差異顯著 (P<0.05)(表4)。

表4 兩組中PDE4D的rs117292391位點(diǎn)基因型和等位基因分布Table 4 Genotype and allele distribution of rs117292391 in PDE4D of the two groups[n(%)]

3 討論

CHIT1位于人類1號(hào)染色體q31-q32，共包含12個(gè)外顯子，長(zhǎng)度約20 kb。CHIT1主要在髓樣細(xì)胞中表達(dá)，包括嗜中性粒細(xì)胞、成熟的單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞、肺巨噬細(xì)胞、肺和腸中其他特定的組織巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞中的Toll 樣受體(Toll-like receptor，TLR)受到刺激后就會(huì)釋放出CHIT1[5]，CHIT1可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)受體的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)，還可以修飾組織的纖維化和氣道重塑[6]。由于COPD是由異常損傷和組織修復(fù)反應(yīng)引起的慢性肺部疾病，因此CHIT1在疾病發(fā)生中的作用和致病機(jī)制非常重要。本研究證明了CHIT1的rs61745299位點(diǎn)的基因型CG和等位基因C增加患慢阻肺疾病的風(fēng)險(xiǎn)，CHIT1可能成為COPD的生物標(biāo)志物。

一方面，PDE4D可以通過(guò)降解cAMP來(lái)調(diào)控炎性細(xì)胞[7]，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能，另一方面控制氣道平滑肌的舒張[8]。COPD是一種進(jìn)行性發(fā)展的疾病，與遺傳因素相關(guān)。日本人群中PDE4D的rs829259位點(diǎn)與COPD發(fā)病相關(guān)，而中國(guó)人群中PDE4D上的rs35386位點(diǎn)與COPD發(fā)病相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)PDE4D上的rs117292391位點(diǎn)與COPD發(fā)病相關(guān)，且基因型AG和等位基因G會(huì)增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

吸煙是導(dǎo)致COPD的重要因素之一。吸煙患者體內(nèi)α1-抗胰蛋白酶(AAT)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的變化進(jìn)而引起對(duì)COPD易感[10]。肺部的抗氧化系統(tǒng)失衡形成的氧化應(yīng)激也會(huì)導(dǎo)致COPD的發(fā)生[11]。總之，COPD是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，其易感性與二者均有關(guān)系。

根據(jù)本研究結(jié)果，CHIT1的rs61745299位點(diǎn)和PDE4D的rs117292391位點(diǎn)在漢族和蒙古族患者之間不存在顯著差異，但這兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性單獨(dú)在漢族群體或蒙古族群體中是否與慢阻肺顯著相關(guān)，需要進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。