靶向甲型流感病毒血凝素的人源單克隆抗體研究進(jìn)展

王春穎，李延柏，尹 哲，霍珊珊,3，于 飛,3

（1. 保定市婦幼保健院，河北 保定 071066；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北省人畜共患病原微生物分析與防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071001）

呼吸道病毒始終是威脅人類健康的最主要元兇之一，給公共衛(wèi)生帶來巨大挑戰(zhàn)。2019 年底爆發(fā)的新型冠狀肺炎（COVID-19）已經(jīng)造成全世界范圍內(nèi)5.2 億人感染，約630 萬的人死亡，引發(fā)巨大的人員經(jīng)濟(jì)損失，目前感染人數(shù)和死亡人數(shù)仍在增加［1］。除此之外，具有高致病性和感染性的流感病毒（Influenza virus，IV）同樣引人注目，其中就包括流感的大流行，季節(jié)性流感以及禽流感的跨種傳播［2］。雖然國家和政府每年都提倡按時(shí)接種相應(yīng)年份的疫苗，但是根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，流感季節(jié)性流行每年在全球依然可導(dǎo)致300 ～500 萬重癥病例，29 ～65 萬呼吸道疾病相關(guān)死亡［3］。上個(gè)世紀(jì)以來，IV 經(jīng)歷了4 次大流行，包括1918 年的H1N1，1957—1958 年的H2N2，1968 年的H3N2，以及2009 年的H1N1，均造成了大量的人員死亡［4］。除此外，高致病性禽流感病毒H5N1 和H7N9 在人類中的爆發(fā)以及H5N6 和H5N8 的跨物種傳播同樣不容忽視［5-8］。

IV 屬于正粘病毒科，根據(jù)其核蛋白和基質(zhì)蛋白抗原的不同分為甲、乙、丙、丁4 種類型［1-9］。其中甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）的致病性最強(qiáng)，其RNA 具有8 個(gè)片段，負(fù)責(zé)編碼病毒的各個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)［10］。IAV 表面存在2 種糖蛋白，血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。根據(jù)序列比較和結(jié)構(gòu)特征的差異，HA 的18 種亞型分為2 組，I 組包括H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17、H18，II組 包 括H3、H4、H7、H10、H14、H15［11］。成 熟的HA 分為Head（HA1）和Stalk（HA1/HA2）2 部分，通過二硫鍵連接［12］。前者幫助病毒識別宿主表面的唾液酸受體，后者在低pH 的介導(dǎo)下促進(jìn)病毒膜與宿主膜的融合釋放病毒基因組［11］。鑒于HA 在病毒侵染過程中發(fā)揮的重要作用，常被作為單克隆抗體藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。

單克隆抗體藥物是近年來藥物研究的熱點(diǎn)方向，這主要源于它的高親和活性和生物活性，但還沒有針對IAV HA 的抗體藥物獲得上市批準(zhǔn)。因此，本文就目前靶向IAV HA 的單克隆抗體研究進(jìn)行綜述，旨在為抗IV 藥物的研發(fā)提供新的思路。

1 靶向Head 的抗體

1.1 靶向受體結(jié)合區(qū)

由于受體結(jié)合區(qū)（Receptor binding domain，RBD）的特殊功能性，位于HA Head 的RBD 相對保守，其主要包含130 環(huán)、150 環(huán)、190 螺旋以及220 環(huán)，因此，RBD 常作為單克隆抗體的識別位點(diǎn)，并通過與唾液酸的競爭性結(jié)合抑制IV 的感染（圖1）。

CH65 是從分選的單個(gè)漿細(xì)胞中分離并通過重組重鏈和輕鏈得到的［13］，它模擬唾液酸，通過重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3（Heavy chains complementary determining region，HCDR3） 與H1 Head 的RBD結(jié)合，可中和30 種H1N1 病毒，有效抑制濃度低至0.012 μg/mL（表1）［13］。CH67、641 I-9、H2526和5J8 是與CH65 相似的幾種單抗，它們從不同方向利用HDCR3 上的一個(gè)關(guān)鍵二肽與H1 RBD 結(jié)合，能夠有效抑制病毒（表1）［14］。Xu 等從人的外周血中分離到3 個(gè)H2N2 特異性單抗8F8、8M2 和2G1。其中8F8 通過HCDR3 上的Tyr100 與RBD 結(jié)合，8M2 和2G1 通 過HCDR2 上 的Phe54 與RBD結(jié)合，并以空間位阻的方式阻止病毒與唾液酸結(jié)合（表1）［15］。L4A-14、L3A-44 和L4B-18 是從感染H7N9 志愿者體內(nèi)分離得到的，對多種H7 均具有中和活性。晶體結(jié)構(gòu)表明，L4A-14 靶向HA 的RBD 區(qū) 域，而L3A-44 和L4B-18 識 別RBD 外 周的氨基酸殘基［16］。在體內(nèi)預(yù)防試驗(yàn)中，20 mg/kg的L4A-14 能夠100%保護(hù)小鼠，且體重恢復(fù)相對較快，而L3A-44 則需要30 mg/kg 的劑量才能提供完全保護(hù)，L4B-18 不能幫助小鼠抵抗致命性的感染。除了預(yù)防效果以外，L4A-14 和L3A-44 同樣能夠起到較好的治療效果（表1）［16］。

1.2 靶向抗原位點(diǎn)

IV 感染或疫苗接種產(chǎn)生的中和抗體通常靶向位于HA-Head 上的抗原。目前已經(jīng)對H1-和H3-Head 上 的5 個(gè) 抗 原 位 點(diǎn) 進(jìn) 行 了 鑒 定：Sa、Sb、Ca1、Ca2 和Cb，或A 到E 位點(diǎn)（圖1）。

圖1 針對流感病毒HA 的單克隆抗體表位概述Fig. 1 Overview of monoclonal antibody epitopes against influenza virus HA

從利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的抗體庫中篩選出具有廣泛交叉反應(yīng)活性的單抗F045-092 和F026-427［17］。這些靶向HA-Head 的單抗可以通過抑制HA 與唾液酸的結(jié)合來中和多種亞型，包括H1、H2、H3 和H5，此外，F(xiàn)045-092 與H1 結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)顯示：結(jié)合位點(diǎn)位于抗原A 和B 附近（表1）［17］。F005-126 從噬菌體展示庫中分離得到，能廣泛中和H3N2 病毒［18］。F005-126 的表位穿過了2 個(gè)HA單體的裂縫，其中一個(gè)對應(yīng)于Ca1 位點(diǎn)的多肽在H3亞型中相對保守，只有少量氨基酸差異，可以通過抑制低pH 誘導(dǎo)的HA 介導(dǎo)的膜融合來中和H3N2 病毒（表1）［18］。

D1-8 是來自于人B 細(xì)胞的一種獨(dú)特的單抗，它靶向H3-Head 抗原位點(diǎn)Ca2 近端新保守的表位［19］。D1-8 對H3 病毒具有廣泛的中和活性。此外，在劑量依賴的方式下，D1-8 被證明比奧司他韋治療感染小鼠更有效（表1）［19］。FLD194 對H5N1 亞型高致病性禽流感病毒具有較強(qiáng)的抑制作用，IC90低至0.007 μg/mL［20］。在感染前注射2.5 和7.5 mg/kg 的FLD194，能夠分別保護(hù)感染致死劑量的H5N1 的小鼠和雪貂，從而降低肺部病毒滴度。FLD194 通過5個(gè)CDRs 與多個(gè)抗原位點(diǎn)結(jié)合，并利用Fc 片段阻斷HA 與唾液酸的結(jié)合抑制病毒（表1）［20］。Nogales等從接種疫苗的志愿者外周血細(xì)胞中分離出單抗KPF1，該單抗識別抗原位點(diǎn)Ca 和Cb 之間高度保守的氨基酸（表1），具有廣泛中和H1 株的活性［21］。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，1 或10 mg/kg 的KPF1 可保護(hù)小鼠免受H1 病毒的致死劑量感染［21］。隨后，研究小組利用煙草表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)KPF1，它與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的KPF1 在中和H1N1 毒株時(shí)具有相同的活性，劑量低至0.271 μg/mL［22］。20 mg/kg 煙草表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的KPF1 既能預(yù)防感染，又能治療感染H1N1 病毒的豚鼠，防止病毒傳播［22］。這是首次報(bào)道植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的抗IAV 人源單抗在體外和體內(nèi)均具有活性，為產(chǎn)生新的單抗提供了一種新的免疫療法（表1）。

1.3 其他

通過篩選H7N9 康復(fù)患者的噬菌體抗體庫，獲得2 種 單 克 隆 抗 體HNIgGA6 和HNIgGB5［23］。186V 和226L 2 個(gè)氨基酸是2 種單抗識別H7 HA 的關(guān)鍵，對H7N9 具有高的中和活性，且呈劑量依賴性［23］。在HA 抑制試驗(yàn)中，HNIgGA6 和HNIgGB5的有效抑制濃度分別為0.8 μg/mL 和1.6 μg/mL。此外，HNIgGA6 和HNIgGB5 能有效治療感染致死劑量H7N9 的BALB/c 小鼠（圖1，表1）［23］。

在酸性pH 條件下，單抗M826 與H7N9 HA 具有納摩爾以下的親和力［24］。晶體結(jié)構(gòu)表明，低pH誘導(dǎo)HA 三聚體的構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，M826 的結(jié)合位點(diǎn)能夠完全暴露，并且，該位點(diǎn)是H7 HA 中存在的一個(gè)獨(dú)特的表位［24］。該抗體通過介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（Antibody-dependent cellmediated cytotoxicity，ADCC）的方式保護(hù)BALB/c小鼠免受致死劑量H7N9 的攻擊（表1）［24］。

單抗FluA-20 能識別幾乎所有IAVs 亞型的Head 區(qū)域，其中和活性為5-142 ng/mL［25］。與其他單克隆抗體不同的是，F(xiàn)luA-20 靶向于HA 三聚體界面的一個(gè)新位點(diǎn)，該位點(diǎn)與RBD 相鄰，但不重疊，并且在不同的IAV 亞型中高度保守［25］。該位點(diǎn)以前被認(rèn)為是穩(wěn)定的，且抗體無法進(jìn)入。FluA-20 通過與三聚體界面的短暫接觸破壞HA 的三聚體結(jié)構(gòu)，從而抑制病毒傳播［25］。試驗(yàn)證明，10 mg/kg的單抗可保護(hù)小鼠免受亞致死和致死劑量H1N1、H3N2、H5N1 和H7N9 毒 株 的 感 染［25］。之 后，Turner 等報(bào)道了1 種類似的H7 特異性單抗H7.5，其識別位點(diǎn)位于早期的HA-Head［26］。只要很少的接觸，就可以誘導(dǎo)HA 的三聚體解離，防止HA 完全暴露在唾液酸中，從而阻止病毒融合（表1）［26］。H7-200 是識別H7-HA1 的特異性單克隆抗體，作用機(jī)制與FluA-20 相似，通過作用于HA 三聚體的內(nèi)部界面，從而促使HA 的三聚體構(gòu)象發(fā)生解離［27］。與FluA-20 相比，H7-200 具有更高的親和活性，同時(shí)，它還存在結(jié)合H15 HA 的能力。體內(nèi)預(yù)防實(shí)驗(yàn)顯示，H7-200 能有效保護(hù)感染H7N9 的小鼠并降低臨床癥狀（表1）［27］。

表1 靶向HA-Head 的單克隆抗體Table 1 Monoclonal antibodies targeting HA-Head

2 靶向Stalk 的抗體

2.1 VH1-69 基因編碼的單克隆抗體

VH1-69 基因是人類唯一編碼HCDR2 環(huán)末端2個(gè)疏水殘基的重鏈基因，VH1-69 類單克隆抗體可以通過自身的重鏈識別Stalk 上的疏水溝槽結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抑制作用［28-29］。目前，多種VH1-69 基因編碼的單克隆抗體被報(bào)道，這些抗體通常能夠針對HA 的多種亞型，具有高度的廣譜性（圖1）［28-30］。

CR6261 單抗是從接種流感疫苗的志愿者記憶B細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體庫中分離出來的［31-32］，該單抗對H1、H3、H5、H6、H8、H9 亞型具有中和活性，其濃度范圍是0.12 ～50 μg/mL［31］。CR6261 的作用機(jī)制是結(jié)合HA-Stalk 的保守疏水口袋［31-33］。此外，5 mg/kg 的單抗可以保護(hù)小鼠免受H5N1 和H1N1 病毒的致命攻擊（表2）［31］。此外，另外一種具有廣譜中和活性的單抗CR8020 也被篩選出來，該單抗能夠中和H1、H3、H4、H5、H7、H9 和H10 亞型的流感病毒，其活性低至1.1 μg/mL［34］。晶體結(jié)構(gòu)表明，CR8020 識別了靠近病毒膜的HA-Stalk 高度保守的位點(diǎn)［34］。在體內(nèi)，3 mg/kg 的CR8020 能有效預(yù)防和保護(hù)致死劑量H3N2 和H7N7 的小鼠感染（表2）［34］。CR8043 通過不同的殘基和角度作用于CR8020 相似的表位，在體外與H3 和H10 具有較高的親和力［35］，高于3 mg/kg 劑量的CR8043 可保護(hù)小鼠免受H3N2 和H7N7 感染（表2）［35］。單抗F10 可以中和所有的I 組IAVs，包括H5N1，它通過結(jié)合HA-Stalk 的保守的疏水槽來阻止病毒膜與核內(nèi)體膜的融合［36］，10 mg/kg 的F10 可預(yù)防感染并治療H5N1 感染小鼠（表2）［36］。CR9114 是從接種過季節(jié)性流感疫苗的志愿者的B 細(xì)胞組合展示庫中分離得到的［33］，它通過結(jié)合HA-Stalk 高度保守的位點(diǎn)，阻斷pH 誘導(dǎo)的HA 與膜融合相關(guān)的構(gòu)象變化［33］。CR9114 與H1、H3、H7、H9 和IBV HA具有良好的交叉反應(yīng)性。研究表明高于1.7 mg/kg劑量的單抗CR9114 可以保護(hù)小鼠免受幾種不同亞型IAVs 的致命攻擊（表2）［33］。SUN 等從感染H5N1 的患者體內(nèi)分離出了2 種廣泛中和抗體2-12D5 和3-37G7.1，對試驗(yàn)測試的H1、H5 和H6均有較好的中和活性和ADCC 活性。其中2-12D5由VH1-69 編碼，3-37G7.1 由VH1-2 編碼，它們靶向與CR6261 相似的位點(diǎn)，位于HA2 上的氨基酸殘基I45 是關(guān)鍵的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)（表2）［37］。

單抗27F3 經(jīng)噬菌體展示庫分離得到，它主要通過HCDR2 結(jié)合HA-Stalk 的疏水槽，HCDR1 與HA2 形成2 個(gè)氫鍵，其有效抑制濃度為0.008 ～4.8 μg/mL，可廣泛識別I 組和II 組的IAVs 亞型（表2）［30］。從人外周血漿細(xì)胞中分離出一種廣泛中和的單抗FI6［38］，該單抗可識別16 種亞型（H1-16）的HA，并中和I 組和II 組的IAVs［38］。X 射線晶體學(xué)分析表明，F(xiàn)I6 的HCDR3 環(huán)結(jié)合在HA-Stalk的融合肽子域的一個(gè)保守位點(diǎn)上［38］。4 和15 mg/kg的FI6 分別能預(yù)防和治療感染H1N1 的BALB/c 小鼠，另有試驗(yàn)表明，該單抗能保護(hù)雪貂抵抗高致病性禽流感H5N1（表2）［38］。從噬菌體展示庫中分離出的單抗3.1 能有效中和H1、H2、H5、H6 亞型IAVs［39］，該單抗由VH3-30 編碼，并通過HCDR1 和HCDR3環(huán)與疏水溝槽結(jié)合［39］。單次注射10 mg/kg 的單抗3.1 可提供完全的保護(hù)并防止體重下降（表2）［39］。CT149 是從2009 年H1N1 大流行患者體內(nèi)分離出來的一種具有廣泛中和活性的單抗［40］。晶體結(jié)構(gòu)表明，CT149 的表位位于Stalk 融合肽中，它通過抑制低pH 誘導(dǎo)的HA 介導(dǎo)的膜融合過程，能夠中和I 組和II 組（H1、H2、H3、H7、H9）中所有測試的IAVs［40］。此外，它還可以介導(dǎo)ADCC 和CDC 促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡［40］。在體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)中，該單抗對感染多種IAVs 亞型的小鼠提供有效保護(hù)（表2）［40］。

2.2 其他基因編碼的單克隆抗體

從接種H1N1 流感疫苗的志愿者血漿細(xì)胞中分離到3 株單克隆抗體，分別為05-2G02、09-2A06和09-3A01，經(jīng)競爭性ELISA 和序列同源性分析證明，抗體與HA-Stalk 結(jié)合［41］。這3 種單抗均能中和所有檢測到的H1N1 毒株，其中05-2G02 對H3N2 和H5N1 也有廣泛的中和活性（表2）［41］。同樣，Nakamura 等［42］分離出39.29 和81.39 2 個(gè)單抗，可以中和H1、H2 和H3 亞型, 抑制活性分別為1.3 ～45.1 nmol 和0.65 ～26.3 nmol。晶體結(jié)構(gòu)表明，39.29 的表位位于HA2 螺旋A 的頂部［42］。競爭ELISA 結(jié) 果 顯 示，81.39 與39.29 在H3 Stalk 上的位點(diǎn)存在重疊［42］。與奧司他韋相比，45 mg/kg的39.29 對H1N1 和H3N2 病毒感染的小鼠和雪貂的治療效果更好。此外，39.29 與奧司他韋聯(lián)合使用具有協(xié)同作用（表2）［42］。在II 期臨床試驗(yàn)中，雖然39.29（MHAA4549A）被證明具有良好的耐受性，并顯著降低了流感相關(guān)癥狀，但在二期臨床評估后，終止了單抗和奧司他韋聯(lián)合治療住院的嚴(yán)重流感患者的相關(guān)實(shí)驗(yàn)［43-44］。單抗81.39a 是親本81.39 的衍生物，可有效中和16 個(gè)亞型，活性濃度為0.01 ～4.9 μg/mL［45］。在小鼠模型中，用15 或45 mg/kg 的81.39a 單次注射治療感染H5Nx、H6N1 或H7N9 病毒的小鼠，證明其能抑制病毒復(fù)制和阻止體重減輕［45］。此外，25 mg/kg 的81.39a 可有效降低H1N1感染雪貂的病毒滴度，減輕肺部病變（表2）［45］。

VIS410 靶向HA-Stalk，可廣泛中和H1、H3 和H5 亞型，抑制活性為0.3 ～11 μg/mL［46］。在體內(nèi)試驗(yàn)中，VIS410 能夠有效保護(hù)感染H3N2 和H7N9的BALB/c小鼠，且與奧司他韋聯(lián)用具有協(xié)同作用（表2）［46］。之后的臨床試驗(yàn)旨在評價(jià)使用VIS410 治療是否會降低高危人群的發(fā)病率，減少嚴(yán)重疾病的發(fā)生，并建立了流行微觀模擬模型［47］。結(jié)果表明，VIS410 總體上是安全的，具有降低疾病發(fā)生率的潛力，可大大降低65 歲以上人群的住院率，可推薦作為治療或預(yù)防IAVs 的藥物［47］。近期，又在非住院感染IAVs 患者中評估了VIS410 的安全性和耐受性，證明了該單抗能夠有效緩解癥狀，抑制病毒復(fù)制［48］。這為開發(fā)治療和預(yù)防嚴(yán)重流感感染的疫苗提供了有力支持［48］。

MEDI8852 是一種廣譜性人源單抗，可有效對抗所有HA 亞型IAVs, 抑制活性為0.41～4.05 μg/mL［49］。它是通過將CDRs 中的低頻突變位點(diǎn)與框架中不必要的體細(xì)胞恢復(fù)突變相結(jié)合來優(yōu)化供體記憶B 細(xì)胞FY1 的效力、廣度和低體細(xì)胞突變而產(chǎn)生的［49-50］。MEDI8852 通過CDRs 與融合區(qū)域的疏水槽和大部分融合肽結(jié)合［49］。與其他單克隆抗體相比，它具有更高的抗體中和廣度和效價(jià)，在小鼠和雪貂模型中，25 mg/kg 的MEDI8852 治療效果優(yōu)于奧司他韋（表2）［49-51］。然而，在隨后的臨床試驗(yàn)中，MEDI8852 產(chǎn)生了不良反應(yīng)，而與奧司他韋聯(lián)合用藥治療單一流感的研究由于受試者人數(shù)較少，無法證實(shí)有效的臨床意義。因此，沒有進(jìn)入II 期試驗(yàn)［52-53］。

表2 靶向HA-Stalk 的單克隆抗體Table 2 Monoclonal antibodies targeting HA-Stalk

3 討論和展望

IBV 與IAV 共同構(gòu)成了流感的季節(jié)性流行，其主要在兒童和老人等群體之間傳播。為了更好的預(yù)防流感，可以通過建立足夠大的抗體庫，提高篩選更具廣譜性的單克隆抗體的可能性。同時(shí)為預(yù)防交叉感染，降低IV 的影響力，研究靶向IBV 的單克隆抗體也是具有重要意義的。在IBV RBD 和Stalk 之間的殘留酯酶結(jié)構(gòu)域相對保守，可以作為單抗識別位點(diǎn)［33］。有研究證明，CR8071 與該位點(diǎn)結(jié)合，保護(hù)感染Victoria 和Yamagata 2 種譜系的IBVs 的小鼠接受致死劑量的挑戰(zhàn)，盡管效力較小，但已經(jīng)為后續(xù)更多針對IBVs 特異性抗體的研發(fā)提供了范例［33］。

目前，研發(fā)利用中和活性抑制IV 的單克隆抗體是抗體藥物研究的主要方向，但也可以同時(shí)開發(fā)具有其他作用機(jī)制的抗體，例如通過介導(dǎo)ADCC 發(fā)揮作用，目前有多種單克隆抗體可以實(shí)現(xiàn)這一功能。如Yu 等開發(fā)的M826，它通過介導(dǎo)ADCC 保護(hù)感染H7 IAV 的小鼠正常存活［24］；靶向IBV 的特異性單抗46B8 和C12G6 同樣可以介導(dǎo)ADCC［54-55］。

在通常情況下，單一抗體所結(jié)合的流感亞型通常是有限的，多種單克隆抗體的綜合使用可能會提高藥物的治療效率。例如CR8020 與CR6261 識別位點(diǎn)不同，但2 種單抗協(xié)同治療能夠中和大多數(shù)IAV 亞型［34］。

綜上所述，應(yīng)用能中和多種亞型的人單抗是預(yù)防和治療流感最有效的方法，也是未來研究的一個(gè)主要方向。然而，由于HA 的抗原漂移，單抗治療往往不能達(dá)到預(yù)期的效果。這就需要進(jìn)一步探索HA 上保守位點(diǎn)及其作用機(jī)制。