芪板青顆粒體外抗PRRSV 效果研究

劉 斌，張 帥，劉濮毓，趙云環(huán)，王榮申，范京惠，左玉柱

（1.河北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院/河北省獸醫(yī)生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001；2.石家莊市動物疫病預防控制中心，河北 石家莊 050000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種烈性傳染病。臨床癥狀多表現為不同年齡段豬出血、發(fā)熱以及呼吸道癥狀和懷孕母豬流產、死胎、產弱胎等為特征的繁殖障礙，因部分感染豬會出現耳尖、尾尖、乳頭、四肢末端或皮膚發(fā)紺，故又稱“豬藍耳病”［1-2］。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大以及養(yǎng)豬業(yè)的迅速發(fā)展，PRRS 的發(fā)病率日益增加。當前，我國防控PRRS 以接種疫苗為主，但由于PRRSV 的高變異率導致高致病性毒株（HP-PRRSV）、NADC30-like PRRSV 以及重組毒株的出現，使得PRRSV 流行毒株呈現多樣性和復雜性，防控PRRS 的難度越來越大，嚴重影響了中國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展［3-5］。

中藥為純天然物質，可在不傷害機體的前提下抑制病毒復制，對機體毒副作用小［6］。PRRSV 的主要感染機制是在豬肺泡巨噬細胞上增殖并對肺泡巨噬細胞造成嚴重破壞，引發(fā)豬發(fā)熱等炎癥反應，以及呼吸困難等呼吸道癥狀，并通過免疫抑制機制誘導其他疫病發(fā)生［7］。從中醫(yī)角度來講，豬感染PRRSV 是外邪入侵、免疫低下所致，因其外部濕氣不斷積聚體內，導致肺氣不宣，進而陰陽失調，發(fā)生該?。?］。因此，中醫(yī)上以“增免解毒”、“清熱燥濕”、“補益肺衛(wèi)”作為主要對策，做到標本兼治。同時，在減抗替抗的大環(huán)境下，中藥處方防控PRRS 成為了重要發(fā)展方向。黃芪具有益氣固表、斂汗固脫、脫毒排膿、扶正祛邪等功效［9］；板藍根和大青葉具有清熱解毒、涼血利咽、抗菌、抗病毒、抗內毒素、增強機體免疫力的功效［10］；蒲公英和金銀花具有抗菌抗炎、保肝利膽、增強免疫力等功效［11］；甘草具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝等多重功效［12］。為了有效防治豬繁殖與呼吸綜合征，減少PRRS 對養(yǎng)豬業(yè)的損失，降低PRRS 發(fā)病率，檢驗以黃芪、板藍根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草為主要成分的芪板青顆?？筆RRSV 的效果，本試驗通過用芪板青顆粒水溶液作用于接種PRRSV的Marc-145 細胞，觀察其對PRRSV 的抵抗作用，以期為防治PRRS 提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑 芪板青顆粒（生產批號：21112204），購自河北征宇制藥有限公司，主要成分：黃芪、板藍根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草；胎牛血清（生產批號：12A288），購自上海依科賽生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液（生產批號：12100），購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 毒株與細胞株 PRRSV、Marc-145 細胞均由河北農業(yè)大學動物醫(yī)學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 芪板青顆粒安全濃度的測定 將Marc-145細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長成致密單層后，棄上清。用DMEM 維持液將芪板青顆粒進行溶解稀釋，再進行2 倍倍比稀釋，稀釋終濃度分別為100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0、6 250.0、3 125.0、1 562.5、781.3、390.6 和195.3 mg/L，共10 個稀釋濃度。將各稀釋濃度芪板青溶液分別加到已長有單層Marc-145 細胞的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個稀釋度重復6 孔。另以病毒液接種細胞和DMEM 維持液加到細胞中分別作陽性對照和陰性對照，置于37 ℃ CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況，根據細胞病變情況確定芪板青顆粒對Marc-145 細胞的毒性，以不出現細胞病變的最大芪板青溶液濃度為最大安全濃度。

1.2.2 PRRSV 標準毒株半數感染量（TCID50）的測定 將Marc-145 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長成致密單層后，棄上清。用DMEM 維持液將PRRSV 標準毒株進行10 倍倍比稀釋成6 個濃度，將各稀釋濃度PRRSV 病毒液加到已長有單層Marc-145 細胞的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個稀釋濃度重復6 孔。另以DMEM 維持液加到已長有單層Marc-145 細胞的培養(yǎng)板作陰性對照，置于37 ℃ CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h 后用倒置顯微鏡觀察細胞病變情況，記錄病變孔數，根據Reed-Muench 公式，計算PRRSV 的TCID50。

1.2.3 細胞病變判斷標準 以“+”表示細胞病變的百分數，即0%～25%為（+），26%～50%為（++），51%～75%為（+++），76%～100%為（++++），陰性對照表示為（-）。

1.2.4 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的抑制作用測定 將Marc-145 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長成致密單層后，棄上清。將100×TCID50PRRSV 病毒液接種于已長有單層Marc-145細胞的96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后棄掉上清。將1.2.1 中測定的芪板青溶液從最大安全濃度開始，倍比稀釋成10 個濃度，分別加到接種了PRRSV 病毒液的96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個稀釋濃度重復4 孔。另以病毒液接種細胞和DMEM 維持液加到細胞中分別作陽性對照和陰性對照。置于37 ℃ CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況。

1.2.5 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的殺滅作用測定 將Marc-145 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長成致密單層后，棄上清。將200×TCID50PRRSV 病毒液與從最大安全濃度開始進行的2 倍倍比稀釋成10 個濃度的芪板青溶液等量混合，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后，加入有單層Marc-145 細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，重復4 孔。另以病毒液接種細胞和DMEM 維持液加到細胞中分別作陽性對照和陰性對照。置于37 ℃ CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況。

1.2.6 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的阻斷作用測定 將Marc-145 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，待其生長成致密單層后，棄上清。將1.2.1 中測定的芪板青溶液從最大安全濃度開始，2 倍倍比稀釋成10 個濃度，分別加入有單層Marc-145 細胞的96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用2 h 后棄掉上清。將100×TCID50PRRSV病毒液接種于已吸附芪板青溶液的96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個稀釋濃度重復4 孔。另以病毒液接種細胞和DMEM 維持液加到細胞中分別作陽性對照和陰性對照。置于37 ℃ CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況。

2 結果與分析

2.1 芪板青顆粒安全濃度的測定結果

將10 個稀釋濃度的芪板青溶液加到已長有單層Marc-145 細胞的培養(yǎng)板中，經連續(xù)4 d 觀察后發(fā)現，當濃度為100 000.0、50 000.0、25 000.0、12 500.0 和6 250.0 mg/L 時，細胞均出現不同程度的脫落，細胞單層被破壞，隨著芪板青溶液濃度逐漸降低，細胞病變逐漸減少，直到濃度為3 125 mg/L 時開始，細胞未出現病變（圖1），因此，芪板青溶液最大安全濃度為3 125 mg/L。

圖1 不同稀釋濃度芪板青溶液下細胞生長情況（200×）Fig.1 Cell growth under different dilution concentration of Qibanqing solution(200×)

2.2 PRRSV 標準毒株半數感染量（TCID50）的測定結果

將經10 倍倍比稀釋后的PRRSV 病毒液加到已長有單層Marc-145 細胞的培養(yǎng)板中，經72 h 培養(yǎng)后，用倒置顯微鏡觀察結果如表1 所示，在病毒液稀釋度為10-5～10-1時，Marc-145 細胞出現不同程度的病變，隨著稀釋度增加細胞病變孔數降低，在病毒液稀釋度為10-6時，Marc-145 細胞不再出現病變。根據Reed-Muench 公式，計算PRRSV 的TCID50值為10-2.9/0.1 mL。

表1 不同病毒液稀釋度細胞病變統計結果Table 1 Statistical analysis of cytopathic changes in different dilution levels of disease venom

2.3 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的抑制作用測定結果

經連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況，記錄不同芪板青溶液稀釋濃度下產生的細胞病變情況如表2 所示，可以看出芪板青溶液在細胞水平上對PRRSV有抑制作用，在其濃度為3 125.0 和1 562.5 mg/L時，細胞病變百分數均不到25%；隨著藥物濃度降低，芪板青溶液對PRRSV 的抑制作用逐漸降低，在濃度24.4 ～781.3 mg/L 時，細胞病變百分數為26%～50%；在藥物濃度為12.2 和6.1 mg/L 時，雖然細胞病變百分數到了51%～75%，但與只接PRRSV 病毒液的陽性細胞對照相比，仍表現出了抑制作用。

2.4 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的殺滅作用測定結果

經連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況，記錄各試驗孔與對照孔細胞生長情況如表3 所示，在芪板青溶液濃度195.3 ～3 125.0 mg/L 時，均表現出較強的殺滅作用，細胞病變均低于25%，從芪板青溶液濃度為97.6 mg/L 開始，殺滅作用逐漸降低，但和只接PRRSV 病毒液的陽性細胞對照相比，仍表現出了殺滅作用；同時和2.3 中抑制作用結果相比，殺滅作用優(yōu)于抑制作用。

表3 芪板青顆粒對PRRSV 的殺滅作用細胞病變統計結果Table 3 Cytopathic statistics of Qibanqing granules against PRRSV

2.5 芪板青顆粒在細胞水平上對PRRSV 的阻斷作用測定結果

經連續(xù)4 d 觀察細胞病變情況，記錄各細胞孔結果如表4 所示，芪板青溶液濃度在24.4 ～ 3 125.0 mg/L 范圍內對PRRSV 具有阻斷作用，在濃度低于12.2 mg/L 時對PRRSV 無阻斷作用，整體來看，芪板青溶液對PRRSV 的阻斷作用低于抑制作用和殺滅作用。

表4 芪板青顆粒對PRRSV 的阻斷作用細胞病變統計Table 4 Cytopathic statistics of the blocking effects of Qibanqing granules on PRRSV

3 討論與結論

PRRS 是影響?zhàn)B豬行業(yè)最嚴重的疫病之一，由于極高的發(fā)病率給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。PRRS 屬外感溫熱病范疇，臨床發(fā)病豬主要表現為持續(xù)發(fā)熱、全身發(fā)紅、耳朵發(fā)紺、鼻孔出血、懷孕母豬流產等，中醫(yī)防治則以“增免解毒”、“清熱燥濕”、“補益肺衛(wèi)”中藥為主［13］。因此本試驗采用以黃芪、板藍根、金銀花、蒲公英、大青葉、甘草為主要成分的芪板青顆粒復方進行體外抗PRRSV 研究，旨在篩選有效抗PRRSV 中藥，為臨床應用提供參考依據。

PRRSV 的主要感染機制是侵染豬肺泡巨噬細胞，引起豬發(fā)熱、炎癥反應以及呼吸道癥狀［7］；同時通過破壞母豬血管內皮細胞導致胎兒無法從母體得到充足的氧氣和營養(yǎng)，從而變成木乃伊胎等死胎，存活下的仔豬又通過胎盤感染PRRSV 患?。?4-15］；還通過免疫抑制作用致使機體抵抗力下降，誘發(fā)其他疾病［16］。黃芪可補氣升陽、利水消腫、提高機體免疫力；板藍根和大青葉可清熱解毒、涼血消腫、緩解患病豬呼吸道癥狀；蒲公英和金銀花具有宣散風熱、清解血毒、增強抵抗力的功效［17-18］。本試驗通過觀察細胞病變百分數來測定芪板青顆粒對PRRSV 的抑制、殺滅和阻斷作用，發(fā)現在芪板青顆粒濃度24.4 ～3 125.0 mg/L 時，對PRRSV 有顯著的抑制作用，可將細胞病變抑制到50%以下，芪板青顆粒在24.4 ～3 125.0 mg/L 時，同樣能起到殺滅作用，但相對于抑制作用來說，殺滅作用可在195.3 ～3 125.0 mg/L時將PRRSV 殺滅到細胞病變低于25%，因此殺滅作用較強于抑制作用；在芪板青顆粒濃度97.6 ～3 125.0 mg/L 時，可起到顯著阻斷PRRSV 感染細胞作用，但效果略差于其抑制作用和殺滅作用。雖然對PRRSV 的抑制、殺滅、阻斷作用的測定均收到一定效果，但不能完全對PRRSV 抑制、殺滅和阻斷，可能由于芪板青顆粒對Marc-145 細胞的毒害作用較大，使得芪板青顆粒對于Marc-145 細胞的最大安全濃度為3 125.0 mg/L。

PRRSV 至今仍是全球養(yǎng)豬生產中最重要的病原體之一，毒株多樣化導致患病豬臨床表現多變和疫苗保護效力不佳，都給豬場的防治造成極大的困難［19］。本試驗測定結果顯示：芪板青顆粒對PRRSV 的防控有顯著效果，為芪板青顆粒防治PRRS 提供了依據。