模式生物斑馬魚在卒中研究中的應(yīng)用

莫東燦，劉柳余，李肖玲，李建立，羅曼

卒中在我國城市和農(nóng)村，是致殘和死亡的首要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國每年新發(fā)卒中約200萬人，死于卒中約110萬人，且發(fā)病率逐年增加，給患者家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[1]。卒中病因及發(fā)病機(jī)制如今尚未完全闡明，防治措施相對(duì)有限，動(dòng)物模型為探索其病理生理演變及藥物研發(fā)提供了必要工具。雖然嚙齒類動(dòng)物在卒中研究中使用廣泛，但其在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和藥物篩查研究中具有一定的局限性。斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）是一種理想的脊椎模式生物，在活體血管研究方面更是具備自身的特點(diǎn)及優(yōu)勢，已被越來越多地應(yīng)用于腦血管病的研究當(dāng)中，本文將對(duì)此作一綜述。

1 斑馬魚腦血管系統(tǒng)發(fā)育及生物學(xué)特點(diǎn)

1．1 斑馬魚的腦血管系統(tǒng)發(fā)育過程 斑馬魚在受精后20 h左右，兩條靜脈——原始后腦通道逐漸形成，并沿著后腦腹側(cè)的前后軸平行分布[2]。在受精后28～32 h，新生血管從兩條原始后腦通道的內(nèi)側(cè)芽生，并向中線遷移，垂直于前后軸形成基底動(dòng)脈[3]。受精后約32 h，中央動(dòng)脈開始從原始后腦通道的背側(cè)芽生，并逐漸向背側(cè)遷移，然后轉(zhuǎn)向腹側(cè)與基底動(dòng)脈或后交通動(dòng)脈相連，形成拱形結(jié)構(gòu)。在受精后約36 h，中腦中央動(dòng)脈從脈絡(luò)膜血管叢芽生，并延伸多個(gè)分支與基底交通動(dòng)脈相連，或在它們之間形成復(fù)雜的血管環(huán)[4]。這一時(shí)期，頸內(nèi)動(dòng)脈的尾部分支形成并向尾部延伸，與基底交通動(dòng)脈及后交通動(dòng)脈相連，形成一個(gè)結(jié)構(gòu)上與人類大腦動(dòng)脈環(huán)（circle of Willis）相似的血管環(huán)[1]。

1．2 斑馬魚與人類基因組的相似性與差異性 斑馬魚與人類基因組具有相似性與差異性。二者蛋白質(zhì)編碼基因的直接比較揭示了許多有趣的特征。71．4%的人類基因至少有1個(gè)斑馬魚同源基因，反過來，69%的斑馬魚基因至少有1個(gè)人類同源基因。在同源基因中，47%的人類基因與斑馬魚同源基因存在一對(duì)一的關(guān)系[5]。說明斑馬魚作為模式生物，對(duì)于人類疾病研究非常重要?，F(xiàn)有研究表明，斑馬魚基因組的隨機(jī)突變中，已經(jīng)鑒定出5494個(gè)同源基因中的3188個(gè)基因突變與人類疾病相關(guān)[6]。另外，斑馬魚與人類的基因組必然存在差異，與人類基因組相比，斑馬魚基因組中的假基因很少。研究人員在斑馬魚基因組中鑒定了154個(gè)假基因，而人類基因組中的假基因約有13 000個(gè)，假基因被認(rèn)為是在進(jìn)化中喪失了功能的基因[6]。

1．3 斑馬魚在腦血管疾病方面的研究優(yōu)勢 腦血管疾病研究領(lǐng)域中，斑馬魚相對(duì)傳統(tǒng)的模式生物而言，有其獨(dú)特的優(yōu)勢，體現(xiàn)在多個(gè)方面：

（1）斑馬魚體型雖小，但產(chǎn)卵量大、生長周期短，養(yǎng)殖并不繁瑣且費(fèi)用低廉，是一種可提高實(shí)驗(yàn)效率的脊椎模式生物。與許多哺乳動(dòng)物的受精方式不同，斑馬魚胚胎及幼魚身體透明，利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚，例如在內(nèi)皮中表達(dá)綠色熒光蛋白的tg（flk1：gfp）斑馬魚可以便捷地用熒光顯微鏡觀察到全身血管[7]。

（2）在腦血管生成和血腦屏障結(jié)構(gòu)方面，斑馬魚與哺乳動(dòng)物具有極高的相似性。不僅在腦血管的發(fā)育和功能上與哺乳動(dòng)物具有高度一致性，而且在促進(jìn)血管生成的細(xì)胞和分子機(jī)制上具有高度的保守性[3，8]。同時(shí)，斑馬魚的免疫系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物相似，包括具備相對(duì)完整的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和保守的先天性免疫系統(tǒng)。

（3）斑馬魚胚胎及幼魚能夠進(jìn)行活體成像，允許實(shí)時(shí)可視化血管生成的觀察，并可以在空間和時(shí)間上判斷斑馬魚血流動(dòng)力學(xué)和血管結(jié)構(gòu)的變化[9-10]，使得斑馬魚在腦血管疾病研究中的地位愈發(fā)重要。

（4）斑馬魚的全基因組測序工作已完成，其遺傳序列與人類遺傳序列高度保守。同時(shí)針對(duì)斑馬魚的基因操作技術(shù)已非常成熟，通過靶向修飾或敲除某些基因改變其表達(dá)水平，可以較容易地對(duì)興趣基因進(jìn)行精確操作，非常適合進(jìn)行人類疾病建模及機(jī)制研究。

2 斑馬魚在卒中研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2．1 缺血性卒中 卒中分為缺血性卒中和出血性卒中兩類，我國缺血性卒中約占全部卒中的69．6%～70．8%[11]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性卒中的最常見病因?qū)W亞型——大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中的主要病理基礎(chǔ)，血漿膽固醇水平升高是AS的主要驅(qū)動(dòng)因素。嚙齒類動(dòng)物對(duì)AS形成具有天然的抵抗力，使得利用該物種進(jìn)行AS研究具有內(nèi)在的難度。許多其他的非嚙齒動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵矡o法模擬人類脂蛋白的組成和AS的發(fā)生[12]。目前，斑馬魚被認(rèn)為是研究AS機(jī)制和治療靶點(diǎn)的極好的模式生物，在AS研究中顯示出了無法比擬的優(yōu)勢：首先，斑馬魚的脂蛋白生物學(xué)和代謝特點(diǎn)與人類基本相同[13]；其次，斑馬魚通過喂飼高膽固醇飲食很容易誘發(fā)與人類相似的以低密度脂蛋白水平增高為主的高膽固醇血癥，而不同于嚙齒動(dòng)物高密度脂蛋白水平升高為主的模式[13]；再次，短時(shí)間暴露于高膽固醇飲食后，斑馬魚幼魚即可出現(xiàn)低密度脂蛋白的氧化、巨噬細(xì)胞對(duì)氧化低密度脂蛋白的吞噬、脂質(zhì)在血管壁的沉積以及向內(nèi)膜下浸潤及血管壁脂質(zhì)條紋的形成，這和人類AS早期的病理變化相同[13-14]；最后，由于斑馬魚幼魚魚體透明，可在共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)成像追蹤氧化低密度脂蛋白顆粒，動(dòng)態(tài)觀察活體動(dòng)脈內(nèi)AS的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程[14-15]，具有其他動(dòng)物模型無法比擬的優(yōu)越性。

由于基因編輯方面的優(yōu)勢，斑馬魚為缺血性卒中相關(guān)基因功能的研究提供了廣闊平臺(tái)，例如斑馬魚是研究claudin-5、Zo-1、Wnt等血腦屏障滲漏相關(guān)蛋白功能的有效模式生物[16-18]，因此逐漸被用于腦小血管病血管完整性的研究當(dāng)中[5]。此外，還有研究利用斑馬魚對(duì)NOTCH3、FOXF2、VEGFA、GSPT1L等基因在缺血性卒中病理生理過程中的作用進(jìn)行研究[19-22]。

2．2 出血性卒中 出血性卒中發(fā)病率雖然只占全部卒中的20%～30%，但病死率極高，預(yù)后較缺血性卒中更差[23]。出血性卒中包含腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。腦出血的常見病因主要是以高血壓合并小動(dòng)脈硬化、微血管瘤，另外腦淀粉樣血管病、動(dòng)靜脈畸形、腦海綿狀血管瘤、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤等也會(huì)導(dǎo)致腦出血的發(fā)生。蛛網(wǎng)膜下腔出血的最常見病因則是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂。

由于只需要傳統(tǒng)的倒置光學(xué)顯微鏡就可以方便而直接地觀察顱內(nèi)出血，因此斑馬魚已被廣泛地應(yīng)用于出血性卒中的研究中[24]。例如，Donnini等[25]發(fā)現(xiàn)β淀粉樣蛋白可誘導(dǎo)斑馬魚內(nèi)皮細(xì)胞老化、微血管形態(tài)和功能漸進(jìn)性改變，提出這可能是散發(fā)性或遺傳性腦淀粉樣血管病的潛在發(fā)病機(jī)制之一。Sung等[26]發(fā)現(xiàn)斑馬魚的alk1基因敲除會(huì)造成顱內(nèi)大動(dòng)脈異常擴(kuò)張并與靜脈直接相連，這與alk1基因突變患者的腦內(nèi)動(dòng)靜脈畸形血管表型相似。目前已經(jīng)確定了腦海綿狀血管瘤三個(gè)致病基因（CCM1、CCM2和CCM3）的斑馬魚同源基因[27-28]，研究者通過基因編輯技術(shù)或嗎啉寡聚核苷酸技術(shù)對(duì)斑馬魚同源基因進(jìn)行敲除，觀察到斑馬魚形成易于出血的薄壁擴(kuò)張血管，這與人類腦海綿狀血管瘤病理改變相似[28]，可作為人類腦海綿狀血管瘤的動(dòng)物模型并用以探討該病的發(fā)病機(jī)制。斑馬魚還被用于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成有關(guān)的基因研究，Santiago-Sim等[29]通過全外顯子測序發(fā)現(xiàn)的thsd1基因可能與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，進(jìn)而在thsd1基因敲除斑馬魚上觀察到顱內(nèi)出血。

在機(jī)制研究方面，內(nèi)皮連接穩(wěn)定性和血管系統(tǒng)完整性的破壞被認(rèn)為是出血性卒中的重要發(fā)病機(jī)制之一，而斑馬魚在研究血管完整性方面具備一定的優(yōu)越性，因此，有越來越多的學(xué)者應(yīng)用斑馬魚進(jìn)行這方面的研究。例如Zou等[30]利用斑馬魚進(jìn)行微小核糖核酸（microRNA，miR）研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126在斑馬魚血管表達(dá)豐富，起到維持血管完整性的作用，敲除miR-126基因會(huì)導(dǎo)致斑馬魚顱內(nèi)出血。

2．3 利用斑馬魚進(jìn)行卒中藥物研究 成年斑馬魚在每次交配中可以產(chǎn)生多達(dá)300個(gè)胚胎，研究者一次可以對(duì)數(shù)千個(gè)有機(jī)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于斑馬魚胚胎的直徑遠(yuǎn)小于1 mm，因此可以在96或384孔板上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大多數(shù)小分子很容易滲透到斑馬魚體內(nèi)，只需將藥物稀釋到魚水中即可有效地“治療”生物體。而斑馬魚最大的特點(diǎn)在于胚胎透明，可從活體觀察到所有血管結(jié)構(gòu)，從而可以在顯微鏡下多角度地觀察到血管的發(fā)生發(fā)展和動(dòng)力學(xué)過程，是一種理想的血管研究活體動(dòng)物模型[31]。斑馬魚的微觀尺寸、高繁殖力和易給藥性，加上易于識(shí)別血管表型，使其已成為常用的活體高通量腦血管藥物篩選工具，并逐漸拓展至新藥開發(fā)及藥理學(xué)領(lǐng)域。

Zhu等[32]建立了斑馬魚血栓形成的藥物篩選及療效評(píng)價(jià)模型，并驗(yàn)證阿司匹林、氯吡格雷等藥物對(duì)斑馬魚血栓形成均有顯著的預(yù)防和治療作用。Yi等[33]通過斑馬魚模型對(duì)中藥茜草的藥理作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)茜草提取物在斑馬魚體內(nèi)具有抗血栓形成和促血管生成活性，主要活性成分可能為蒽醌類和萘醌類。Peterson等[34]發(fā)現(xiàn)利用斑馬魚篩選出的兩種小分子物質(zhì)GS4012和GS3999可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)而使斑馬魚閉塞的動(dòng)脈恢復(fù)通暢。隨著斑馬魚高分辨在體成像技術(shù)、自動(dòng)化分選技術(shù)及定量化數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，未來斑馬魚在腦血管藥物研究方面將具有更為廣闊的應(yīng)用前景，并將為開發(fā)出安全、有效的藥物做出巨大貢獻(xiàn)。

2．4 斑馬魚在卒中研究中的不足之處 當(dāng)前研究中，斑馬魚具備自身特點(diǎn)及優(yōu)勢的同時(shí)也存在著一定的局限性。第一，藥物篩選研究中，傳統(tǒng)嚙齒類動(dòng)物的給藥方式多樣，飼喂、灌胃、靜脈注射、腹腔注射等，可根據(jù)藥物特性選擇恰當(dāng)?shù)慕o藥方式，而斑馬魚大多采用浸泡給藥，適合水溶性較好的藥物進(jìn)行干預(yù)及評(píng)價(jià)，而在水溶性不佳的藥物研究中，斑馬魚并非首選[35]。第二，斑馬魚研究起步較晚，圍繞其開展的實(shí)驗(yàn)技術(shù)較少，傳統(tǒng)模式生物在分子機(jī)制研究中多利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行多方式的驗(yàn)證，如免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)等，但目前針對(duì)斑馬魚為靶向種屬設(shè)計(jì)的抗體仍是極度缺乏的，所以斑馬魚的信號(hào)通路體系建設(shè)仍需完善[36]。第三，國際上對(duì)斑馬魚研究的標(biāo)準(zhǔn)化明顯滯后[37]，如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)倫理的標(biāo)準(zhǔn)化、實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)開展的標(biāo)準(zhǔn)化、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化等，還需很長一段路要走。

斑馬魚在卒中研究中具有其他模式生物所不具備的獨(dú)特優(yōu)勢，其不僅在基因功能研究中操作十分便利，還可以作為高通量藥物篩選的實(shí)施平臺(tái)，目前已越來越多地被應(yīng)用于出血性及缺血性腦血管病研究中。雖然斑馬魚在卒中研究中仍存在著一些不足之處，但相信隨著技術(shù)的日益完善，這一模式生物有望為人類探索腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的工具，并幫助研究者發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)及治療方法。

【點(diǎn)睛】本文通過總結(jié)歸納斑馬魚相對(duì)于傳統(tǒng)模式生物在體型、繁殖能力、成本上的優(yōu)勢，以及血管可視性佳、遺傳序列與人類高度相近、藥物篩選便捷等特點(diǎn)，為卒中領(lǐng)域研究者在模型構(gòu)建與模式生物的選用上提供了參考。